水稻轉化方法

水稻轉化方法1．愈傷組織的誘導選取成熟良好、飽滿、無霉變的秈稻種子，用糙米機或人工方法去掉種子的內外粰，保留胚的完整性。先用75%酒精消毒1min，再浸泡于40%NaClO+0.1%Tween20溶液，并置于100rpm的搖床上消毒30min。在超凈工作臺上，消毒后的去粰種子用無菌水洗滌5次以上，洗凈后轉移至裝有無菌吸水紙的培養(yǎng)皿中吸干水分，再將去粰種子接種于誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為32°C，持續(xù)光照（100molem-2s-1）。30天后即可得到較好的愈傷組織用于轉化。2．農桿菌的準備農桿菌選用水稻轉化中常用的菌株Ag10。將含有目的基因的表達載體通過電激轉化法轉入農桿菌Ag10，選取陽性菌株，再將陽性菌株劃線于含合適抗生素的YEB固體平板培養(yǎng)基中，于28C暗培養(yǎng)3天。3天后，用接種針挑取米粒大小的農桿菌震蕩懸浮于裝有100mLAA浸染培養(yǎng)基的150mL滅菌三角瓶中，以此作為愈傷組織的農桿菌浸染液。特別值得注意的是，農桿菌應充分分散，而且濃度不能太大（OD=0.1），否則后續(xù)的脫菌效果不好。3．愈傷組織和農桿菌的共培養(yǎng)挑取誘導30天并且生長良好的愈傷組織（長出的水稻芽與種子去掉）浸泡于裝有100mL農桿菌浸染液的150mL滅菌三角瓶中（在加入愈傷前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的濃度為30mg/L），搖動5min。同時，在共培養(yǎng)基平板上預先墊1張無菌濾紙，用1mL的AAM浸染培養(yǎng)基打濕，并除去氣泡。然后將浸染5min后的愈傷組織用無菌濾紙吸干，置于墊了濾紙的共培養(yǎng)基上于25C黑暗培養(yǎng)3天。4．農桿菌的洗脫將共培養(yǎng)3天后的愈傷組織置于250mL錐形瓶中，先用無菌水洗滌4-5次，直至洗液清澈透明為止。加入過濾滅菌的400mg/L羧芐青霉素溶液適量，于搖床上100rpm震蕩洗滌25min。然后倒掉洗液，繼續(xù)用羧芐青霉素溶液洗愈傷3-5次，再加入適量羧芐青霉素溶液，于搖床上100rpm震蕩洗滌25min，然后倒掉洗液，繼續(xù)用羧芐青霉素溶液洗愈傷3-5次，最后用無菌濾紙將愈傷組織吸干。5．抗性愈傷組織的篩選首先將農桿菌洗脫后的愈傷組織置于篩選劑濃度為100mg/L的G418或50mg/L的HPT篩選培養(yǎng)基上，于32C和持續(xù)光照條件下篩選培養(yǎng)30天左右，將新長的愈傷繼代一次。6．抗性愈傷組織的分化將篩選2中新長質量較好的愈傷組織轉移至分化培養(yǎng)基上，于32°C和持續(xù)光照條件下進行分化培養(yǎng)20天左右，即可得到再生植株。7．再生植株的生根將再生植株移栽于不添加篩選劑的生根培養(yǎng)基中，于32C和持續(xù)光照條件下進行生根培養(yǎng)10天左右。8．煉苗和移栽將根生長良好的再生苗減掉苗的少部分,加入蒸餾水煉苗5天左右,洗去培養(yǎng)基，然后移栽于大田中。附表說明表1培養(yǎng)基種類及成分培養(yǎng)基種類成分誘導培養(yǎng)基NB無機鹽和有機物+水解酪蛋白0.6g/L+脯氨酸2.787g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖30.0g/L+植物凝激素4.2g/L+2,4-D3.0mg/L，pH5.8AAM浸染培養(yǎng)基AA無機鹽+MS有機物+水解酪蛋白0.5g/L+天冬酰胺0.3g/L+谷氨酰胺0.9g/L+精氨酸0.2g/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36.0g/L,pH5.2;使用前加入AS30mg/L。共培養(yǎng)基NB無機鹽和有機物+水解酪蛋白0.3g/L+蔗糖30.0g/L+葡萄糖10.0g/L+植物凝激素4.2g/L+2,4-D2.0mg/L,pH5.2；火菌后加入AS30mg/L。篩選培養(yǎng)基NB無機鹽和有機物+水解酪蛋白0.6g/L+脯氨酸2.787g/L+蔗糖30.0g/L++植物凝激素4.2g/L+2,4-D3.0mg/L,pH5.8；火菌后加入羧芐青霉素400mg/L+潮霉素50mg/L或G418 100mg/L。分化培養(yǎng)基MS無機鹽和有機物+水解酪蛋白2.0g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30.0g/L+山梨醇30.0g/L+植物凝激素4.2g/L+NAA0.2mg/L+KT2.0mg/LpH5.8；火

菌后加入羧芐青霉素200mg/L。生根培養(yǎng)基MS無機鹽和有機物+水解酪蛋白1.0g/L+蔗糖30.0g/L+植物凝激素4.2g/L+NAA0.2mg/L，pH5.8NB培養(yǎng)基（誘導、繼代）藥品1L500mLN大量（20X）650ml25mlB微量（200X）55ml2.5mlNB有機(200X)5ml2.5ml鐵鹽（100X）/200X10ml/5ml5ml/2.5ml銅鉆母液（1000X）1ml500ul2、4-D(0.2mg/ml)12.5ml6.25ml酸水解酪蛋白0.6g0.3g脯氨酸2.878g1.439g谷氨酰胺0.5g0.25g蔗糖30g15g調節(jié) PH6.0 加入瓊脂8g4g植物凝集素4.2g2g二.篩選培養(yǎng)基（滅菌倒板前，50°C左右加入）NB+Cb（羧芐200mg/ml） 500ml培養(yǎng)基加1ml使其終濃度達到400mg/LHYg（潮霉素50mg/ml）500ml培養(yǎng)基加500ul使其終濃度達到50mg/LG418（100mg/ml） 500mL培養(yǎng)基加500ul使其終濃度達到100mg/L三.YEB培養(yǎng)基藥品1L牛肉膏5g蛋白胨5g酵母提取物1g蔗糖5gMgSO?7HO4 20.5g(MgSO0.244g)4

四.AAM液體培養(yǎng)基配方藥品1L500mlAA大量（20X）50ml25mlAA微量（200X）5ml2.5mlAA有機（100X）10ml5mlAA銅鉆母液（200X）0.5ml0.25ml鐵鹽（100X）10ml5ml酸水解酪蛋白0.5g0.25g蔗糖68.5g34.5g葡萄糖36g18g谷氨酰胺（Glu）0.9g0.45g天冬酰胺（Asn）0.3g0.15g精氨酸（Arg）0.176g0.088g調PH值為5.8-5.9五.MS分化培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基配方試劑分化（L）生根（L）MS無機50ml50mlMS-B5微量1ml1mlMS有機5ml5ml鐵鹽5ml5mlMS-銅鉆母液1ml1mlNAA250ul250ul山梨醇30g不加水解酪蛋白2g1g蔗糖30g30g脯氨酸0.3g不加條PH6.0后加入植物凝集素4.2g滅菌后，倒板前加入：Cblml/lHyG400ul/lkana600ul/l（分化）生根培養(yǎng)基與誘導的濃度一樣六.ND-共培養(yǎng)基6 藥品1L500mLN大量（20X）650ml25mlB微量（200X）55ml2.5mlNB有機（200X）5ml2.5ml鐵鹽（100X）/200X10ml/5ml5ml/2.5ml

2、4-D(0.2mg/ml)5ml2.5ml酸水解酪蛋白0.3g0.15g葡萄糖10g5g蔗糖30g15g條PH5.3-5.4之后，加入植物凝集素4.5g2.25g滅菌后倒板前50°C左右加入AS（10mg/ml）,培養(yǎng)基500ul:250ul七.AAM母液的配制AAM大量（20X）g/lKCL60gNaHPO2HO2 4 23gMgSO7HO4 25g(無水MgSO2.44g)4CaCL2HO223g(無水CaCL2.27g)2AA有機（100X）g/l甘氨酸0.75gVB11gVB60.1g煙酸0.1g肌醇10gAA微量（200X）g/lMgSOHO4 21.52gHBO330.6gZnSO7HO4 20.4gFe-EDTA8gAA銅鉆母液（2000X）g/lKI1.5gNaMoO2HO4 20.5gCuSO5HO4 20.05gCocl6HO220.05gNB母液N大量(20X)g/l6KNO356.6g(NH)SO4 2 49.26gKHPO248g

MgSO7HO4 23,7g（無水MgSO1.8g）4Cacl7HO223.32g（無水Cacl2.49g）2NB有機（200X）g/l肌醇20g煙酸VB30.1gVB60.1gVB10.2g甘氨酸0.4gB微量（200X）g/l5MgSO4HO4 20.88gHBO330.32gZnSO7HO4 20.3gKI0.16g鐵鹽（100X）g/lFeSO7HO4 22.78gNaEDTA2HO223.73gNB銅鉆母液（1000X）g/lKI0.83gNaMoO2HO4 20.25gCuSO5HO4 20.025gCocl6HO220.025g分化母液MS無機（100X）g/l藥品（20X）g/l（100X）g/lKNO338g190gNHNO4 333g165gKHPO243.4g17gMgSO7HO4. 27.4g（無水MgSO43.61g） 437gCacl2HO228.8g（無水Cacl26.644g）44g

MS-B微量（1000X）g/l5MgSO4HO4 222.