清益寧絡方對IgA腎病小鼠IL-8表達影響的實驗研究

清益寧絡方對IgA腎病小鼠IL-8表達影響的實驗研究周冬枝童心夏欣欣韓萍侯蕊娟袁慧趙立沙西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科西安710061摘要：【目的】探討清益寧絡方對IgA腎病小鼠的IL-8表達的影響?！痉椒ā坎捎门Ｑ灏椎鞍缀推咸亚蚓c毒素B復合感染方法復制小鼠IgA腎病模型。隨機分為空白組、模型組、雷公藤多甙組、清益寧絡方高、低劑量組。給藥5周，觀察血尿、蛋白尿、血肌酐、尿素氮及腎組織病理變化，檢測血清及腎組織IL-8含量。【結(jié)果】與模型組比較，清益寧絡方高、低劑量組血尿、蛋白尿、血肌酐、尿素氮及血清、腎組織IL-8濃度顯著降低（P<0.05），但與雷公藤組比較無統(tǒng)計學差異?！窘Y(jié)論】清益寧絡方治療IgAN療效機理可能與降低IL-8水平，下調(diào)炎癥反應從而減輕組織損傷有關(guān)。關(guān)鍵詞：IgA腎??；清益寧絡方；白細胞介素-8Abstract：【Objective】ToexploretheQingYiNingLuodecoction's(QYNLD's)influenceoftheexpressiontoIL-8formouseofIgAnephropathy.【Methods】Theinvestigationadoptedmethodsthatbovineserumalbuminandthestaphyloentero-toxinBcompoundinfectiontoreplicatemousemodelofIgAnephropathy.Accordingtocompletelyrandomdesignprinciple，ICRmousearedividedinto5groups，respectivelyforblankgroup,modelgroup,TripterygiumGlycosides(TG)group,QYNLDhighdosesgroupandlowdosesgroup.Givemedicine5weeks,toobserveMouse'shematuria,proteinuria,Scr,BUN,kidneytissuepathologicalchanges,usingserumandkidneytissuesfortheassayingofIL-8.【Results】Comparedwiththemodelgroup,QYNLDhighdosesgroup,lowdosesgroupallcanmakethehematuria,proteinuria,Scr,BUNandIL-8decrease（P<0.05）,butthereisnostatisticsmeaningwithTGgroup.【Conclusion】ForIgANtreatment,itscurativeeffectmechaniempossibilityisrelatedtodegradethelevelofIL-8,lightenkidneypathologyingury.【KeyWords】IgAnephropathyQingYiNingLuodecoctionInterleulin-8IgA腎病(IgAN)是免疫復合物性腎病，免疫機制是其始發(fā)機制，在此基礎(chǔ)上炎癥反應的參與最終導致腎小球的損傷。新近研究發(fā)現(xiàn)趨化因子在腎臟炎癥反應中起關(guān)鍵作用，其中IL-8介導白細胞的游走、浸潤和激活，參與調(diào)節(jié)炎癥反應的進程，對腎臟病的發(fā)生、發(fā)展、預后均起重要作用。因此下調(diào)免疫炎癥反應是較為理想的治療方法之一。我們在長期臨床實踐中采用清益寧絡方治療該病取得較好療效，本研究觀察了其對血清及腎組織IL-8表達的影響，為探討其作用機理。1材料和方法1.1實驗動物ICR小鼠，體重20克左右，由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供。1.2藥物制備清益寧絡方(由黃芪、旱蓮草、女貞子、積雪草、黃蜀葵花、白茅根、當歸、蒲黃及澤蘭等藥組成)，生藥水煎，過濾，濃縮成所需濃度待用，由西安交通大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科提供。雷公藤多甙片，10mg/片，由上海美通生物科技有限公司生產(chǎn)。1.3造模、分組及給藥方法參照文獻[1]采用口服牛血清白蛋白和靜脈注射葡萄球菌腸毒素B復合感染方法復制小鼠IgA腎病模型。隨機分為空白組、模型組、雷公藤多甙組（5mg/kg.d）、清益寧絡方低劑量組（20g/kg.d）及清益寧絡方高劑量組（40g/kg.d）。于實驗第8周各給藥組分別灌胃給藥，每日一次，連續(xù)5周，空白組及模型組分別灌胃等容積的蒸餾水。1.4觀察項目于實驗第12周末取尿測小鼠血尿、蛋白尿；眼球取血，頸椎脫臼處死，提取血清測定腎功、血清IL-8水平，制備10%的腎組織勻漿，提取上清液測定腎組織IL-8水平；取腎皮質(zhì)切片，免疫酶標法觀察腎小球IgA沉積情況及蘇木素伊紅(HE)染色觀察腎組織形態(tài)，并在電鏡下觀察電子致密物的沉積情況。1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包以及Stata8.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料進行各組間單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義；等級資料比較用Kruskal-WallisH檢驗，等級資料組間比較用Wilcoxon檢驗，P<0.0045為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果用均數(shù)±標準差（±ｓ）表示。2結(jié)果2.1蛋白尿及血尿檢測結(jié)果與模型組尿蛋白及血尿比較，清益寧絡方高、低劑量組及雷公藤多甙組均有顯著性差異（P＜0.0045），但各給藥組組間比較無明顯差異（P＞0.0045）。（表1）表1各組蛋白尿及血尿檢測情況組別蛋白尿血尿－±＋≥++－+++正常組100001000模型組0026*026*雷公藤組2520#261#清高組5400#▲630#▼清低組1610#▲440#注：總組間P＜0.01；多組間比較，與正常組比較，*P＜0.0045；與模型組比較#P＜0.0045；與雷公藤組比較▼P＜0.0045、▲P﹥0.0045。2.2腎功能檢測結(jié)果模型組BUN、SCr均高于正常組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。清益寧絡方高、低劑量組及雷公藤組均低于模型組（P＜0.01）。清益寧絡方高劑量組BUN與雷公藤多甙組比較有顯著性差異P＜0.05，低劑量組P﹥0.05；而SCr與雷公藤組比較，復方高、低劑量組均無統(tǒng)計學意義P﹥0.05，高、低劑量組間無統(tǒng)計學意義P﹥0.05。（表2）表2各組尿素氮、血肌酐變化組別例數(shù)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)正常組106.10±0.3737.91±4.01模型組810.91±0.91*56.80±4.30*雷公藤組99.87±0.39#50.13±2.94#清高組99.23±0.60#▼48.19±3.64#清低組89.70±0.87#49.30±4.03#注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與雷公藤組比較，▼P＜0.05。2.3血清及腎組織IL-8濃度檢測結(jié)果模型組血清及腎組織IL-8濃度明顯高于空白組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。雷公藤多甙組及清益寧絡方高、低劑量組血清、腎組織IL-8濃度明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各給藥組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。（表3）表3各組血清及腎組織IL-8變化（±ｓ）組別例數(shù)血清IL-8(ng/ml)腎組織IL-8(ng/ml)空白組100.08±0.030.09±0.02模型組80.51±0.92**0.49±0.10**雷公藤組90.15±0.03*#0.18±0.05*#清高組80.18±0.01*#0.19±0.03*#清低組80.19±0.05*#0.20±0.05*#注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。2.4腎臟病理學觀察肉眼觀察可見模型組腎臟體積較空白組有所增大，表面呈暗紅色，切面腎皮質(zhì)無明顯增厚，皮髓質(zhì)分界尚清楚。清益寧絡方高、低劑量組及雷公藤多甙組有部分小鼠腎臟體積增大，其余小鼠與空白組基本一致。模型組HE染色可見輕重不等的系膜組織增生，大部分區(qū)域為輕中度增生，表現(xiàn)為系膜區(qū)增寬，增寬的系膜區(qū)內(nèi)系膜細胞和系膜基質(zhì)均有增生，伴有毛細血管腔狹小，未見球囊粘連和新月體形成；免疫酶標染色可見彌漫性系膜區(qū)IgA沉積，呈散在顆粒狀或團塊狀；電鏡下觀察腎小球系膜區(qū)系膜細胞增生，系膜基質(zhì)增多，上皮細胞可見足突絨毛變性和融合，系膜區(qū)及基底膜可見電子致密物沉積。清益寧絡方高、低劑量組及雷公藤組腎臟病理學改變均較模型組減輕，其中清益寧絡方高劑量組病理變化最輕。（圖1、圖2、圖3）圖1空白組HE染色（×400）圖2模型組HE染色（×400）圖3高劑量組HE染色（×400）3討論本實驗以口服牛血清白蛋白，靜注葡萄球菌腸毒素B感染的復合法建立大鼠實驗性IgA腎病的模型。實驗模型具有以下特點：①鏡下血尿、蛋白尿的臨床表現(xiàn)；②免疫組化顯示腎臟系膜區(qū)IgA免疫復合物呈顆?；驁F塊狀病理沉積；③光鏡下腎小球系膜細胞增生，細胞外基質(zhì)增多；電鏡下上皮細胞足突融合，系膜區(qū)有電子致密物沉積等組織學病理改變。本模型無明顯肉眼血尿，這與大多文獻報道相一致，但腎臟病理學改變以及鏡下血尿、蛋白尿的發(fā)生均說明本動物模型造模是成功的。血尿是IgAN的主要臨床表現(xiàn)，持續(xù)鏡下血尿是低程度炎癥的反映，與該病預后不良有關(guān)，因此血尿是腎小球病理損害的重要表現(xiàn)，也是評價藥物療效的重要指標；蛋白尿不僅是腎小球機能障礙的一個標志，而且更能作為一個獨立因素，導致進行性腎實質(zhì)損傷，其產(chǎn)生機制機制主要與腎小球濾過屏障異常有關(guān)。本研究表明，經(jīng)清益寧絡方治療的IgAN小鼠，其血尿和蛋白尿明顯減少，統(tǒng)計學有顯著性差異，但與雷公藤多甙組比較無顯著差異。說明清益寧絡方對IgAN小鼠血尿、蛋白尿有干預作用，與雷公藤作用相當。SCr、BUN是反映腎小球濾過率的可靠指標，也是評價腎功能的常用重要臨床指標。本研究表明，經(jīng)清益寧絡方治療的IgAN小鼠與模型組比較，SCr、BUN降低，統(tǒng)計學有顯著性差異；清益寧絡方高劑量組BUN與雷公藤多甙組比較有差異P＜0.05，低劑量組P﹥0.05；而SCr與雷公藤組比較，復方高、低劑量組均無統(tǒng)計學意義P﹥0.05。說明清益寧絡方具有提高腎小球濾過率，促進血肌酐和尿素氮的排泄，具有保護腎功能作用，且其作用強于雷公藤。IgA腎病中免疫機制是始發(fā)機制，在此基礎(chǔ)上炎癥反應的參與，最終導致腎小球的損傷。白細胞介素-8（IL-8）為迄今發(fā)現(xiàn)活性最強的趨化因子之一，它對炎癥的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸有重要意義。因此，通過降低IL-8在血清及腎組織的含量，下調(diào)IgA腎病的炎癥反應，對減輕腎組織免疫炎癥損害具有重要作用。本研究表明，經(jīng)清益寧絡方治療的IgAN小鼠，血清及腎組織中IL-8濃度明顯降低，與模型組比較有顯著性差異；與雷公藤組比較無統(tǒng)計學意義。說明清益寧絡方能下調(diào)血清及腎組織中IL-8的水平，減輕炎癥反應，其作用與雷公藤多甙相近似。研究發(fā)現(xiàn)[2]，IgA腎病患者IL-8水平顯著高于健康對照組，并且與血尿的發(fā)生及尿蛋白的排泄量呈正相關(guān)。同時，腎組織IL-8mRNA的表達與腎組織中浸潤的中性粒細胞數(shù)目和系膜細胞增殖亦呈顯著相關(guān)性。利用抗IL-8單克隆抗體治療IgA腎病小鼠，可以明顯減輕腎組織病理改變，并阻止血尿、蛋白尿的產(chǎn)生[3]。本研究中，經(jīng)清益寧絡方治療的IgA腎病小鼠血尿、蛋白尿減少；HE染色及電鏡觀察可見腎小球系膜區(qū)系膜細胞增殖、基質(zhì)增生，上皮細胞足突絨毛變性、融合以及電子致密物沉積等病理改變均較模型組明顯減輕。推測其作用機制可能與該方降低IL-8水平，下調(diào)炎癥反應，從而減輕組織損傷有關(guān)。IgA腎病可歸屬于中醫(yī)“尿血”“水腫”等范疇，研究認為氣陰兩虛是IgA腎病發(fā)病的內(nèi)在病理基礎(chǔ)，炎癥與濕熱、瘀血相關(guān)，正虛、濕熱、瘀血三者相互影響，互為因果。因此，益氣養(yǎng)陰、清熱利濕、活血祛瘀為治療該病的基本法則。我們抓住其病機特點，并結(jié)合中藥現(xiàn)代藥理關(guān)于調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應等方面的研究成果，選由黃芪、旱蓮草、女貞子、積雪草、黃蜀葵花、白茅根、當歸、蒲黃及澤蘭等藥組成清益寧絡方。方中黃芪益氣固表，利水消腫為君藥；配旱蓮草補益腎陰；黃蜀葵花清利濕熱；白茅根清熱涼血而不留瘀，佐以當歸涼血活血，化瘀止血。全方補清并舉，止血與活血同用，補而不溫燥，清而不傷正，止血不留瘀，活血兼寧血；現(xiàn)代藥理研究表明：旱蓮草[4]具有提高免疫功能，止血、抗炎等作用；白茅根[5]具有抗炎、促凝血及增強機體的非特異性免疫作用；當歸[6]具有抗炎作用，改善腎臟血流動力學，增強機體免疫功能，同時還能減少腎小球細胞外基質(zhì)沉積以及抑制內(nèi)皮素（ET）的釋放，對腎缺血損傷具有保護作用。經(jīng)過長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)本方具有良好療效，因此推測該方可能通過降低IL-8水平，下調(diào)炎癥反應從而減輕組織損傷保護腎功能，從而發(fā)揮對IgA腎病的治療作用。參考文獻：[1]周金金,薛繼強.IgA腎病動物模型