禽流感監(jiān)測課件

禽流感監(jiān)測宣漢縣動物疫病預防控制中心實驗室2013年5月10日主要內(nèi)容：一、概述二、病原三、流行病學四、臨床癥狀和病理變化五、實驗室監(jiān)測診斷六、人員防護一、概述禽流感（AI），即禽流行性感冒的簡稱，是由A型流感病毒引起的一種禽類傳染病。本病傳播迅速，常呈流行性或大流行性發(fā)生。臨床上，可出現(xiàn)急性敗血癥、呼吸道感染甚至隱性經(jīng)過等形式。是一種危害嚴重的疾病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）和我國均將其列為A類烈性傳染病。根據(jù)禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。禽流感病毒有不同的亞型，由H5和H7亞型毒株（以H5N1、H7N7和H7N9為代表）所引起的疾病稱為高致病性禽流感（HPAI）。今年3月以來，我國上海、安徽、浙江、江蘇、北京、河南、湖南、山東、江西、福建、臺灣、廣東等省市先后發(fā)生人感染H7N9亞型病例。截至5月6日，確診129人，31人死亡，康復42人。這是2003-2006年H5N1在家禽和野鳥中的流行情況圖紅色為家禽流行區(qū)域，黃色為野鳥流行區(qū)域這是2005年的HPAI全球分布圖紅色區(qū)域代表當年有疫情的國家這是2006年的HPAI全球分布圖這是2007年的HPAI全球分布圖從這張圖上可以看出，當年為世界性暴發(fā)這是2008年中國的情況二、病原1、流感病毒分類：禽流感的病原為禽流感病毒（AIV），是一種RNA病毒，屬正粘病毒科流感病毒屬。流感病毒分為A（甲）、B（乙）、C（丙）三型。A型流感病毒能引起人、禽類及多種哺乳動物發(fā)病，常以流行形式出現(xiàn)，可引起世界范圍內(nèi)的大流行，在動物中廣泛存在，能致動物大批死亡。B型流感病毒主要引起人發(fā)生流感。C型流感病毒主要引起人和豬發(fā)生流感。

3、AIV的毒力劃分：不同亞型的禽流感病毒，毒力差異很大。根據(jù)OIE標準:病毒對雞靜脈接種后的致病指數(shù)(IVPI):IVPI≥1.2,高致病性(HPAIV)；0.5≤IVPI≤1.2,低致病性(LPAIV)；IVPI≤0.5，無致病性(NPAIV)。高致病性病毒引起高致病性禽流感，傳播快，可致100%死亡(一般認為H5、H7亞型的一些毒株為高致病性毒株)；低致病性病毒引起低致病性禽流感，產(chǎn)生溫和性呼吸道疾病、沉郁和產(chǎn)蛋禽類的產(chǎn)蛋下降等問題；無致病性病毒感染后，不出現(xiàn)任何癥狀。我國已分離的禽流感病毒株亞型有H9N2、H9N3、H5N1、H7N1、H7N3、H7N9、H4N5、H14N5等，其IVPI在0.48～3.00，高、低、無致病性病毒株在我國均有存在。4、病毒的變異：AIV很易發(fā)生變異，HA和NA這兩種表面抗原可獨立或同時發(fā)生變異，HA的變異性很強，是AIV發(fā)生變異的主要原因。同時，AIV的致病力也容易發(fā)生變異，不斷出現(xiàn)新的高致病力毒株，且可能感染新的宿主。5、流感病毒的血凝性：AIV能凝集馬、驢、豬、牛、羊、雞、鴿、豚鼠和人的紅細胞，但不能凝集兔紅細胞。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動物。感染人的禽流感病毒亞型為H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、H7N9等6、AIV的抵抗力：AIV存在于病禽的所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中，大量的病毒可通過糞便排出。AIV對外界環(huán)境的抵抗力不強，對高溫、紫外線、各種消毒藥敏感（對碘制劑特別敏感，目前我縣使用的是消毒正典，有效成份是聚維酮碘溶液），易被殺死。56℃30分鐘、60℃10分鐘可滅活病毒。但對低溫和干燥環(huán)境較適應（0-4℃可存活數(shù)月，-70℃穩(wěn)定，凍干可存活數(shù)年）。三、流行病學1、流行特點：禽流感病毒感染多種家禽、野禽和鳥類，以雞和火雞易感性最高。水禽如鴨、鵝可帶毒、散毒，一般無臨床癥狀。從鴨分離到的流感病毒比其他禽類都多。目前已發(fā)現(xiàn)可攜帶AIV的鳥類種類有88種。病禽是主要傳染源，野生水禽是自然界流感病毒的主要帶毒者，鳥類也是重要的傳播者。傳播途徑：主要經(jīng)消化道傳播，也可通過傷口、呼吸道、眼結(jié)膜傳染。垂直傳播的證據(jù)很少，但有證據(jù)表明實驗感染雞的蛋中有禽流感病毒的存在。因此，不能完全排除垂直傳播的可能性。以接觸傳播為主，也可能通過空氣和蛋的媒介傳播。最近，中國科學家從豬的鼻分泌物中分離出了禽流感病毒，而豬有復制禽類和人類流感病毒的能力因此，禽流感病毒和人類流感病毒在豬體內(nèi)，有可能混合重組產(chǎn)生一種新型的、致命的、能在人與人之間傳播的毒株。

2、臨床癥狀：具有診斷意義的癥狀：1）急性發(fā)病死亡；2）腳鱗出血；3）雞冠出血或發(fā)紺、頭部水腫；4）肌肉和其它組織器官廣泛嚴重出血。

養(yǎng)殖場急性發(fā)病死亡病雞腳鱗出血病鴨腿及腳蹼皮下嚴重出血鴨蹼皮下出血臨床癥狀病雞腳鱗皮膚充血、出血病雞頭部、眼瞼周圍腫脹

結(jié)膜充血、出血，并流出粘性鼻涕冠髯腫脹，嚴重時出血、壞死

病鴨頭部腫脹，流出血性鼻涕3、病理變化：（1）剖檢病變:全身組織器官嚴重出血。腺胃粘液增多，刮開可見腺胃乳頭出血、腺胃和肌胃之間交界處粘膜可見帶狀出血；消化道粘膜，特別是十二指腸廣泛出血；呼吸道粘膜可見充血、出血；心冠脂肪及心內(nèi)膜出血；輸卵管的中部可見乳白色分泌物或凝塊；卵泡充血、出血、萎縮、破裂,有的可見“卵黃性腹膜炎”。水禽在心內(nèi)膜還可見灰白色條狀壞死。胰臟沿長軸常有淡黃色斑點和暗紅色區(qū)域。急性死亡病例有時未見明顯病變。（2）病理組織學變化:主要表現(xiàn)為腦、皮膚及內(nèi)臟器官（肝、脾、胰、肺、腎）的出血、充血和壞死。腦的病變包括壞死灶、血管周圍淋巴細胞管套、神經(jīng)膠質(zhì)灶、血管增生和神經(jīng)元性變化；胰腺和心肌組織局灶性壞死。鴨肝臟、心臟出血禽流感腺胃乳頭出血，腺胃和肌胃交界處帶狀出血【大體病變】干酪性竇炎喉頭氣管黏膜水腫

卵泡出血、破裂，腹腔內(nèi)有新流出的卵黃

氣管黏膜出血氣管內(nèi)有干酪樣滲出物

鴨胰腺出血、壞死禽流感五、實驗室監(jiān)測診斷方法血凝抑制試驗（HI）、瓊脂擴散試驗、ELISA、補體結(jié)合試驗、中和試驗等方法特異性抗原、抗體檢測方法；RT-PCR、熒光定量PCR、病毒分離培養(yǎng)等病原學檢測方法。樣品采集血清樣品：翅下靜脈，心臟。組織樣品：采取氣管、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、泄殖腔等。拭子：用棉拭子涂擦喉頭、氣管、泄殖腔、豬鼻腔。樣品保存送檢采集的樣品如在48小時進行檢查，可放入4℃保存，否則放于低溫下保存（-70℃保存最好）。

下面詳細說一下HPAI監(jiān)測樣品的采集、保存與運輸技術要求1、采樣范圍：活禽交易市場、農(nóng)貿(mào)市場、家禽及生豬屠宰場（點）、家禽養(yǎng)殖場（村）等，盡可能覆蓋多種家禽（特別是水禽）和多個攤位。2、采樣前的準備1）采樣要求：根據(jù)采樣目的，采集不同類型和不同數(shù)量的樣品，采樣人員必須是獸醫(yī)技術人員，熟悉采樣器具的使用，掌握正確采樣方法。２）采樣器具：動物檢疫器械箱，保溫箱或保溫瓶，剪刀，鑷子，酒精棉，碘酒棉，棉簽，注射器、針頭、動物保定器等。3）樣品容器：1.5mL離心管，10mL離心管及易封口樣品袋，塑料包裝袋等。4）保存和運輸用品：塑料盒(1.5mL小離心管專用)，鋁飯盒，瓶塞，無菌棉拭子，膠布，封口膜，封條，冰袋。

采樣刀剪等器具和樣品容器須經(jīng)無菌處理。5）試劑：禽流感病毒抗原快速檢測卡和加有抗生索的PH7.4等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)A、PH7.4的等滲磷酸鹽緩沖液配制方法：NaCI（氯化鈉）8.0g

NaH2PO4

(磷酸二氫鈉)

1.561g

Na2HP04（

磷酸氫二鈉

）

3.582g

將上列試劑按次序加入定量容器中，加適量蒸餾水溶解后，再定容至1000mL，調(diào)PH值至7.4，高壓消毒滅菌20分鐘，冷卻后，保存于4℃冰箱中備用。B、棉拭子用抗生素PBS(病毒保存液)的配制：

取上述PBS液，按要求加入下列抗生素：咽喉拭子用PBS液中加入青霉素(2000IU/mL)、鏈霉素(2mg/mL)、丁胺卡那霉素(1O00IU/mL)、制霉菌素(1O00IU/mL)。糞便和泄殖腔拭子所用的PBS中抗生素濃度應提高5倍。加入抗生素后應調(diào)PH值至7.4。在采樣前分裝小離心管，每管中加這種PBS

1.0～1.3mL，采糞便時在小離心管中加這種PBS

1.0～1.5mL，采樣前冷凍保存。6）記錄和防護材料

不干膠標簽、簽字筆、記號筆、采樣單、記錄本等；口罩、一次性乳膠手套、防護服、防護帽、膠靴等。

3、樣品采集1）基本要求

應從死禽和處于急性發(fā)病期的病禽采集樣品，樣品要具有典型性。采樣過程要注意無菌操作，同時避免污染環(huán)境。采樣人員要加強個人防護。2）血清樣品：心臟或翅靜脈采血，每只病禽采血樣2mL～3mL，盛于1Oml離心管中，經(jīng)離心或自然放置析出血清后，將血清移到另外小離心管中封好口，貼好標簽。不同禽只的血樣不能混合。3）拭子樣品：每只采集泄殖腔拭子和咽喉拭子各1個，將采集的樣品端剪下置于含有抗生素的PBS液(加1.OmL～1.3mL

PBS)小離心管中，封好口，貼好標簽。.4）泄殖腔拭子采集方法：棉拭子插入泄殖腔約1.5～2cm，并在內(nèi)壁上反復旋轉(zhuǎn)擦拭3圈以上后，沾上糞便。取出，插入裝有PBS液的離心管內(nèi)，剪掉露出部分，蓋緊瓶蓋，作好標記。5）咽喉拭子采集方法：將棉拭子插入口腔至咽的后部直達喉氣管，輕輕擦拭并慢慢旋轉(zhuǎn)3圈以上，取出，插入有PBS液的離心管內(nèi)，剪掉露出部分，蓋緊瓶蓋，作好標記。6）鼻腔拭子采集方法：先將豬保定，將棉拭子插入豬鼻腔內(nèi)，輕輕擦拭并慢慢旋轉(zhuǎn)3圈以上，沾上鼻內(nèi)分泌物。然后將蘸有分泌物的拭子浸入PBS液中，剪掉露出部分，蓋緊瓶蓋，作好標記，密封低溫保存。7）糞便樣品：小家禽采泄殖腔拭子容易造成傷害，可只采集每個樣品1g-2g新鮮糞便樣品，置于內(nèi)含有抗生素PBS(加lmL～1.5mL

PBS)的離心管中，封好口，貼好標簽。保存糞便和泄殖腔拭子的PBS中抗生素濃度提高5倍。

8）病料樣品應采集組織樣品。取死亡不久的病死禽采樣。每只禽采集腸管及腸內(nèi)容物1份；肺和氣管樣品1份；肝、脾、腎、腦等各l份并分別采集。上述每個樣品取樣重量為15g～20g，放于樣品袋或平皿中，如果重量不夠可取全部臟器(如脾臟)。

不同禽只臟器不能混樣，同一禽只不同臟器不應混樣。樣品采集完后將樣品封口，貼好標簽。9）整禽采樣

適于禽主或獸醫(yī)部門采樣。將病死禽或病禽裝入塑料袋內(nèi)，至少用兩層塑料袋包裝，同時和血清樣品一起用保溫箱加冰袋密封包裝，由采樣人員12小時內(nèi)帶回或送到實驗室。要求死禽和病禽總數(shù)不少于5只。10）采樣單及標簽等的填寫

樣品信息詳見附表《動物血清、組織（拭子）樣品采集送檢單》，采樣單應用鋼筆或簽字筆逐項填寫(一式三份)，樣品標簽和封條應用記號筆填寫，保溫容器外封條應用鋼筆或簽字筆填寫，小離心管上用記號筆作標記。應將采樣單和病史資料裝在塑料包裝袋中，隨樣品一起送到實驗室。11）包裝要求：

每個組織樣品應仔細分別包裝，在樣品袋外面貼上標簽，標簽注明樣品名、樣品編號、采樣日期等。再將各個樣品放到塑料包裝袋中。

拭子樣品：小離心管應放在特定的塑料盒內(nèi)。

血清樣品：裝于小離心管中，再裝袋封存。

包裝袋外、塑料盒應貼封條，封條上應有采樣人簽章，并注明貼封日期，標注放置方向，切勿倒置。

4、保存和運輸1）樣品應置于保溫容器中運輸，保溫容器應密封，防止?jié)B漏。一般使用保溫箱，保溫容器外貼封條，封條有貼封人(單位)簽字(蓋章)，并注明貼封日期。2）樣品應在特定的溫度下運輸，拭子樣品和組織樣品應作暫時的冷藏或冷凍處理，然后運送實驗室。

若能在4小時內(nèi)送到實驗室，可用冰袋冷藏運輸。

如果超過4小時，應作冷凍處理，先將樣品置于-30℃凍結(jié)，然后再在保溫箱內(nèi)加冰袋運輸，經(jīng)凍結(jié)的樣品必須在24小時內(nèi)送到。

若24小時不能送到實驗室，則運輸過程中環(huán)境溫度應保持在-20℃以下。3）血清樣品要單獨存放。若24小時內(nèi)運達實驗室，在保溫箱內(nèi)加冰袋冷藏運輸；若超過24小時，要先冷凍后，在保溫箱內(nèi)加大量冰袋運輸，途中不能超過48小時。

4）各種樣品到達實驗室后，若暫時不進行處理，則應冷凍(以-7O℃或以下為宜)保存，不應反復凍融。咽喉拭子的采集雞咽喉拭子的采集雞咽喉拭子的采集泄殖腔拭子的采集特別說明1、各鄉(xiāng)鎮(zhèn)所采樣品自己編號，應注明采樣地點，詳細至鄉(xiāng)、村、社和場，并注明畜主姓名。動物代號：豬A、牛B、羊C、雞D、鴨E、鵝F、其它G。咽喉拭子代號：用Y代表泄殖腔拭子代號：用X代表糞便代號：用V代表鼻腔拭子代號：用Q代表2、從同一頭（只）畜禽采取的血清、咽喉拭子、泄殖腔拭子，編號應一致。例：某鎮(zhèn)一養(yǎng)雞場第5個雞的血清樣品為D5，那么，它的咽喉拭子則為DY5，泄殖腔拭子為DX5；本次要求將咽喉拭子和泄殖腔拭子裝在同一個離心管內(nèi)，故編號為：DXY5。某鄉(xiāng)豬場第15個豬血清編號為A15，那么它的鼻腔拭子編號則為：AQ15。宣漢縣動物疫控中心動物血清、組織（拭子）樣品采集送檢單送檢單位：

送檢人：

送檢時間：

單位：頭、只動物種類存欄量采樣地點（村、場、畜主）樣品名稱及編號免疫情況健康狀況備注免疫病種免疫時間疫苗種類生產(chǎn)廠家批號采樣單位：采樣時間：采樣人（簽字）：六、人員防護（一）診斷、采樣、撲殺、消毒及無害化處理人員的防護：1、進入感染或可能感染場地和無害化處理地點：1）穿防護服；2）戴可消毒的橡膠手套；3）戴N95口罩或標準用手術口罩；4）戴護目鏡；5）穿膠靴。2、離開感染或可能感染場地和無害化處理地點：1）工作完畢后，對場地