茶樹(shù)育種學(xué)第七章-生物技術(shù)在茶樹(shù)育種中的應(yīng)用課件

第七章：生物技術(shù)在茶樹(shù)育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計(jì)、構(gòu)建、培育具有預(yù)期性狀的新品種、新物種、新品系，以及與工程原理相結(jié)合，進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會(huì)提供商品和服務(wù)的綜合技術(shù)體系。目前用于茶樹(shù)育種的現(xiàn)代生物技術(shù)有組織培養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)繁殖技術(shù)、花粉（藥）培養(yǎng)和單倍體培育技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。第七章：生物技術(shù)在茶樹(shù)育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)1第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用（一）組織與器官培養(yǎng)的概念將離體的植物體各種結(jié)構(gòu)（如原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織、器官以及幼小植株）在無(wú)菌的人工環(huán)境中使其生長(zhǎng)發(fā)育，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。（二）組織與器官培養(yǎng)的類(lèi)型1、胚胎培育。指以胚及具有胚的器官作為外植體，在離體培養(yǎng)條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用22、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮組織等）作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。3、器官培養(yǎng)。指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。4、花粉與花藥培養(yǎng)。指用未成熟的花粉或花藥作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。5、細(xì)胞培養(yǎng)。指以能保持較好分散性的單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。6、原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細(xì)胞壁而獲得的原生質(zhì)體作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。2、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮3（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用1、擴(kuò)大變異范圍。2、克服遠(yuǎn)緣雜交的一些障礙。3、獲得體細(xì)胞雜種。4、倍性控制。5、快速無(wú)性繁殖。6、獲得脫毒苗。7、種質(zhì)資源的保存。8、作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用4二、培養(yǎng)的步驟與方法植物組織與器官培養(yǎng)的過(guò)程：無(wú)菌培養(yǎng)的建立→營(yíng)養(yǎng)繁殖體的增殖→再分化→試管苗移栽大田。（一）無(wú)菌培養(yǎng)的建立1、取材（外植體）。注意取材時(shí)間、部位、消毒等技術(shù)環(huán)節(jié)。⑴未成熟胚及相關(guān)材料的取材和滅菌。⑵莖尖及相關(guān)材料的取材。⑶葉片取材。注意消除多酚類(lèi)氧化而產(chǎn)生的褐變。二、培養(yǎng)的步驟與方法52、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)成分構(gòu)成，前者主要提供外植體發(fā)育所需的元素，后者主要是調(diào)節(jié)外植體的生長(zhǎng)發(fā)育。構(gòu)建培養(yǎng)基應(yīng)注意兩點(diǎn)：①必須保證外植體能夠生存。②盡可能使外植體較快生長(zhǎng)發(fā)育。最常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。（二）營(yíng)養(yǎng)繁殖體的增殖營(yíng)養(yǎng)繁殖體的增殖是指愈傷組織的增殖。外植體接種到培養(yǎng)基后，經(jīng)過(guò)脫分化作用，形成一團(tuán)分生細(xì)胞（愈傷組織），這團(tuán)細(xì)胞不斷分裂使?fàn)I養(yǎng)繁殖體增殖。2、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)成分構(gòu)成，前者主要提供6（三）再分化（通過(guò)調(diào)節(jié)激素種類(lèi)及比例）1、誘導(dǎo)腋芽發(fā)生。2、誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。3、誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生。4、誘導(dǎo)根的發(fā)生。5、幼苗的馴化鍛煉。（四）試管苗移栽大田。主要克服組織失水和病菌感染，保證移栽成活率。（三）再分化（通過(guò)調(diào)節(jié)激素種類(lèi)及比例）7三、茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)的概況早在20世紀(jì)60年代末，英國(guó)劍橋大學(xué)化學(xué)系開(kāi)始了茶樹(shù)幼莖切塊培養(yǎng)，用以研究茶樹(shù)咖啡堿合成途徑。此后，各國(guó)研究人員也開(kāi)始了對(duì)茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)的研究，并取得了一些成果。莫典義和黃雁萍（1981）通過(guò)種胚培養(yǎng)獲得完整植株；中村順行（1985）培養(yǎng)子胚獲得完整植株；劉德華（1990）培養(yǎng)子葉柄獲得完整植株；土井芳憲培養(yǎng)莖切段獲得完整植株；王毅軍（1994）以茶樹(shù)葉片為外植體，培養(yǎng)出完整的植株。盡管有很多成功的報(bào)道，但茶樹(shù)是多年生木本植物，多酚類(lèi)含量高，到目前為止，茶樹(shù)組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)還沒(méi)有完善，還有很多技術(shù)障礙需要克服。三、茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)的概況8第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作用1、單倍體植物的概念凡具有配子染色體數(shù)的植物稱(chēng)為單倍體植物。2、單倍體在植物育種上的作用⑴單倍體染色體加倍可獲得純合二倍體，這對(duì)常規(guī)雜交育種有極為重要意義。⑵有利于克服遠(yuǎn)緣雜交的不實(shí)性，培育出穩(wěn)定的遠(yuǎn)緣雜種新類(lèi)型。⑶與誘變育種相結(jié)合可加速育種進(jìn)程。⑷作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作9二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)（一）花藥培養(yǎng)1、取材。關(guān)鍵是選取花粉處于一定發(fā)育期的花藥。用醋酸洋紅染色壓片法鏡檢確定花粉的發(fā)育時(shí)期，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞處在單核中、晚期時(shí)，是花藥培養(yǎng)取材的最佳時(shí)期。2、滅菌。3、建立培養(yǎng)基并接種。在接種時(shí)注意徹底除去花絲部分和盡量避免損傷花藥。4、脫分化和繁殖增殖。藥室內(nèi)側(cè)分裂形成原胚多細(xì)胞團(tuán)，再經(jīng)球型胚、心臟型胚、魚(yú)雷型胚等發(fā)育階段，最后以胚狀體形式突出于花藥壁，再將胚狀體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)基培養(yǎng)、增殖。二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)105、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細(xì)胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化出不定芽和根，最后形成單倍體試管苗。6、移栽。通過(guò)更換培養(yǎng)基，逐漸降低滲透壓和生長(zhǎng)素含量，直到幼苗的根、莖、葉生長(zhǎng)都較正常和健壯時(shí)，移出進(jìn)行沙培或土培。（二）花粉培養(yǎng)由于在花藥培養(yǎng)中所獲得的植株不只是來(lái)源于花粉，也來(lái)源于花藥壁、絨氈層等不同部位的體細(xì)胞，結(jié)果造成所獲得植株群體常常是一個(gè)既有單倍體，又有二倍體、甚至多倍體的混合群體，給以后的鑒定和利用帶來(lái)一定困難。花粉培養(yǎng)則可以完全排除花藥組織的干擾，使誘導(dǎo)形成的植株全部來(lái)源于單倍體的花粉，從而可省略對(duì)其鑒定的程序或可以直接利用。但花粉培養(yǎng)所要求的技術(shù)要比花藥培養(yǎng)5、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細(xì)胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到11復(fù)雜，許多不明因素有待研究。花粉培養(yǎng)的全過(guò)程除了材料的選擇和滅菌與花藥培養(yǎng)基本相同外，還包括花粉的分離和培養(yǎng)兩個(gè)步驟?；ǚ鄣姆蛛x常用自然散落法，培養(yǎng)常用淺層液體培養(yǎng)法。（三）影響花藥及花粉培養(yǎng)的因素1、供體植株的基因型。一般地說(shuō)，性狀優(yōu)良、生活力強(qiáng)的親本的雜交后代的花藥及花粉比較容易誘導(dǎo)形成單倍體植株。復(fù)雜，許多不明因素有待研究。122、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長(zhǎng)速度和能否分化成完整的植株。主要的影響因素有：①營(yíng)養(yǎng)成分。主要是無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)成分（如氨基酸、酵母提取液等），為外植體的生長(zhǎng)發(fā)育提供碳源、氮源、微量元素等。②PH值。一般要求PH值在5。5~7之間。③蔗糖濃度。蔗糖濃度影響到培養(yǎng)基的滲透壓。一般地說(shuō)，開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，蔗糖濃度要高些，以后逐步降低。2、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長(zhǎng)速13④激素。激素的種類(lèi)及濃度對(duì)花藥及花粉的分化起著決定性作用。一般情況下。當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞激動(dòng)素的比值高時(shí)，有利長(zhǎng)根；比值低時(shí)，有利長(zhǎng)芽，比值適中時(shí)，繼續(xù)長(zhǎng)愈傷組織。3、小孢子發(fā)育階段。只有具一定發(fā)育階段的小孢子，才對(duì)外界刺激較為敏感。多數(shù)植物以單核期，特別是單核期的中后期比較敏感。4、供體植株的生理狀態(tài)及培養(yǎng)前的預(yù)處理。預(yù)處理有低溫處理、高溫處理、離心處理、減壓處理、滲透壓處理、碳源饑餓處理、二氧化碳處理等。④激素。激素的種類(lèi)及濃度對(duì)花藥及花粉的分化起著決定性作用。一14三、單倍體植株的染色體加倍單倍體植株只有經(jīng)過(guò)染色體加倍，使之成為純合的二倍體可育植株，才能給育種工作者提供可選擇的材料。目前單倍體植株的染色體加倍主要有以下三種途徑：1、自然加倍。2、人工誘導(dǎo)加倍。主要用秋水仙堿處理。3、從愈傷組織再生二倍體植株。即利用單倍性細(xì)胞的不穩(wěn)定特性，通過(guò)對(duì)單倍體植株的莖、葉等組織的再培養(yǎng)，可獲得較高比例的加倍植株。三、單倍體植株的染色體加倍15四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，將根尖用卡諾固定液固定，鐵礬蘇木精染色，制成石蠟切片或者涂片，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到染色體數(shù)目。5、茶樹(shù)花藥及花粉培養(yǎng)的成就。據(jù)報(bào)道，前蘇聯(lián)、印度、日本和我國(guó)的研究人員都對(duì)茶樹(shù)花藥及花粉培養(yǎng)進(jìn)行了研究，最有影響的是陳振光等人（1981）用茶樹(shù)花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)出完整的試管苗和植株。四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進(jìn)行細(xì)16第三節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)是指從植株組織器官或愈傷組織游離出單細(xì)胞，在無(wú)菌條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。（一）分離細(xì)胞的方法1、物理方法。先將植物組織器官等外植體接種到固體培養(yǎng)基上，讓其形成質(zhì)地松散的愈傷組織，再經(jīng)過(guò)振蕩、過(guò)濾、離心、沉淀而得到分散的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。2、酶法（果膠酶和纖維素酶）。第三節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細(xì)胞培養(yǎng)17（二）單細(xì)胞培養(yǎng)方法1、液體淺層培養(yǎng)。2、微滴培養(yǎng)。3、平板培養(yǎng)。4、看護(hù)培養(yǎng)。5、條件培養(yǎng)。（三）培養(yǎng)細(xì)胞的密度及活力的測(cè)定1、起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度。起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度通常以1萬(wàn)至1億個(gè)/毫升為宜。2、細(xì)胞活力的測(cè)定。測(cè)定方法主要有染色法，（二）單細(xì)胞培養(yǎng)方法18包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。3、植板率的測(cè)定。植板率的含義是每個(gè)平板接種細(xì)胞總數(shù)形成細(xì)胞團(tuán)的百分率。即：植板率=（每平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)÷每平板接種的細(xì)胞總數(shù)）×100%；其中，每平板接種的細(xì)胞總數(shù)=每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)目×該平板細(xì)胞培養(yǎng)液的毫升數(shù)。包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。19二、細(xì)胞突變體篩選（一）細(xì)胞突變體篩選的意義1、可在小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行選擇，節(jié)省人力、物力，而且不受環(huán)境條件的影響。2、篩選獲得的突變體不會(huì)出現(xiàn)嵌合體，遺傳穩(wěn)定，易鑒定。（二）細(xì)胞突變體篩選的一般技術(shù)1、細(xì)胞材料的選擇。要從再生能力強(qiáng)、染色體數(shù)目穩(wěn)定性好、生長(zhǎng)速度快的親本細(xì)胞系中進(jìn)行選擇。另外，如果篩選突變體的目的是為獲得能經(jīng)有性生殖傳代的植物，那么就應(yīng)避免使用非整倍二、細(xì)胞突變體篩選20體的細(xì)胞作為選擇的材料。2、誘發(fā)突變的方法①物理方法，如用紫外線、放射線處理。②化學(xué)方法，即使用化學(xué)誘變劑，如甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）和5-溴去氧尿嘧啶核苷等多種有機(jī)物以及一些簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)化合物．③突變細(xì)胞的選擇方法Ａ、直接選擇。如在培養(yǎng)基中某些重金屬離子，若能生存，說(shuō)明是耐高濃度重金屬離子的突變體細(xì)胞。Ｂ、間接選擇。如在培養(yǎng)基中加入羥基脯氨酸，可選擇耐旱性突變細(xì)胞。體的細(xì)胞作為選擇的材料。21（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定讓細(xì)胞或組織在沒(méi)有選擇劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)幾代，如果仍能表現(xiàn)選擇出來(lái)的變異性狀的，便可基本確定為突變細(xì)胞或組織。也可用再生的植株開(kāi)花結(jié)實(shí)后所獲得的發(fā)芽種子或用種子長(zhǎng)成的植株為材料，進(jìn)一步誘導(dǎo)其形成愈傷組織，將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，如果仍能表現(xiàn)變異性狀的，即可認(rèn)為這些再生植株為變異植株。（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定22（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選１、抗病性篩選。常用活菌選擇劑和病菌毒素選擇劑進(jìn)行篩選。２、對(duì)除草劑抗性的篩選。３、對(duì)溫度的抗耐性的篩選。（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選23第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交一、原生質(zhì)體和體細(xì)胞雜交的概念１、原生質(zhì)體：植株原生質(zhì)體是指除去細(xì)胞壁由質(zhì)膜包裹著的具有生活力的植株裸細(xì)胞。２、體細(xì)胞雜交：指使不同植物的原生質(zhì)體相互融合形成雜種細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)人工培養(yǎng)誘導(dǎo)雜種細(xì)胞分化形成植株的過(guò)程。二、原生質(zhì)體的分離（一）分離原生質(zhì)體的材料。常用葉肉組織、無(wú)菌苗的子葉以及由植物組織器官形成的愈傷組織及懸浮細(xì)胞。第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交一、原生質(zhì)體和體細(xì)胞雜交的概24（二）原生質(zhì)體的分離１、材料的預(yù)處理。目的使游離的原生質(zhì)體能適應(yīng)新的培養(yǎng)條件。⑴預(yù)培養(yǎng)。⑵暗處理。⑶藥物或添加劑處理。⑷萎焉處理。⑸更新培養(yǎng)基。２、原生質(zhì)體的分離。常用酶法分離。３、原生質(zhì)體活力的檢測(cè)：把原生質(zhì)體放入略微（二）原生質(zhì)體的分離25降低滲透壓的培養(yǎng)基中，那些在分離時(shí)縮小體型又能恢復(fù)原狀的原生質(zhì)體是具有活力的。二、原生質(zhì)體的培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基本及培養(yǎng)條件除選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基外，還應(yīng)注意以下問(wèn)題：１、植物激素。２原生質(zhì)體的密度。一般采用1千個(gè)/毫升以上的密度。３、光照和溫度。降低滲透壓的培養(yǎng)基中，那些在分離時(shí)縮小體型又能恢復(fù)原狀的原生26（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法。常用液體淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)兩種方法。（三）原生質(zhì)體的培養(yǎng)過(guò)程體積增大→細(xì)胞壁再生→細(xì)胞分裂→愈傷組織→再分化→幼苗。三、原生質(zhì)體的融合（一）原生質(zhì)體的融合的類(lèi)型１、自發(fā)融合。指植物組織和細(xì)胞在用酶分離原生質(zhì)體過(guò)程中，同種原生質(zhì)體自然融合，形成同核體。（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法。常用液體淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)兩種方法27２、誘導(dǎo)融合。指分離原生質(zhì)體以后，通過(guò)加入誘導(dǎo)劑或其它方法促進(jìn)不同親本的異種原生質(zhì)體之間發(fā)生融合的過(guò)程。異種原生質(zhì)體之間能否真正融合，在很大程度上處決原生質(zhì)體之間的親緣關(guān)系和生理狀態(tài)。（二）誘導(dǎo)融合的方法１、物理方法。有離心法、振動(dòng)法、電刺激法。常用后者。2、化學(xué)方法。⑴高PH高鈣法。２、誘導(dǎo)融合。指分離原生質(zhì)體以后，通過(guò)加入誘導(dǎo)劑或其它方法促28⑵多聚化合物法。常用聚乙二醇（PEG）。PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋，有很強(qiáng)的凝聚作用，當(dāng)PEG分子被高鈣、高PH洗脫時(shí)，可能引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進(jìn)融合。四、原生質(zhì)體融合體的發(fā)育及雜種細(xì)胞的篩選（一）原生質(zhì)融合體的生長(zhǎng)發(fā)育1、異核體的壁再生。2、異核體的核融合。異核體的核能否融合。在很大程度上取決于原生質(zhì)體之間的親緣關(guān)系，親緣關(guān)系近的原生質(zhì)體在細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)能同步分裂⑵多聚化合物法。常用聚乙二醇（PEG）。29而使核融合。3、融合細(xì)胞的增殖。4、愈傷組織的器官分化，形成幼苗。（二）雜種細(xì)胞的篩選在細(xì)胞水平上進(jìn)行雜種細(xì)胞的篩選，目的是雜種細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，以保護(hù)和促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。篩選的方法有很多。如培養(yǎng)基促進(jìn)異核體的選擇方法；葉綠素缺失互補(bǔ)選擇法；生化突變體互補(bǔ)選擇法；雙突變系選擇法；瑩光標(biāo)記選擇法等。這些方法有一定效果，也有一定局限性。而使核融合。30五、體細(xì)胞雜種植株的鑒定1、形態(tài)學(xué)鑒定。即根據(jù)植株的表現(xiàn)型特征來(lái)鑒定體細(xì)胞雜種。2、細(xì)胞學(xué)鑒定。即根據(jù)細(xì)胞中染色體數(shù)目、大小、與形態(tài)來(lái)鑒定細(xì)胞雜種。3、生化鑒定。即利用親本的某些生物化學(xué)特性在雜種中的表達(dá)來(lái)鑒別體細(xì)胞雜種。4、DNA檢測(cè)鑒定。即應(yīng)用分子檢測(cè)技術(shù)，從分子水平來(lái)鑒定體細(xì)胞雜種。五、體細(xì)胞雜種植株的鑒定31思考題：1、什么是體細(xì)胞雜交？簡(jiǎn)述體細(xì)胞雜交的步驟。2、體細(xì)胞雜種植株的鑒定方法有哪些？各有什么特點(diǎn)？3、什么是單倍體植物？單倍體茶樹(shù)對(duì)于茶樹(shù)育種來(lái)說(shuō)有何意義？4、成熟和完善的組織和器官培養(yǎng)體系對(duì)育種有何意義？目前利用組織和器官培養(yǎng)體系進(jìn)行茶樹(shù)育種有何困難？5、影響茶樹(shù)花藥培養(yǎng)的主要因素有哪些？思考題：32第七章：生物技術(shù)在茶樹(shù)育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計(jì)、構(gòu)建、培育具有預(yù)期性狀的新品種、新物種、新品系，以及與工程原理相結(jié)合，進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會(huì)提供商品和服務(wù)的綜合技術(shù)體系。目前用于茶樹(shù)育種的現(xiàn)代生物技術(shù)有組織培養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)繁殖技術(shù)、花粉（藥）培養(yǎng)和單倍體培育技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。第七章：生物技術(shù)在茶樹(shù)育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)33第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用（一）組織與器官培養(yǎng)的概念將離體的植物體各種結(jié)構(gòu)（如原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織、器官以及幼小植株）在無(wú)菌的人工環(huán)境中使其生長(zhǎng)發(fā)育，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。（二）組織與器官培養(yǎng)的類(lèi)型1、胚胎培育。指以胚及具有胚的器官作為外植體，在離體培養(yǎng)條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用342、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮組織等）作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。3、器官培養(yǎng)。指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。4、花粉與花藥培養(yǎng)。指用未成熟的花粉或花藥作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。5、細(xì)胞培養(yǎng)。指以能保持較好分散性的單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。6、原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細(xì)胞壁而獲得的原生質(zhì)體作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。2、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮35（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用1、擴(kuò)大變異范圍。2、克服遠(yuǎn)緣雜交的一些障礙。3、獲得體細(xì)胞雜種。4、倍性控制。5、快速無(wú)性繁殖。6、獲得脫毒苗。7、種質(zhì)資源的保存。8、作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用36二、培養(yǎng)的步驟與方法植物組織與器官培養(yǎng)的過(guò)程：無(wú)菌培養(yǎng)的建立→營(yíng)養(yǎng)繁殖體的增殖→再分化→試管苗移栽大田。（一）無(wú)菌培養(yǎng)的建立1、取材（外植體）。注意取材時(shí)間、部位、消毒等技術(shù)環(huán)節(jié)。⑴未成熟胚及相關(guān)材料的取材和滅菌。⑵莖尖及相關(guān)材料的取材。⑶葉片取材。注意消除多酚類(lèi)氧化而產(chǎn)生的褐變。二、培養(yǎng)的步驟與方法372、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)成分構(gòu)成，前者主要提供外植體發(fā)育所需的元素，后者主要是調(diào)節(jié)外植體的生長(zhǎng)發(fā)育。構(gòu)建培養(yǎng)基應(yīng)注意兩點(diǎn)：①必須保證外植體能夠生存。②盡可能使外植體較快生長(zhǎng)發(fā)育。最常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。（二）營(yíng)養(yǎng)繁殖體的增殖營(yíng)養(yǎng)繁殖體的增殖是指愈傷組織的增殖。外植體接種到培養(yǎng)基后，經(jīng)過(guò)脫分化作用，形成一團(tuán)分生細(xì)胞（愈傷組織），這團(tuán)細(xì)胞不斷分裂使?fàn)I養(yǎng)繁殖體增殖。2、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)成分構(gòu)成，前者主要提供38（三）再分化（通過(guò)調(diào)節(jié)激素種類(lèi)及比例）1、誘導(dǎo)腋芽發(fā)生。2、誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。3、誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生。4、誘導(dǎo)根的發(fā)生。5、幼苗的馴化鍛煉。（四）試管苗移栽大田。主要克服組織失水和病菌感染，保證移栽成活率。（三）再分化（通過(guò)調(diào)節(jié)激素種類(lèi)及比例）39三、茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)的概況早在20世紀(jì)60年代末，英國(guó)劍橋大學(xué)化學(xué)系開(kāi)始了茶樹(shù)幼莖切塊培養(yǎng)，用以研究茶樹(shù)咖啡堿合成途徑。此后，各國(guó)研究人員也開(kāi)始了對(duì)茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)的研究，并取得了一些成果。莫典義和黃雁萍（1981）通過(guò)種胚培養(yǎng)獲得完整植株；中村順行（1985）培養(yǎng)子胚獲得完整植株；劉德華（1990）培養(yǎng)子葉柄獲得完整植株；土井芳憲培養(yǎng)莖切段獲得完整植株；王毅軍（1994）以茶樹(shù)葉片為外植體，培養(yǎng)出完整的植株。盡管有很多成功的報(bào)道，但茶樹(shù)是多年生木本植物，多酚類(lèi)含量高，到目前為止，茶樹(shù)組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)還沒(méi)有完善，還有很多技術(shù)障礙需要克服。三、茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)的概況40第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作用1、單倍體植物的概念凡具有配子染色體數(shù)的植物稱(chēng)為單倍體植物。2、單倍體在植物育種上的作用⑴單倍體染色體加倍可獲得純合二倍體，這對(duì)常規(guī)雜交育種有極為重要意義。⑵有利于克服遠(yuǎn)緣雜交的不實(shí)性，培育出穩(wěn)定的遠(yuǎn)緣雜種新類(lèi)型。⑶與誘變育種相結(jié)合可加速育種進(jìn)程。⑷作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作41二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)（一）花藥培養(yǎng)1、取材。關(guān)鍵是選取花粉處于一定發(fā)育期的花藥。用醋酸洋紅染色壓片法鏡檢確定花粉的發(fā)育時(shí)期，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞處在單核中、晚期時(shí)，是花藥培養(yǎng)取材的最佳時(shí)期。2、滅菌。3、建立培養(yǎng)基并接種。在接種時(shí)注意徹底除去花絲部分和盡量避免損傷花藥。4、脫分化和繁殖增殖。藥室內(nèi)側(cè)分裂形成原胚多細(xì)胞團(tuán)，再經(jīng)球型胚、心臟型胚、魚(yú)雷型胚等發(fā)育階段，最后以胚狀體形式突出于花藥壁，再將胚狀體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)基培養(yǎng)、增殖。二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)425、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細(xì)胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化出不定芽和根，最后形成單倍體試管苗。6、移栽。通過(guò)更換培養(yǎng)基，逐漸降低滲透壓和生長(zhǎng)素含量，直到幼苗的根、莖、葉生長(zhǎng)都較正常和健壯時(shí)，移出進(jìn)行沙培或土培。（二）花粉培養(yǎng)由于在花藥培養(yǎng)中所獲得的植株不只是來(lái)源于花粉，也來(lái)源于花藥壁、絨氈層等不同部位的體細(xì)胞，結(jié)果造成所獲得植株群體常常是一個(gè)既有單倍體，又有二倍體、甚至多倍體的混合群體，給以后的鑒定和利用帶來(lái)一定困難?；ǚ叟囵B(yǎng)則可以完全排除花藥組織的干擾，使誘導(dǎo)形成的植株全部來(lái)源于單倍體的花粉，從而可省略對(duì)其鑒定的程序或可以直接利用。但花粉培養(yǎng)所要求的技術(shù)要比花藥培養(yǎng)5、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細(xì)胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到43復(fù)雜，許多不明因素有待研究?；ǚ叟囵B(yǎng)的全過(guò)程除了材料的選擇和滅菌與花藥培養(yǎng)基本相同外，還包括花粉的分離和培養(yǎng)兩個(gè)步驟。花粉的分離常用自然散落法，培養(yǎng)常用淺層液體培養(yǎng)法。（三）影響花藥及花粉培養(yǎng)的因素1、供體植株的基因型。一般地說(shuō)，性狀優(yōu)良、生活力強(qiáng)的親本的雜交后代的花藥及花粉比較容易誘導(dǎo)形成單倍體植株。復(fù)雜，許多不明因素有待研究。442、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長(zhǎng)速度和能否分化成完整的植株。主要的影響因素有：①營(yíng)養(yǎng)成分。主要是無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)成分（如氨基酸、酵母提取液等），為外植體的生長(zhǎng)發(fā)育提供碳源、氮源、微量元素等。②PH值。一般要求PH值在5。5~7之間。③蔗糖濃度。蔗糖濃度影響到培養(yǎng)基的滲透壓。一般地說(shuō)，開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，蔗糖濃度要高些，以后逐步降低。2、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長(zhǎng)速45④激素。激素的種類(lèi)及濃度對(duì)花藥及花粉的分化起著決定性作用。一般情況下。當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞激動(dòng)素的比值高時(shí)，有利長(zhǎng)根；比值低時(shí)，有利長(zhǎng)芽，比值適中時(shí)，繼續(xù)長(zhǎng)愈傷組織。3、小孢子發(fā)育階段。只有具一定發(fā)育階段的小孢子，才對(duì)外界刺激較為敏感。多數(shù)植物以單核期，特別是單核期的中后期比較敏感。4、供體植株的生理狀態(tài)及培養(yǎng)前的預(yù)處理。預(yù)處理有低溫處理、高溫處理、離心處理、減壓處理、滲透壓處理、碳源饑餓處理、二氧化碳處理等。④激素。激素的種類(lèi)及濃度對(duì)花藥及花粉的分化起著決定性作用。一46三、單倍體植株的染色體加倍單倍體植株只有經(jīng)過(guò)染色體加倍，使之成為純合的二倍體可育植株，才能給育種工作者提供可選擇的材料。目前單倍體植株的染色體加倍主要有以下三種途徑：1、自然加倍。2、人工誘導(dǎo)加倍。主要用秋水仙堿處理。3、從愈傷組織再生二倍體植株。即利用單倍性細(xì)胞的不穩(wěn)定特性，通過(guò)對(duì)單倍體植株的莖、葉等組織的再培養(yǎng)，可獲得較高比例的加倍植株。三、單倍體植株的染色體加倍47四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，將根尖用卡諾固定液固定，鐵礬蘇木精染色，制成石蠟切片或者涂片，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到染色體數(shù)目。5、茶樹(shù)花藥及花粉培養(yǎng)的成就。據(jù)報(bào)道，前蘇聯(lián)、印度、日本和我國(guó)的研究人員都對(duì)茶樹(shù)花藥及花粉培養(yǎng)進(jìn)行了研究，最有影響的是陳振光等人（1981）用茶樹(shù)花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)出完整的試管苗和植株。四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進(jìn)行細(xì)48第三節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)是指從植株組織器官或愈傷組織游離出單細(xì)胞，在無(wú)菌條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。（一）分離細(xì)胞的方法1、物理方法。先將植物組織器官等外植體接種到固體培養(yǎng)基上，讓其形成質(zhì)地松散的愈傷組織，再經(jīng)過(guò)振蕩、過(guò)濾、離心、沉淀而得到分散的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。2、酶法（果膠酶和纖維素酶）。第三節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細(xì)胞培養(yǎng)49（二）單細(xì)胞培養(yǎng)方法1、液體淺層培養(yǎng)。2、微滴培養(yǎng)。3、平板培養(yǎng)。4、看護(hù)培養(yǎng)。5、條件培養(yǎng)。（三）培養(yǎng)細(xì)胞的密度及活力的測(cè)定1、起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度。起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度通常以1萬(wàn)至1億個(gè)/毫升為宜。2、細(xì)胞活力的測(cè)定。測(cè)定方法主要有染色法，（二）單細(xì)胞培養(yǎng)方法50包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。3、植板率的測(cè)定。植板率的含義是每個(gè)平板接種細(xì)胞總數(shù)形成細(xì)胞團(tuán)的百分率。即：植板率=（每平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)÷每平板接種的細(xì)胞總數(shù)）×100%；其中，每平板接種的細(xì)胞總數(shù)=每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)目×該平板細(xì)胞培養(yǎng)液的毫升數(shù)。包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。51二、細(xì)胞突變體篩選（一）細(xì)胞突變體篩選的意義1、可在小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行選擇，節(jié)省人力、物力，而且不受環(huán)境條件的影響。2、篩選獲得的突變體不會(huì)出現(xiàn)嵌合體，遺傳穩(wěn)定，易鑒定。（二）細(xì)胞突變體篩選的一般技術(shù)1、細(xì)胞材料的選擇。要從再生能力強(qiáng)、染色體數(shù)目穩(wěn)定性好、生長(zhǎng)速度快的親本細(xì)胞系中進(jìn)行選擇。另外，如果篩選突變體的目的是為獲得能經(jīng)有性生殖傳代的植物，那么就應(yīng)避免使用非整倍二、細(xì)胞突變體篩選52體的細(xì)胞作為選擇的材料。2、誘發(fā)突變的方法①物理方法，如用紫外線、放射線處理。②化學(xué)方法，即使用化學(xué)誘變劑，如甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）和5-溴去氧尿嘧啶核苷等多種有機(jī)物以及一些簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)化合物．③突變細(xì)胞的選擇方法Ａ、直接選擇。如在培養(yǎng)基中某些重金屬離子，若能生存，說(shuō)明是耐高濃度重金屬離子的突變體細(xì)胞。Ｂ、間接選擇。如在培養(yǎng)基中加入羥基脯氨酸，可選擇耐旱性突變細(xì)胞。體的細(xì)胞作為選擇的材料。53（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定讓細(xì)胞或組織在沒(méi)有選擇劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)幾代，如果仍能表現(xiàn)選擇出來(lái)的變異性狀的，便可基本確定為突變細(xì)胞或組織。也可用再生的植株開(kāi)花結(jié)實(shí)后所獲得的發(fā)芽種子或用種子長(zhǎng)成的植株為材料，進(jìn)一步誘導(dǎo)其形成愈傷組織，將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，如果仍能表現(xiàn)變異性狀的，即可認(rèn)為這些再生植株為變異植株。（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定54（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選１、抗病性篩選。常用活菌選擇劑和病菌毒素選擇劑進(jìn)行篩選。２、對(duì)除草劑抗性的篩選。３、對(duì)溫度的抗耐性的篩選。（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選55第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交一、原生質(zhì)體和體細(xì)胞雜交的概念１、原生質(zhì)體：植株原生質(zhì)體是指除去細(xì)胞壁由質(zhì)膜包裹著的具有生活力的植株裸細(xì)胞。２、體細(xì)胞雜交：指使不同植物的原生質(zhì)體相互融合形成雜種細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)人工培養(yǎng)誘導(dǎo)雜種細(xì)胞分化形成植株的過(guò)程。二、原生質(zhì)體的分離（一）分離原生質(zhì)體的材料。常用葉肉組織、無(wú)菌苗的子葉以及由植物組織器官形成的愈傷組織及懸浮細(xì)胞。第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交一、原生質(zhì)體和體細(xì)胞雜交的概56（二）原生質(zhì)體的分離１、材料的預(yù)處理。目的使游離的原生質(zhì)體能適應(yīng)新的培養(yǎng)條件。⑴預(yù)培養(yǎng)。⑵暗處理。⑶藥物或添加劑處理。⑷萎焉處理。⑸更新培養(yǎng)基。２、原生質(zhì)體的分離。常用酶法分離。３、原生質(zhì)體活力的檢測(cè)：把原生質(zhì)體放入略微（二）原生質(zhì)體的分離57降低滲透壓的培養(yǎng)基中，那些