動物基因組學(xué)基礎(chǔ)課件

第八章

動物基因組學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)

動物遺傳標(biāo)記一

遺傳標(biāo)記的概念及其發(fā)展

（一）遺傳標(biāo)記的概念

遺傳標(biāo)記是指能夠用以區(qū)別生物個體或群體及其特定基因型、并能穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)標(biāo)志。遺傳標(biāo)記是一些等位基因或遺傳物質(zhì)，能在生物體上以各種形式表現(xiàn)出各種變異。遺傳標(biāo)記的概念經(jīng)歷了從宏觀到微觀、從外部到內(nèi)部、從蛋白質(zhì)到DNA的發(fā)展過程。1第八章

動物基因組學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)

動物遺傳標(biāo)記1

（二）遺傳標(biāo)記概念的發(fā)展

□形態(tài)學(xué)標(biāo)記

能用肉眼觀察和識別的外部性狀。例如，動物的毛色、角形、耳型、體型、外貌等。此法簡單直觀，但標(biāo)記數(shù)目少、多態(tài)性低、易受環(huán)境影響。

□細(xì)胞遺傳標(biāo)記

主要是指染色體核型（染色體的數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型和數(shù)量的變異。此法能反映出染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的多態(tài)性，但由于這些變異往往帶來有害的表型效應(yīng)，生物難以忍受。2

（二）遺傳標(biāo)記概念的發(fā)展2

□免疫遺傳標(biāo)記

以動物的免疫學(xué)特征為標(biāo)記，主要是紅細(xì)胞抗原多態(tài)性和白細(xì)胞抗原多態(tài)性?！ぜt細(xì)胞抗原多態(tài)性——血型，以細(xì)胞表面的抗原而定·白細(xì)胞抗原多態(tài)性——主要組織兼容性復(fù)合體（MHC），以白細(xì)胞表面的抗原而定?！跎z傳標(biāo)記（蛋白質(zhì)多態(tài)性標(biāo)記）

同一種動物中，具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體，有些可以用電泳方法區(qū)分其中的差異。3

□免疫遺傳標(biāo)記3

□

分子遺傳標(biāo)記

○分子遺傳標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，又稱DNA分子標(biāo)記或多態(tài)性DNA標(biāo)記。

○自20世紀(jì)70年代以來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了多種分子遺傳標(biāo)記檢測技術(shù)，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。

○分子遺傳標(biāo)記的特點：遺傳多態(tài)性高；檢測方法簡單快捷；遺傳共顯性，能分離出等位基因的三種基因型。4

□

分子遺傳標(biāo)記4

二、分子遺傳標(biāo)記

（一）限制性片段長度多態(tài)性（restictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）○RFLPRFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標(biāo)記。原理：用限制性內(nèi)切酶切割不同個體的DNA時，如果存在酶切位點的變化，就會產(chǎn)生長度不同的DNA片段，電泳后用克隆探針檢測時，就會出現(xiàn)泳動行為的改變。

基本過程：取得DNA樣本——酶切——電泳——轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上——DNA探針雜交——放射自顯影5

二、分子遺傳標(biāo)記5圖7-1Southern雜交過程6圖7-1Southern雜交過程6圖7-2RFLP檢測7圖7-2RFLP檢測7

○聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是1985年建立的一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。

原理：在反應(yīng)溫度為90—95℃時，DNA變性成為單鏈；反應(yīng)溫度降至45—65℃時，兩種引物與兩條單鏈DNA退火而配對結(jié)合；反應(yīng)溫度升至72℃左右時，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以單鏈DNA為模板逐步延伸成新的單鏈?！白冃浴嘶稹由臁边@一循環(huán)完成后，DNA復(fù)制了一次，由一個DNA分子成為兩個DNA分子。8○聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasecha圖7-3DNA

擴(kuò)增原理9圖7-3DNA

擴(kuò)增原理9

○PCR—RFLP

如果已知多態(tài)性位點周圍的DNA序列，則可用PCR快速而簡單地進(jìn)行RFLP分析。首先根據(jù)多態(tài)位點兩側(cè)序列設(shè)計和合成引物；以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行消化；再進(jìn)行電泳，分析PCR區(qū)帶判斷多態(tài)性。

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○PCR—RFLP10圖7-4PCR—RFLP11圖7-4PCR—RFLP11

（二）串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（tandemrepeatedsequence,TRS）

○真核基因組序列

單一序列

短片段重復(fù)序列（正向重復(fù)、反向重復(fù)、回文序列）

長片段重復(fù)序列（輕度重復(fù)、中度重復(fù)、高度重復(fù)）

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（二）串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（tandemrepeateds

高度重復(fù)序列

衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）序列中G-C含量約30%，遠(yuǎn)低于基因組中主體DNA（G-C含量約42%）。將DNA切成片段進(jìn)行氯化銫密度梯度離心時，由于富含A-T浮力密度小，形成一條窄帶在主體DNA外面，故稱衛(wèi)星DNA。

小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）

微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）13

高度重復(fù)序列13圖7-6衛(wèi)星DNA14圖7-6衛(wèi)星DNA14

○小衛(wèi)星標(biāo)記

小衛(wèi)星DNA是一種可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)（variblenumberoftandemrepeats,VNTR），在不同個體和基因組的不同位點上數(shù)目都不同。

用內(nèi)切酶把總DNA切成不同長度的片段（VNTR上沒有酶切位點），再以VNTR中的特殊序列為探針進(jìn)行Southern雜交，由于不同個體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目及位置不同，所以VNTR的Southern雜交譜帶具有高度的個體特異性，故又稱其為DNA指紋（DNAfingerprints）。15○小衛(wèi)星標(biāo)記15

○微衛(wèi)星標(biāo)記

微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），重復(fù)單位的核心序列為2—6bp。

以微衛(wèi)星DNA兩側(cè)特異性序列設(shè)計探針，用PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，不同個體因核心序列重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。16

○微衛(wèi)星標(biāo)記16真核生物基因組序列17真核生物基因組序列17一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果18一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果18

（三）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidepolymorphism,SNP）

SNP與RFLP、STR等標(biāo)記不同之處在于不以“長度”差別為檢測手段，而是直接以序列的變異作為標(biāo)記。

基因組DNA某一特定的核苷酸位置上，可能發(fā)生單個堿基的變化，如轉(zhuǎn)換、顛換等，使得群體中基因組的某些位點上存在差異。

SNP就是指基因組內(nèi)特定的核苷酸位置上存在兩種以上不同的核苷酸，其中最少一種在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1%（低于1%則視為突變）。

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（三）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucle

SNP是出現(xiàn)頻率最高的標(biāo)記，人類基因組中平均每1000bp中就有1個SNP，總數(shù)可達(dá)300萬個。位于基因表達(dá)序列內(nèi)的SNP可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，對分析基因與性狀的關(guān)系有重要意義。SNP是單堿基突變，任何用于單堿基突變的技術(shù)都可用于SNP檢測，如RFLP、DNA序列分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）等。最先進(jìn)的是微數(shù)列矩陣DNA芯片（DNAchip）技術(shù)。

20SNP是出現(xiàn)頻率最高的標(biāo)記，人類基因組中平均每10

三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用

○個體及親緣關(guān)系的鑒定DNA指紋○遺傳資源的評估、監(jiān)測、保護(hù)和利用○基因定位和遺傳圖譜的構(gòu)建○標(biāo)記輔助選擇21

三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用21

第二節(jié)

基因組作圖一、基本概念

○基因組作圖主要分兩個范疇：遺傳作圖（geneticsmapping）和物理作圖（physicalmapping）。

○作圖需要界標(biāo)（landmark）或遺傳標(biāo)記（geneticsmarker）。常用的遺傳標(biāo)記（血型、蛋白質(zhì)多態(tài)型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期構(gòu)建遺傳圖時常用作制圖的界標(biāo)?，F(xiàn)在主要采用以下的界標(biāo)：限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）微衛(wèi)星DNA多態(tài)性界標(biāo)單核苷酸多態(tài)性（SNP）界標(biāo)非多態(tài)的短單一序列作為界標(biāo)22

第二節(jié)

基因組作圖22

二、遺傳圖

（一）基本概念

應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上位置的圖。

方法是以多態(tài)的遺傳標(biāo)記作為界標(biāo)，計算細(xì)胞減數(shù)分裂過程中遺傳標(biāo)記之間發(fā)生重組的頻率，來確定兩個遺傳標(biāo)記在染色體上的相對位置。

遺傳標(biāo)記之間的相對距離即圖距以厘摩（cM，厘摩爾根，centi-Morgan）為單位。當(dāng)兩個遺傳標(biāo)記之間的重組值為1%時，圖距即為1cM。23

二、遺傳圖23

經(jīng)典遺傳圖的作圖最常用的是三點測交法。

現(xiàn)代遺傳圖的概念是于1980年提出的，就是將單純的表型多態(tài)性界標(biāo)改變?yōu)橐訢NA序列的多態(tài)作為作圖界標(biāo)。

各種遺傳界標(biāo)可在國際互聯(lián)網(wǎng)上可以查閱（）。

當(dāng)用DNA序列多態(tài)作為界標(biāo)的遺傳圖時，一但確定該DNA界標(biāo)與某一基因的具體位置，便可分離克隆這個基因。

人類第一張以RFLP為界標(biāo)的遺傳圖發(fā)表于1987年。24經(jīng)典遺傳圖的作圖最常用的是三點測交法。24

（二）遺傳圖的局限性

分辨率有限

高等真核生物子代數(shù)量有限，只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨率受很大限制

人類基因組測序要求每100kb有一個標(biāo)記，1996年發(fā)表的人類遺傳圖達(dá)到每0.6Mb一個標(biāo)記（1Mb=1000kb）

精確度較低

假設(shè)交換是隨機發(fā)生的，但由于交換熱點的存在使某一區(qū)段的交換頻率遠(yuǎn)高于其它區(qū)段，無法繪制精確的遺傳圖。

25

25

三、物理圖（一）基本概念

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來直接分析DNA分子，從而構(gòu)建能顯示包括基因在內(nèi)的序列特征的位置圖。

以特定的DNA序列為界標(biāo)直接排列在基因組DNA分子上，這些特定的DNA序列可以是多態(tài)的（如RFLP），但主要是非多態(tài)的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。

物理圖中界標(biāo)之間的距離單位依作圖方法而定，輻射育種作圖單位為厘鐳（cR），限制性作圖單位元以物理長度，即堿基對數(shù)目（bp、kb）來表示。26

三、物理圖26

（二）作圖的基本方法

1．限制性作圖——將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置上。

限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅲ型酶位點特殊性不強，Ⅱ型專一性很強。

6bp識別序列的限制性內(nèi)切酶適用于50kb以下的DNA分子作圖。

限制性作圖方法是：比較一個DNA分子被兩種酶切割產(chǎn)生的兩套片段。27

（二）作圖的基本方法27圖7-16限制性內(nèi)切酶28圖7-16限制性內(nèi)切酶28

3．序列標(biāo)記位點（sequencetaggedsite,STS）作圖——通過PCR或分子雜交將小段DNA順序定位在基因組的DNA區(qū)段中。是目前用于構(gòu)建最為詳盡的大基因組物理圖的主流技術(shù)?！餝TS作圖原理

STS是一段短的DNA序列（100—500）bp，每個基因組只有一個拷貝。

當(dāng)兩個片段含有同一STS時，可確認(rèn)這兩個片段重疊。

兩個不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機會取決于它們在基因組中的位置，彼此接近，同時出現(xiàn)在同一片段的機會就大，反之則小。

兩個標(biāo)記間的圖距根據(jù)分離頻率來計算。29

3．序列標(biāo)記位點（sequencetagged○STS的種類

⑴表達(dá)序列標(biāo)記（expressedsequencetag,EST），是從cDNA克隆中獲得的短序列。EST是獲得基因序列的簡捷方法。

⑵簡單序列長度多態(tài)性（SSLP，小衛(wèi)星和微衛(wèi)星）。

⑶隨機基因組序列，從克隆的基因組DNA中隨機測序獲得。30○STS的種類30

第三節(jié)

基因定位方法

動物有幾十條染色體，有幾萬個基因，平均每條染色體有上千個基因。

確定基因在哪一條染色體的哪一個座位上就是基因定位。 將定位的基因標(biāo)注在染色體上就可得到基因圖（genemap）

基因定位與基因組作圖和基因克隆關(guān)系密切：基因定位后可以作為一個界標(biāo)；確定基因的位置后就可按圖去分離克隆基因不同生物的基因定位方法不完全相同?；蚨ㄎ坏姆椒S著遺傳學(xué)的發(fā)展而進(jìn)步。31

第三節(jié)

基因定位方法31一、質(zhì)量性狀的基因定位

質(zhì)量性狀——從表型上可以明顯區(qū)分為不同類型的性狀。（一）家系分析定位法

性連鎖分析是最常用的方法。哺乳動物中只出現(xiàn)在雄性的性狀，控制該性狀的基因在Y染色體上。性狀出現(xiàn)隔代交叉遺傳、且雄性出現(xiàn)比例高于雌性，則控制該性狀的基因在Y染色體上。（二）遺傳重組值定位法

摩爾根提出的方法，根據(jù)基因間的重組值與遺傳距離成正比的原理，采用兩點測交和三點測交的方法進(jìn)行基因定位。32一、質(zhì)量性狀的基因定位32

（三）體細(xì)胞雜交定位法

不同物種細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞會出現(xiàn)排除某一親本染色體的現(xiàn)象，在人鼠雜種細(xì)胞常專一性地排除人的染色體。可以制備含一條（或少數(shù)幾條）人染色體的雜種細(xì)胞?！鸲ㄎ粶y驗法

鑒別雜種細(xì)胞中保留了哪些人染色體，測定雜種細(xì)胞產(chǎn)生了哪些基因產(chǎn)物，經(jīng)分析可將基因定位在哪一條染色體上。33

（三）體細(xì)胞雜交定位法33（四）原位雜交定位

將待定位基因的特定DNA序列或該基因轉(zhuǎn)錄的RNA作為探針，在標(biāo)記了放射性同位素或非放射性化學(xué)物質(zhì)后，與變性后的染色體DNA雜交，該探針就會同染色體DNA與其互補的序列結(jié)合成為雙鏈，通過放射自顯影或顯色技術(shù)，就可確定探針（即待定基因）在染色體上的位置。34（四）原位雜交定位34二、數(shù)量性狀的基因定位

○數(shù)量性狀——由微效多基因控制的呈連續(xù)變異的性狀。由于每個基因效應(yīng)值都較小，無法闡明單個基因的行為和效應(yīng)，只能當(dāng)作一個整體來分析。同時，對控制數(shù)量性狀的基因數(shù)目不能準(zhǔn)確估計，不能用提供基因的實際位置和功能上的信息。

隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展，極大地深化了數(shù)量遺傳學(xué)的理倫，提供了在DNA水平研究數(shù)量性狀的先進(jìn)技術(shù)。35二、數(shù)量性狀的基因定位35

○主效基因——對某一數(shù)量性狀具有很大的效應(yīng)的等位基因。由于自發(fā)或誘發(fā)突變引起明顯的形態(tài)學(xué)上的變異。如豬的氟烷基因、牛的雙肌基因等?！饠?shù)量性狀基因位點（QTL）

具有相同或相關(guān)功能的基因往往分布在某一染色體區(qū)域內(nèi)，從而形成基因群?？刂仆恍誀畹奈⑿Щ蚩赡艽嬖谟谟邢薜膸讉€基因群內(nèi)，而一基因群占據(jù)染色體的一定區(qū)域，稱作數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitlocus,QTL）

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○主效基因——對某一數(shù)量性狀具有很大的效應(yīng)的等位基

一些QTL可以對數(shù)量性狀有較大的影響（對數(shù)量性狀的影響超過表型值方差的5%），因而具有選擇價值一個數(shù)量性狀往往受多個QTL的影響，這些QTL分布在基因組的不同位置上。利用特定的遺傳標(biāo)記可以確定影響某一性狀的QTL在染色體上的數(shù)目、位置及其遺傳效應(yīng)，這就是QTL作圖或稱QTL定位QTL作圖原理：利用特定遺傳分離群體中的遺傳標(biāo)記及相應(yīng)的數(shù)量性狀觀察值，分析遺傳標(biāo)記與性狀之間的連鎖關(guān)系。如果證明遺傳標(biāo)記與性狀連鎖，則可認(rèn)定標(biāo)記附近存在一個或幾個QTL37

一些QTL可以對數(shù)量性狀有較大的影響（對數(shù)量性狀的影

QTL作圖步驟：

⑴構(gòu)建作圖群體——該群體待測的數(shù)量性狀存在廣泛變異，如F2群體⑵選用合適的遺傳標(biāo)記——須具備4個特征：數(shù)量豐富，多態(tài)性好，中性，共顯性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等⑶測定標(biāo)記的基因型，制作標(biāo)記的遺傳圖譜——應(yīng)含有P1，P2和雜合型三種帶型（即三種基因型）。⑷測量數(shù)量性狀——測定遺傳標(biāo)記時，測定其數(shù)量性狀值⑸統(tǒng)計分析——單標(biāo)記分析、雙分子標(biāo)記分析、多分子標(biāo)記分析。38

QTL作圖步驟：38定位QTL主要有兩種方法：

基因組掃描——利用遺傳上差異較大的品種進(jìn)行雜交，跟蹤性狀和染色體上的標(biāo)記在多世代家系中的分離情況。

候選基因法——不需特定品種的雜交，只要發(fā)現(xiàn)一個候選基因位點上存在多態(tài)性，便可直接在商業(yè)品系中研究該多態(tài)性與目標(biāo)性狀之間的相關(guān)性。39定位QTL主要有兩種方法：39

QTL的性質(zhì)

⑴QTL可能是一個基因，也可能是幾個基因；⑵數(shù)量性狀受為數(shù)不多、效應(yīng)不等的幾個QTL影響。少數(shù)位點對性狀變異貢獻(xiàn)很大⑶由于不同群體的遺傳背景不同，根據(jù)不同群體確定的QTL會有差異⑷統(tǒng)計分析確定的QTL的位置并非物理上的位置40

QTL的性質(zhì)40

QTL的應(yīng)用

⑴由QTL得到的遺傳圖可進(jìn)一步換算成物理圖，對QTL進(jìn)行克隆和序列分析，研究控制數(shù)量性狀的基因結(jié)構(gòu)和功能。⑵在育種上進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，利用標(biāo)記與性狀的連鎖提早進(jìn)行識別和選擇。⑶利用標(biāo)記與性狀的連鎖分析，可以提供與雜種優(yōu)勢有關(guān)的信息，鑒定與優(yōu)勢有關(guān)的位點，確定親本在QTL上的差異，可能預(yù)測雜種優(yōu)勢。41

QTL的應(yīng)用41

第四節(jié)

動物基因組學(xué)一、基因組研究的新學(xué)科

基因組學(xué)（genomics）——研究基因組結(jié)構(gòu)與功能的分支學(xué)科，又分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。

轉(zhuǎn)錄物組學(xué)（transcriptomics）——研究某一時刻某一細(xì)胞里基因組產(chǎn)生的全部轉(zhuǎn)錄物的種類、結(jié)構(gòu)和功能。

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）——研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的學(xué)科。

表型組學(xué)（phenomics）——研究生物體整個表型形成的機制。42

第四節(jié)

動物基因組學(xué)42二、人類基因組計劃

○美國于1990年由能源部和國立衛(wèi)生研究院起動了預(yù)算耗時15年、經(jīng)費30億美元的人類基因組計劃○2001年2月15日，由中、美、英、法、德、日等6國科學(xué)家組成的“人類基因組測序國際協(xié)作組”，在《自然》雜志上發(fā)表了關(guān)于人類基因組框架圖的數(shù)據(jù)；次日，美國CeleraGenomics公司的也公布了人類基因組框架圖的數(shù)據(jù)。有關(guān)人類遺傳本性的“生命之書”的誕生，是生命科學(xué)發(fā)展史上的一個重要里程碑。43二、人類基因組計劃43

○人類基因組計劃的主要內(nèi)容

⑴基因組作圖——繪制遺傳圖，物理圖。

⑵測序——測定全基因組DNA分子的核苷酸序列，繪制序列圖。

⑶基因識別——識別出基因序列，設(shè)法克隆基因，研究基因功能。

⑷模式生物研究——大腸桿菌、酵母菌、線蟲、果蠅、小鼠等。

⑸發(fā)展生物信息學(xué)和計算生物學(xué)

⑹基因組對倫理、法律和社會產(chǎn)生的影響

44○人類基因組計劃的主要內(nèi)容44

三、動物基因組計劃及其應(yīng)用前景

先后開展豬、牛、綿羊、雞等動物的基因組研究，目標(biāo)大致相同?！鹭i基因組計劃的目標(biāo)

構(gòu)建遺傳圖——復(fù)蓋基因組90%以上，標(biāo)記間距20cM左右的遺傳圖；

構(gòu)建標(biāo)記位點——每條染色體臂至少一個遠(yuǎn)端和近端的標(biāo)記；

·開發(fā)豬染色體激光流動分型技術(shù)；·開發(fā)快速測定多態(tài)分子的PCR技術(shù)；·開發(fā)和評估用于分析QTL作圖試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法……

45

三、動物基因組計劃及其應(yīng)用前景45

○應(yīng)用前景

·

基因診斷——檢測基因型，區(qū)分顯性純合體和帶缺陷隱性基因的雜合體，從而淘汰隱性基因。

·

標(biāo)記輔助選擇和標(biāo)記輔助導(dǎo)入基因——

標(biāo)記輔助選擇是利用與影響性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記來進(jìn)行選擇。

標(biāo)記輔助導(dǎo)入基因是指檢測雜種后代的基因型，選留帶有所需基因的雜種個體作種用，再與親本回交……，多次重復(fù)可將基因?qū)??！ぱ芯康胤狡贩N種質(zhì)特性46

○應(yīng)用前景46第八章

動物基因組學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)

動物遺傳標(biāo)記一

遺傳標(biāo)記的概念及其發(fā)展

（一）遺傳標(biāo)記的概念

遺傳標(biāo)記是指能夠用以區(qū)別生物個體或群體及其特定基因型、并能穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)標(biāo)志。遺傳標(biāo)記是一些等位基因或遺傳物質(zhì)，能在生物體上以各種形式表現(xiàn)出各種變異。遺傳標(biāo)記的概念經(jīng)歷了從宏觀到微觀、從外部到內(nèi)部、從蛋白質(zhì)到DNA的發(fā)展過程。47第八章

動物基因組學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)

動物遺傳標(biāo)記1

（二）遺傳標(biāo)記概念的發(fā)展

□形態(tài)學(xué)標(biāo)記

能用肉眼觀察和識別的外部性狀。例如，動物的毛色、角形、耳型、體型、外貌等。此法簡單直觀，但標(biāo)記數(shù)目少、多態(tài)性低、易受環(huán)境影響。

□細(xì)胞遺傳標(biāo)記

主要是指染色體核型（染色體的數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型和數(shù)量的變異。此法能反映出染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的多態(tài)性，但由于這些變異往往帶來有害的表型效應(yīng)，生物難以忍受。48

（二）遺傳標(biāo)記概念的發(fā)展2

□免疫遺傳標(biāo)記

以動物的免疫學(xué)特征為標(biāo)記，主要是紅細(xì)胞抗原多態(tài)性和白細(xì)胞抗原多態(tài)性?！ぜt細(xì)胞抗原多態(tài)性——血型，以細(xì)胞表面的抗原而定·白細(xì)胞抗原多態(tài)性——主要組織兼容性復(fù)合體（MHC），以白細(xì)胞表面的抗原而定?！跎z傳標(biāo)記（蛋白質(zhì)多態(tài)性標(biāo)記）

同一種動物中，具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體，有些可以用電泳方法區(qū)分其中的差異。49

□免疫遺傳標(biāo)記3

□

分子遺傳標(biāo)記

○分子遺傳標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，又稱DNA分子標(biāo)記或多態(tài)性DNA標(biāo)記。

○自20世紀(jì)70年代以來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了多種分子遺傳標(biāo)記檢測技術(shù)，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。

○分子遺傳標(biāo)記的特點：遺傳多態(tài)性高；檢測方法簡單快捷；遺傳共顯性，能分離出等位基因的三種基因型。50

□

分子遺傳標(biāo)記4

二、分子遺傳標(biāo)記

（一）限制性片段長度多態(tài)性（restictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）○RFLPRFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標(biāo)記。原理：用限制性內(nèi)切酶切割不同個體的DNA時，如果存在酶切位點的變化，就會產(chǎn)生長度不同的DNA片段，電泳后用克隆探針檢測時，就會出現(xiàn)泳動行為的改變。

基本過程：取得DNA樣本——酶切——電泳——轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上——DNA探針雜交——放射自顯影51

二、分子遺傳標(biāo)記5圖7-1Southern雜交過程52圖7-1Southern雜交過程6圖7-2RFLP檢測53圖7-2RFLP檢測7

○聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是1985年建立的一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。

原理：在反應(yīng)溫度為90—95℃時，DNA變性成為單鏈；反應(yīng)溫度降至45—65℃時，兩種引物與兩條單鏈DNA退火而配對結(jié)合；反應(yīng)溫度升至72℃左右時，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以單鏈DNA為模板逐步延伸成新的單鏈?！白冃浴嘶稹由臁边@一循環(huán)完成后，DNA復(fù)制了一次，由一個DNA分子成為兩個DNA分子。54○聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasecha圖7-3DNA

擴(kuò)增原理55圖7-3DNA

擴(kuò)增原理9

○PCR—RFLP

如果已知多態(tài)性位點周圍的DNA序列，則可用PCR快速而簡單地進(jìn)行RFLP分析。首先根據(jù)多態(tài)位點兩側(cè)序列設(shè)計和合成引物；以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行消化；再進(jìn)行電泳，分析PCR區(qū)帶判斷多態(tài)性。

56

○PCR—RFLP10圖7-4PCR—RFLP57圖7-4PCR—RFLP11

（二）串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（tandemrepeatedsequence,TRS）

○真核基因組序列

單一序列

短片段重復(fù)序列（正向重復(fù)、反向重復(fù)、回文序列）

長片段重復(fù)序列（輕度重復(fù)、中度重復(fù)、高度重復(fù)）

58

（二）串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（tandemrepeateds

高度重復(fù)序列

衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）序列中G-C含量約30%，遠(yuǎn)低于基因組中主體DNA（G-C含量約42%）。將DNA切成片段進(jìn)行氯化銫密度梯度離心時，由于富含A-T浮力密度小，形成一條窄帶在主體DNA外面，故稱衛(wèi)星DNA。

小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）

微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）59

高度重復(fù)序列13圖7-6衛(wèi)星DNA60圖7-6衛(wèi)星DNA14

○小衛(wèi)星標(biāo)記

小衛(wèi)星DNA是一種可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)（variblenumberoftandemrepeats,VNTR），在不同個體和基因組的不同位點上數(shù)目都不同。

用內(nèi)切酶把總DNA切成不同長度的片段（VNTR上沒有酶切位點），再以VNTR中的特殊序列為探針進(jìn)行Southern雜交，由于不同個體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目及位置不同，所以VNTR的Southern雜交譜帶具有高度的個體特異性，故又稱其為DNA指紋（DNAfingerprints）。61○小衛(wèi)星標(biāo)記15

○微衛(wèi)星標(biāo)記

微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），重復(fù)單位的核心序列為2—6bp。

以微衛(wèi)星DNA兩側(cè)特異性序列設(shè)計探針，用PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，不同個體因核心序列重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。62

○微衛(wèi)星標(biāo)記16真核生物基因組序列63真核生物基因組序列17一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果64一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果18

（三）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidepolymorphism,SNP）

SNP與RFLP、STR等標(biāo)記不同之處在于不以“長度”差別為檢測手段，而是直接以序列的變異作為標(biāo)記。

基因組DNA某一特定的核苷酸位置上，可能發(fā)生單個堿基的變化，如轉(zhuǎn)換、顛換等，使得群體中基因組的某些位點上存在差異。

SNP就是指基因組內(nèi)特定的核苷酸位置上存在兩種以上不同的核苷酸，其中最少一種在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1%（低于1%則視為突變）。

65

（三）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucle

SNP是出現(xiàn)頻率最高的標(biāo)記，人類基因組中平均每1000bp中就有1個SNP，總數(shù)可達(dá)300萬個。位于基因表達(dá)序列內(nèi)的SNP可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，對分析基因與性狀的關(guān)系有重要意義。SNP是單堿基突變，任何用于單堿基突變的技術(shù)都可用于SNP檢測，如RFLP、DNA序列分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）等。最先進(jìn)的是微數(shù)列矩陣DNA芯片（DNAchip）技術(shù)。

66SNP是出現(xiàn)頻率最高的標(biāo)記，人類基因組中平均每10

三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用

○個體及親緣關(guān)系的鑒定DNA指紋○遺傳資源的評估、監(jiān)測、保護(hù)和利用○基因定位和遺傳圖譜的構(gòu)建○標(biāo)記輔助選擇67

三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用21

第二節(jié)

基因組作圖一、基本概念

○基因組作圖主要分兩個范疇：遺傳作圖（geneticsmapping）和物理作圖（physicalmapping）。

○作圖需要界標(biāo)（landmark）或遺傳標(biāo)記（geneticsmarker）。常用的遺傳標(biāo)記（血型、蛋白質(zhì)多態(tài)型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期構(gòu)建遺傳圖時常用作制圖的界標(biāo)。現(xiàn)在主要采用以下的界標(biāo)：限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）微衛(wèi)星DNA多態(tài)性界標(biāo)單核苷酸多態(tài)性（SNP）界標(biāo)非多態(tài)的短單一序列作為界標(biāo)68

第二節(jié)

基因組作圖22

二、遺傳圖

（一）基本概念

應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上位置的圖。

方法是以多態(tài)的遺傳標(biāo)記作為界標(biāo)，計算細(xì)胞減數(shù)分裂過程中遺傳標(biāo)記之間發(fā)生重組的頻率，來確定兩個遺傳標(biāo)記在染色體上的相對位置。

遺傳標(biāo)記之間的相對距離即圖距以厘摩（cM，厘摩爾根，centi-Morgan）為單位。當(dāng)兩個遺傳標(biāo)記之間的重組值為1%時，圖距即為1cM。69

二、遺傳圖23

經(jīng)典遺傳圖的作圖最常用的是三點測交法。

現(xiàn)代遺傳圖的概念是于1980年提出的，就是將單純的表型多態(tài)性界標(biāo)改變?yōu)橐訢NA序列的多態(tài)作為作圖界標(biāo)。

各種遺傳界標(biāo)可在國際互聯(lián)網(wǎng)上可以查閱（）。

當(dāng)用DNA序列多態(tài)作為界標(biāo)的遺傳圖時，一但確定該DNA界標(biāo)與某一基因的具體位置，便可分離克隆這個基因。

人類第一張以RFLP為界標(biāo)的遺傳圖發(fā)表于1987年。70經(jīng)典遺傳圖的作圖最常用的是三點測交法。24

（二）遺傳圖的局限性

分辨率有限

高等真核生物子代數(shù)量有限，只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨率受很大限制

人類基因組測序要求每100kb有一個標(biāo)記，1996年發(fā)表的人類遺傳圖達(dá)到每0.6Mb一個標(biāo)記（1Mb=1000kb）

精確度較低

假設(shè)交換是隨機發(fā)生的，但由于交換熱點的存在使某一區(qū)段的交換頻率遠(yuǎn)高于其它區(qū)段，無法繪制精確的遺傳圖。

71

25

三、物理圖（一）基本概念

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來直接分析DNA分子，從而構(gòu)建能顯示包括基因在內(nèi)的序列特征的位置圖。

以特定的DNA序列為界標(biāo)直接排列在基因組DNA分子上，這些特定的DNA序列可以是多態(tài)的（如RFLP），但主要是非多態(tài)的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。

物理圖中界標(biāo)之間的距離單位依作圖方法而定，輻射育種作圖單位為厘鐳（cR），限制性作圖單位元以物理長度，即堿基對數(shù)目（bp、kb）來表示。72

三、物理圖26

（二）作圖的基本方法

1．限制性作圖——將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置上。

限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅲ型酶位點特殊性不強，Ⅱ型專一性很強。

6bp識別序列的限制性內(nèi)切酶適用于50kb以下的DNA分子作圖。

限制性作圖方法是：比較一個DNA分子被兩種酶切割產(chǎn)生的兩套片段。73

（二）作圖的基本方法27圖7-16限制性內(nèi)切酶74圖7-16限制性內(nèi)切酶28

3．序列標(biāo)記位點（sequencetaggedsite,STS）作圖——通過PCR或分子雜交將小段DNA順序定位在基因組的DNA區(qū)段中。是目前用于構(gòu)建最為詳盡的大基因組物理圖的主流技術(shù)?！餝TS作圖原理

STS是一段短的DNA序列（100—500）bp，每個基因組只有一個拷貝。

當(dāng)兩個片段含有同一STS時，可確認(rèn)這兩個片段重疊。

兩個不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機會取決于它們在基因組中的位置，彼此接近，同時出現(xiàn)在同一片段的機會就大，反之則小。

兩個標(biāo)記間的圖距根據(jù)分離頻率來計算。75

3．序列標(biāo)記位點（sequencetagged○STS的種類

⑴表達(dá)序列標(biāo)記（expressedsequencetag,EST），是從cDNA克隆中獲得的短序列。EST是獲得基因序列的簡捷方法。

⑵簡單序列長度多態(tài)性（SSLP，小衛(wèi)星和微衛(wèi)星）。

⑶隨機基因組序列，從克隆的基因組DNA中隨機測序獲得。76○STS的種類30

第三節(jié)

基因定位方法

動物有幾十條染色體，有幾萬個基因，平均每條染色體有上千個基因。

確定基因在哪一條染色體的哪一個座位上就是基因定位。 將定位的基因標(biāo)注在染色體上就可得到基因圖（genemap）

基因定位與基因組作圖和基因克隆關(guān)系密切：基因定位后可以作為一個界標(biāo)；確定基因的位置后就可按圖去分離克隆基因不同生物的基因定位方法不完全相同。基因定位的方法隨著遺傳學(xué)的發(fā)展而進(jìn)步。77

第三節(jié)

基因定位方法31一、質(zhì)量性狀的基因定位

質(zhì)量性狀——從表型上可以明顯區(qū)分為不同類型的性狀。（一）家系分析定位法

性連鎖分析是最常用的方法。哺乳動物中只出現(xiàn)在雄性的性狀，控制該性狀的基因在Y染色體上。性狀出現(xiàn)隔代交叉遺傳、且雄性出現(xiàn)比例高于雌性，則控制該性狀的基因在Y染色體上。（二）遺傳重組值定位法

摩爾根提出的方法，根據(jù)基因間的重組值與遺傳距離成正比的原理，采用兩點測交和三點測交的方法進(jìn)行基因定位。78一、質(zhì)量性狀的基因定位32

（三）體細(xì)胞雜交定位法

不同物種細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞會出現(xiàn)排除某一親本染色體的現(xiàn)象，在人鼠雜種細(xì)胞常專一性地排除人的染色體?？梢灾苽浜粭l（或少數(shù)幾條）人染色體的雜種細(xì)胞。○定位測驗法

鑒別雜種細(xì)胞中保留了哪些人染色體，測定雜種細(xì)胞產(chǎn)生了哪些基因產(chǎn)物，經(jīng)分析可將基因定位在哪一條染色體上。79

（三）體細(xì)胞雜交定位法33（四）原位雜交定位

將待定位基因的特定DNA序列或該基因轉(zhuǎn)錄的RNA作為探針，在標(biāo)記了放射性同位素或非放射性化學(xué)物質(zhì)后，與變性后的染色體DNA雜交，該探針就會同染色體DNA與其互補的序列結(jié)合成為雙鏈，通過放射自顯影或顯色技術(shù)，就可確定探針（即待定基因）在染色體上的位置。80（四）原位雜交定位34二、數(shù)量性狀的基因定位

○數(shù)量性狀——由微效多基因控制的呈連續(xù)變異的性狀。由于每個基因效應(yīng)值都較小，無法闡明單個基因的行為和效應(yīng)，只能當(dāng)作一個整體來分析。同時，對控制數(shù)量性狀的基因數(shù)目不能準(zhǔn)確估計，不能用提供基因的實際位置和功能上的信息。

隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展，極大地深化了數(shù)量遺傳學(xué)的理倫，提供了在DNA水平研究數(shù)量性狀的先進(jìn)技術(shù)。81二、數(shù)量性狀的基因定位35

○主效基因——對某一數(shù)量性狀具有很大的效應(yīng)的等位基因。由于自發(fā)或誘發(fā)突變引起明顯的形態(tài)學(xué)上的變異。如豬的氟烷基因、牛的雙肌基因等?！饠?shù)量性狀基因位點（QTL）

具有相同或相關(guān)功能的基因往往分布在某一染色體區(qū)域內(nèi)，從而形成基因群?？刂仆恍誀畹奈⑿Щ蚩赡艽嬖谟谟邢薜膸讉€基因群內(nèi)，而一基因群占據(jù)染色體的一定區(qū)域，稱作數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitlocus,QTL）

82

○主效基因——對某一數(shù)量性狀具有很大的效應(yīng)的等位基

一些QTL可以對數(shù)量性狀有較大的影響（對數(shù)量性狀的影響超過表型值方差的5%），因而具有選擇價值一個數(shù)量性狀往往受多個QTL的影響，這些QTL分布在基因組的不同位置上。利用特定的遺傳標(biāo)記可以確定影響某一性狀的QTL在染色體上的數(shù)目、位置及其遺傳效應(yīng)，這就是QTL作圖或稱QTL定位QTL作圖原理：利用特定遺傳分離群體中的遺傳標(biāo)記及相應(yīng)的數(shù)量性狀觀察值，分析遺傳標(biāo)記與性狀之間的連鎖關(guān)系。如果證明遺傳標(biāo)記與性狀連鎖，則可認(rèn)定標(biāo)記附近存在一個或幾個QTL83

一些QTL可以對數(shù)量性狀有較大的影響（對數(shù)量性狀的影

QTL作圖步驟：

⑴構(gòu)建作圖群體——該群體待測的數(shù)量性狀存在廣泛變異，如F2群體⑵選用合適的遺傳標(biāo)記——須具備4個特征：數(shù)量豐富，多態(tài)性好，中性，共顯性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等⑶測定標(biāo)記的基因型，制作標(biāo)記的遺傳圖譜——應(yīng)含有P1，P2和雜合型三種帶型（即三種基因型）。⑷測量數(shù)量性狀——測定遺傳標(biāo)記時，測定其數(shù)量性狀值⑸統(tǒng)計分析——單標(biāo)記分析、雙分子標(biāo)記分析、多分子標(biāo)記分析。84