分子醫(yī)學(xué)技能實驗課件：1口腔粘膜細(xì)胞基因組DNA制備

分子醫(yī)學(xué)技能實驗蔡俊超實驗一

口腔粘膜細(xì)胞基因組DNA制備分子醫(yī)學(xué)技能實驗蔡俊超caijch3ma1基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。是一般的基因工程實驗中DNA操作的最初步驟。

一、基因組DNA的提取與純化目的：基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜2核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級結(jié)構(gòu)完整排除其它分子的污染：細(xì)胞內(nèi)：蛋白質(zhì)、脂類、糖、RNA等提取過程中：有機(jī)熔劑、金屬離子、外源DNA

核酸分離純化的總原則：3細(xì)胞樣品的核酸提取的主要步驟破碎細(xì)胞去除細(xì)胞內(nèi)的其它分子：蛋白質(zhì)多糖脂類去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)細(xì)胞樣品的核酸提取的主要步驟4核酸提取注意事項減少化學(xué)因素對核酸的降解如過量酸堿減少物理因素對核酸的降解機(jī)械剪切力：強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融高溫防止核酸的生物降解核酸酶的預(yù)防

核酸提取注意事項減少化學(xué)因素對核酸的降解5二、人基因組DNA的制備

實驗?zāi)康募耙饬x：從人口腔上皮細(xì)胞中提取純的基因組DNA掌握基因組DNA抽提的方法，理解核酸分離純化的基本原理二、人基因組DNA的制備實驗?zāi)康募耙饬x：6分離純化基因組DNA的常用方法：不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，分離方法也有差異。主要根據(jù)不同細(xì)胞的特點而有區(qū)別，但原理相似，因此它們有共同的步驟：

裂解細(xì)胞：SDS裂解細(xì)胞，EDTA抑制核酸酶

除去蛋白質(zhì)：蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚和氯仿/異戊醇抽提、分離蛋白質(zhì)；析出DNA：乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。分離純化基因組DNA的常用方法：不同7實驗材料及試劑材料：人口腔上皮細(xì)胞試劑：抽提緩沖液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAase，SDS，蛋白酶K水飽和酚氯仿/異戊醇（V/V=24:1）70%乙醇、無水乙醇TE緩沖液：Tris，EDTA實驗材料及試劑材料：人口腔上皮細(xì)胞8主要試劑的功能抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成SDS的作用是裂解細(xì)胞EDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子，防止DNA酶對DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白質(zhì)。酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA主要試劑的功能抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成9取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3min，用15ml離心管（4000rpm

10min）收集細(xì)胞沉淀

（離心機(jī)的使用，平衡）

加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管①

（微量移液器的正確使用）混勻，65℃溫育30min

加入等體積的【飽和酚(~0.25ml)：氯仿/異戊醇(~0.25ml)】充分顛倒混勻（不要劇烈震蕩?。嶒灢襟E及注意事項（一人一組）：

取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3m1012000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管②

（高速離心機(jī)的使用與安全意識）

加入等體積【氯仿/異戊醇】，顛倒混勻12000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管③

加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻12000rpm10min

12000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管②11棄上清，沉淀中加入300l70%乙醇

12000rpm2min

輕輕棄去上清，打開EP蓋，待乙醇揮發(fā)干凈

加入30l0.1×TE溶液，充分混勻后檢測結(jié)果

棄上清，沉淀中加入300l70%乙醇12分子醫(yī)學(xué)實驗注意事項微量移液器的正確使用離心機(jī)的正確使用上課紀(jì)律撰寫實驗報告的規(guī)范分子醫(yī)學(xué)實驗注意事項微量移液器的正確使用13實驗結(jié)果及其分析

定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳apoB基因多態(tài)性分析下次實驗課進(jìn)行實驗結(jié)果及其分析定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳下次實驗課14常見問題：

1、提取的DNA不純原因？改進(jìn)的方法？2、提取的DNA成涂布狀原因？改進(jìn)的方法？3、沒有獲得足夠量的DNA改進(jìn)的方法？常見問題：1、提取的DNA不純15實驗報告格式實驗?zāi)康暮蛻?yīng)用價值實驗原理實驗基本流程和注意事項實驗結(jié)果和討論總結(jié)或感想完成兩部分的作業(yè)：課后作業(yè)，實驗報告實驗報告格式實驗?zāi)康暮蛻?yīng)用價值完成兩部分的作業(yè)：課后作業(yè)，實16ThankYou!ThankYou!17分子醫(yī)學(xué)技能實驗蔡俊超實驗一

口腔粘膜細(xì)胞基因組DNA制備分子醫(yī)學(xué)技能實驗蔡俊超caijch3ma18基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。是一般的基因工程實驗中DNA操作的最初步驟。

一、基因組DNA的提取與純化目的：基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜19核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級結(jié)構(gòu)完整排除其它分子的污染：細(xì)胞內(nèi)：蛋白質(zhì)、脂類、糖、RNA等提取過程中：有機(jī)熔劑、金屬離子、外源DNA

核酸分離純化的總原則：20細(xì)胞樣品的核酸提取的主要步驟破碎細(xì)胞去除細(xì)胞內(nèi)的其它分子：蛋白質(zhì)多糖脂類去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)細(xì)胞樣品的核酸提取的主要步驟21核酸提取注意事項減少化學(xué)因素對核酸的降解如過量酸堿減少物理因素對核酸的降解機(jī)械剪切力：強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融高溫防止核酸的生物降解核酸酶的預(yù)防

核酸提取注意事項減少化學(xué)因素對核酸的降解22二、人基因組DNA的制備

實驗?zāi)康募耙饬x：從人口腔上皮細(xì)胞中提取純的基因組DNA掌握基因組DNA抽提的方法，理解核酸分離純化的基本原理二、人基因組DNA的制備實驗?zāi)康募耙饬x：23分離純化基因組DNA的常用方法：不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，分離方法也有差異。主要根據(jù)不同細(xì)胞的特點而有區(qū)別，但原理相似，因此它們有共同的步驟：

裂解細(xì)胞：SDS裂解細(xì)胞，EDTA抑制核酸酶

除去蛋白質(zhì)：蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚和氯仿/異戊醇抽提、分離蛋白質(zhì)；析出DNA：乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。分離純化基因組DNA的常用方法：不同24實驗材料及試劑材料：人口腔上皮細(xì)胞試劑：抽提緩沖液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAase，SDS，蛋白酶K水飽和酚氯仿/異戊醇（V/V=24:1）70%乙醇、無水乙醇TE緩沖液：Tris，EDTA實驗材料及試劑材料：人口腔上皮細(xì)胞25主要試劑的功能抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成SDS的作用是裂解細(xì)胞EDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子，防止DNA酶對DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白質(zhì)。酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA主要試劑的功能抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成26取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3min，用15ml離心管（4000rpm

10min）收集細(xì)胞沉淀

（離心機(jī)的使用，平衡）

加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管①

（微量移液器的正確使用）混勻，65℃溫育30min

加入等體積的【飽和酚(~0.25ml)：氯仿/異戊醇(~0.25ml)】充分顛倒混勻（不要劇烈震蕩?。嶒灢襟E及注意事項（一人一組）：

取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3m2712000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管②

（高速離心機(jī)的使用與安全意識）

加入等體積【氯仿/異戊醇】，顛倒混勻12000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管③

加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻12000rpm10min

12000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管②28棄上清，沉淀中加入300l70%乙醇

12000rpm2min

輕輕棄去上清，打開EP蓋，待乙醇揮發(fā)干凈

加入30l0.1×TE溶液，充分混勻后檢測結(jié)果

棄上清，沉淀中加入300l70%乙醇29分子醫(yī)學(xué)實驗注意事項微量移液器的正確使用離心機(jī)的正確使用上課紀(jì)律撰寫實驗報告的規(guī)范分子醫(yī)學(xué)實驗注意事項微量移液器的正確使用30實驗結(jié)果及其分析

定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳apoB基因多態(tài)性分析下次實驗課進(jìn)行實驗結(jié)果及其分析定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳下次實驗課31常見問題：

1、提取的DNA不純