教學(xué)第十三章-血栓與止血檢驗課件

第十三章血栓與止血檢驗編輯制作熊石龍第十三章血栓與止血檢驗編輯制作熊石龍一、基本理論

血管壁的正常結(jié)構(gòu)包括三層：內(nèi)層、中層和外層內(nèi)層：內(nèi)皮細胞+基底膜內(nèi)皮細胞管壁有肝素類物質(zhì)內(nèi)皮細胞內(nèi)含細胞器（棒狀小體vWF和t-PA，TM，AT-Ⅲ,PAI-1等

）中層：平滑肌細胞（脈細血管無此層）外層：結(jié)締組織血管壁的結(jié)構(gòu)第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗一、基本理論血管壁的正常結(jié)構(gòu)包括三層：內(nèi)層、中層和外層激活血小板激活凝血過程抗血栓特性收縮反應(yīng)血管壁的止血功能第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗一、基本理論激活血小板激活凝血過程抗血栓特性收縮反應(yīng)血管壁的止血功能第十血小板的止血功能第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗

血管損傷（抗血栓特性降低）

血管收縮

激活凝血過程

血流減慢

纖維蛋白形成血管內(nèi)皮下成分暴露血小板黏附、聚集、釋放

血栓形成血小板的止血功能第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗血漿血管性血友病因子抗原vWF:Ag，ELISA法原理純化的兔抗人vWF:Ag抗體包被聚苯乙烯反應(yīng)板，加入稀釋的待測血漿，樣本中的vWF:Ag結(jié)合于固相的抗體上，然后加入酶標(biāo)記兔抗人vWF:Ag抗體，與其定量結(jié)合，洗去多余抗體后，加底物顯色，通過查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算出vWF:Ag的含量。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗二、血管壁（內(nèi)皮）檢驗血漿血管性血友病因子抗原vWF:Ag，ELISA法原理純化的vWF:Ag

操作單抗以0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液（pH9.5）稀釋成10μg/ml加入反應(yīng)板中，每孔0.2ml，置于濕盒中4℃過夜。0.05%Tween—20，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4，Tween—PBS）洗3次后加入用0.4%BSA—PBS稀釋的待測血漿或培養(yǎng)液上清，每孔0.2ml，37℃溫育2小時。同前洗滌3次后，加入用同上緩沖液稀釋的酶標(biāo)vWF單抗，每孔0.2ml，37℃溫育2小時。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗vWF:Ag操作單抗以0.1mol/L的碳酸鹽緩沖vWF:Ag

操作同前洗滌5次后，每孔加底物溶液（OPD1mg/ml，用0.1ml/L，pH4.5的枸櫞酸鹽緩沖液配制，30%過氧化氫0.5μg/ml）0.2ml，置室溫約5分鐘后，各孔加3mol/L硫酸0.05ml終止反應(yīng)。室溫放置10min后在酶標(biāo)儀上測定492nm處的吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線正?；旌涎獫{以0.4%BSA—PBA按1：20、1：50、1：100、1：200、1：500、1：1000六種濃度稀釋，與待測樣品在相同條件下測定。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗vWF:Ag操作同前洗滌5次后，每孔加底物溶液（O參考值：

61.6%～126.6%注意事項對血漿vWF：Ag濃度過高的標(biāo)本，應(yīng)稀釋后再測定。

所有ELISA測定中應(yīng)注意的事項均應(yīng)引起重視。除本方法外，也可以采用膠乳增強免疫比濁法。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗

vWF:Ag

參考區(qū)間參考值：61.6%～126.6%第十三章第一節(jié)血管壁

vWF:Ag

應(yīng)用評價血管性血友病因子抗原測定主要用于血管性血友病的診斷和鑒別診斷

1.減低見于血管性血友病（vWD），是診斷vWD及其分型的重要依據(jù)2.升高見于血栓性疾病，如急性冠脈綜合征（ASC）、心肌梗死、腦血管病變、妊娠高血壓綜合征、腎小球疾病等，同時也見于劇烈運動后，腎上腺素受體被興奮等。應(yīng)用評價以前vWF：Ag定量常采用免疫火箭電泳，由于操作較為復(fù)雜，現(xiàn)在少用。ELISA常用于定量檢測vWF：Ag，但是膠乳增強的免疫比濁法更為簡便快速，而且可以在全自動血凝儀上進行測定。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗vWF:Ag應(yīng)用評價第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用

凝血酶調(diào)節(jié)蛋白，TM

原理將抗人凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomdulin,TM）單克隆抗體包被于聚苯乙烯放免小杯中，樣本中的TM結(jié)合于包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM單抗，根據(jù)結(jié)合的125I放射性強度計算出樣品中TM的含量。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗?zāi)刚{(diào)節(jié)蛋白，TM原理將抗人凝血酶調(diào)TM操作1.繪制校正曲線人TM標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液A做倍比稀釋，TM的濃度分別為500，250，125，31.25，15.6，7.3,3.9和0ng/ml,以人TM濃度為橫坐標(biāo)，以cpm為縱坐標(biāo)繪制校正曲線。2.將200μl的抗人TM單抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，4℃過夜，用洗滌液A洗3次，將待測樣本（或標(biāo)準(zhǔn)品）0.25ml與等量緩沖液A混合，每小杯加入20μl稀釋樣品液（空白管加入緩沖液A），37℃水浴2h，用洗滌液A洗3次，加入200μl125I-抗人TM單抗，37℃水浴2h，再用洗滌液B洗六次，在γ閃爍測定儀上測定放射活性，在校正曲線上查出相應(yīng)的濃度。TM參考區(qū)間25～52μg/L第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗TM操作1.繪制校正曲線人TM標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液ATM是由血管內(nèi)皮細胞合成和分泌釋放的，它表達于血管內(nèi)皮細胞表面，和循環(huán)血液中的凝血酶形成1：1的TM-凝血酶復(fù)合物，此復(fù)合物將蛋白C（PC）激活為活化蛋白C（APC），APC有滅活FⅧa、FⅤa和激活纖溶活性的作用，因此TM對于血管的抗凝作用十分重要。正常情況下，血漿中TM的含量很低，但當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，血漿中的TM含量明顯升高且與內(nèi)皮的損傷程度相關(guān)。目前認(rèn)為，TM:Ag的檢測是了解血管內(nèi)皮損傷最好的指標(biāo)。

TM:Ag的水平升高見于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、腦血栓、深靜脈血栓形成（DVT）、DIC等。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗

TM應(yīng)用評價TM是由血管內(nèi)皮細胞合成和分泌釋放的，它表達TM注意事項

1.如果樣品不能當(dāng)天測定，應(yīng)在采血后立即將血漿分離出放于-20℃冷凍保存。冷凍的樣品復(fù)溶時應(yīng)在37℃水浴中進行，室溫中緩慢解凍則可導(dǎo)致TM沉淀。

2.若樣本中的TM含量超過校正曲線范圍應(yīng)適量稀釋后再次測定。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗TM注意事項第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗血漿6-酮-前列腺素F1α檢測原理ELISA法：將抗原（血漿6-酮-前列腺素F1α-牛血清白蛋白連接物）包被于固相載體上，與游離抗原（待測樣品或6-酮-前列腺素F1α標(biāo)準(zhǔn)品）競爭性地與一定量的抗6-酮-PGF1α抗體結(jié)合，洗滌后加入過量的酶標(biāo)記第二抗體，再加入底物顯色。待檢血漿或標(biāo)準(zhǔn)品中的6-酮-PGF1α含量與顯色程度呈負相關(guān)，根據(jù)顯色程度（A值）即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中推算出待檢血漿中6-酮-PGF1α的含量。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗血漿6-酮-前列腺素F1α檢測原理ELISA法：血漿6-酮-前列腺素F1α檢測操作步驟1.標(biāo)本采集順利采取靜脈血后與5%EDTA-Na2進行9：1抗凝混勻，3000r/min離心20min分離出血漿。2.用碳酸鹽緩沖液將6-酮-PGF1α-BSA作一定稀釋后包被于酶標(biāo)反應(yīng)板，再用0.3%明膠封閉。加入標(biāo)準(zhǔn)品（倍比稀釋成12.5~1600pg/ml濃度）或待測樣品、兔抗6酮-PGF1αIgG100μl后在37℃中溫育2h。洗滌后再加入酶標(biāo)第二抗體200μl在37℃反應(yīng)2h。以O(shè)PD-過氧化氫為基質(zhì)顯色20min，加入3mol/L硫酸中止反應(yīng)，在酶標(biāo)檢測儀上測定490nm處的吸光度值A(chǔ)。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗血漿6-酮-前列腺素F1α檢測操作步驟1.標(biāo)本采集順利采血漿6-酮-前列腺素F1α檢測

參考區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)曲線與計算式中:B為測定管；B0為不加樣品管，最大結(jié)合率管；B/B0為結(jié)合率。以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，B/B0（%）為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品孔B/B0（%）值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出6-酮-PGF1α的含量。樣品6-酮-PGF1α濃度（pg/ml）=測定值×10。參考范圍10.7～25.1pg/ml。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗血漿6-酮-前列腺素F1α檢測參考區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)曲線與計算第十三血漿6-酮-前列腺素F1α檢測應(yīng)用評價

血漿6-酮-前列腺素F1α是血管內(nèi)皮細胞膜上PGG2和PGH2代謝的終末產(chǎn)物，檢測血漿中6-酮-前列腺素F1α的水平能客觀的反映血管內(nèi)皮的功能，有助于對血管內(nèi)皮損傷程度的了解和療效評價。血漿6-酮-前列腺素F1α減低見于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心絞痛、腦血管病變、動脈粥樣硬化、周圍血管血栓形成及血栓性血小板減少性紫癜等。第十三章第一節(jié)血管壁的止血作用及檢驗血漿6-酮-前列腺素F1α檢測應(yīng)用評價血漿6-酮-

了解血小板的超微結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上理解血小板的止血功能。理解并掌握血小板止血功能實驗室檢查的臨床應(yīng)用及評價。學(xué)習(xí)要點第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗第二節(jié)血小板止血作用及檢驗了解血小板的超微結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上理解血小板的止血功能。學(xué)習(xí)一、基本理論

血小板（bloodplatelet）由骨髓中成熟巨核細胞的胞質(zhì)分割生成，是哺乳動物血液中體積最小的血細胞。血小板數(shù)量：(100～300)x109個/L（成年人）。血小板壽命：7～10天。主要功能：促進止血和加速凝血，在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過程中起重要作用。血小板概述第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗一、基本理論血小板（bloodplatelet）由骨血小板結(jié)構(gòu)第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗

光學(xué)顯微鏡：一般表現(xiàn)為多形態(tài)，直徑1～4μm，具有運動和變形能力。瑞氏染色后見血小板胞質(zhì)呈灰藍色或淡紅色，無胞核，中心部位有較多紫紅色嗜苯胺藍顆粒。電子顯微鏡：血小板結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)可分為表面結(jié)構(gòu)、溶膠質(zhì)層結(jié)構(gòu)和細胞器內(nèi)含物三層。血小板結(jié)構(gòu)第十三章第二節(jié)血小板止血作用及1．血小板表面結(jié)構(gòu)由血小板膜、細胞外衣和開放管道系統(tǒng)（opencanalicularsystem，OCS）組成。重要成分：磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）/血細胞第3因子（PF3）血小板膜糖蛋白等。2．溶膠質(zhì)層結(jié)構(gòu)由微管、微絲、致密管道系統(tǒng)等組成。3．細胞器內(nèi)含物結(jié)構(gòu)主要致密顆粒和α-顆粒、溶酶體組成。血小板超微結(jié)構(gòu)—功能基礎(chǔ)第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗1．血小板表面結(jié)構(gòu)由血小板膜、細胞外衣和開放管道系統(tǒng)（o花生四烯酸是膜磷脂代謝產(chǎn)物，其代謝途徑是血小板發(fā)揮聚集止血功能的主要代謝基礎(chǔ)。血小板的花生四烯酸代謝途徑血管內(nèi)皮細胞內(nèi)完成2～3min后前列環(huán)素合成酶血栓烷A2合成酶環(huán)氧化酶花生四烯酸膜磷脂磷脂酶A2前列腺素環(huán)內(nèi)過氧化物PGG2過氧化物酶前列腺素環(huán)內(nèi)過氧化物PGH2前列環(huán)素（PGI2）血栓烷A2（TXA2）30s后6-酮-PGF1α（穩(wěn)定產(chǎn)物）血栓烷B2（TXB2）（穩(wěn)定產(chǎn)物）血小板內(nèi)完成第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗花生四烯酸是膜磷脂代謝產(chǎn)物，其代謝途徑是血小板發(fā)揮聚集止血功血小板粘附促凝作用血小板聚集釋放反應(yīng)血塊收縮血小板的止血功能第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板的止血功能血小板粘附促凝作用血小板聚集釋放反應(yīng)血塊收縮血小板的止血功能血小板的止血功能ADP血小板進一步激活、釋放血塊收縮內(nèi)皮損傷（內(nèi)皮下組織暴露）血小板粘附血小板初期釋放ADP等血小板聚集纖維蛋白形成堅固的凝血塊血小板促凝作用5-HT第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗類別成分活性胺5-HT，組胺，腎上腺素，去甲腎上腺素腺嘌呤核苷酸ADP,ATP,cAMP陽離子Ca2+,K+血小板因子PF3,PF4等凝血因子凝血因子I，V，VIII，XIII血小板蛋白β-TG，血小板糖蛋白等血栓烷TXA2血小板的主要釋放產(chǎn)物血小板的止血功能ADP血小板進一步激活、釋放血塊收縮內(nèi)皮損傷血小板功能的實驗室檢查第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板功能的實驗室檢查第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板粘附實驗PAdT，玻珠柱法原理血小板粘附試驗（plateletadhensiontest，PAdT）利用血小板在體外可黏附于玻璃表面的原理設(shè)計，測定方法有多種，包括玻珠柱法、玻球法等。當(dāng)血液與一定表面積的玻璃接觸一定時間后，血小板粘附于玻璃表面，因此血液中血小板數(shù)會降低。通過計數(shù)接觸前、后的血中血小板數(shù)，即可計算出血小板粘附率。該試驗為判斷血小板粘附能力的常用指標(biāo)。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板粘附實驗PAdT，玻珠柱法原理血小板粘附PAdT操作將玻珠柱管（內(nèi)徑3mm，長9.4cm，內(nèi)裝直徑0.3～0.5mm玻珠1.5g，管兩端封以0.05cm孔徑的尼龍布）與注射器相連；行肘正中靜脈穿刺；當(dāng)血液接觸玻珠時開始計時，掌握好血液通過玻珠柱的速度。在4等分的玻珠柱中，血液通過每段速度為5s，共20s。經(jīng)過玻珠柱后，再按原速抽血5s；采集通過玻珠柱前后的血液，作血小板計數(shù)。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PAdT操作將玻珠柱管（內(nèi)徑3mm，長9.4cm，內(nèi)血小板粘附率（%）=×100%參考值：62.5%±8.6%注意事項取血過程必須順利，掌握血液通過玻珠柱的速度。待用玻珠柱應(yīng)置于干燥器中儲存，受潮后粘附率下降。血小板計數(shù)要準(zhǔn)確，宜作2～3次后取平均值。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗

PAdT參考區(qū)間粘附前血小板數(shù)-粘附后血小板數(shù)粘附前血小板數(shù)血小板粘附率（%）=PAdT應(yīng)用評價血小板粘附率減低：見于先天性和繼發(fā)性血小板功能異常（以后者多見），如血管性血友病、巨大血小板綜合征、愛-唐綜合征、低（無）纖維蛋白血癥、異常纖維蛋白血癥、急性白血病、骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性疾病、肝硬化、尿毒癥、服用抗血小板藥物等。血小板粘附率增高：見于血栓前狀態(tài)和血栓形成性疾病，如高血壓病、糖尿病、妊娠高血壓綜合征、腎小球腎炎、腎病綜合征、心臟瓣膜置換術(shù)后、心絞痛、心肌梗死、腦梗死、深靜脈血栓形成、口服避孕藥等。應(yīng)用評價

是檢測血小板功能的基本試驗之一，用于遺傳性與獲得性血小板功能缺陷疾病的診斷、血栓前狀態(tài)和血栓性疾病檢查以及抗血小板藥物治療監(jiān)測。但特異性差，操作較復(fù)雜，易受較多人為因素的影響，致使其在臨床的實際應(yīng)用受限。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PAdT應(yīng)用評價第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗

血小板聚集實驗PAgT原理

當(dāng)一定數(shù)量的誘導(dǎo)劑存在時血小板即發(fā)生聚集。以貧血小板血漿（PPP）設(shè)定最低濁度（100%透光度），富血小板血漿（PRP）設(shè)定最高濁度（0%透光度）。在PRP血漿中加入誘聚劑誘導(dǎo)血小板聚集，測定血漿濁度的變化，繪制血小板聚集曲線。通過分析血小板聚集曲線的最大聚集率（MAR）、達到最大幅度的時間、達到1/2最大幅度的時間、2min的幅度、延遲時間、斜率參數(shù)判斷血小板的聚集的程度和速度。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板聚集實驗PAgT原理當(dāng)一定數(shù)量的誘導(dǎo)劑PAgT操作1.用硅化注射器從肘靜脈取血4.5ml，注入含0.5ml109mmol/L枸櫞酸鈉的硅化或塑料離心管中，充分混勻；2.以1000r/min室溫下離心10min，分離PRP，小心取出上層血漿，計數(shù)血小板并調(diào)至（100～200）×109/L；將上述剩余血液以3000r/min離心20min，分離PPP（上層較透明的液體），血小板計數(shù)一般要求低于20×109/L；3.按照不同的聚集儀的要求，吸取所需的PRP和PPP置于比色杯中，分別調(diào)整好透光度為10和0；4.打開記錄儀走紙開關(guān)，描記10s的PRP基線，隨后將適量誘聚劑（視儀器要求而定，一般為反應(yīng)體系總量的1/10左右）加入PRP中，并開始攪拌，記錄濁度改變曲線，測定時間一般為6～10min。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PAgT操作1.用硅化注射器從肘靜脈取血4.5ml不同儀器及誘聚劑或者不同濃度、劑量的同種誘聚劑有不同的參考范圍。MG-196型血小板聚集儀為例，幾種常用的誘聚劑測得的參考值:第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗

PAgT參考區(qū)間ADP(1.0μmol/ml)ADP(0.5μmol/ml)腎上腺素(4.0μg/ml)膠原(3.0μg/ml)瑞斯托霉素(1.5μmg/ml)最大幅度（%）48.6~78.825~5050.2~85.654~9076.1~98.9達到最大幅度時間（S）150~29068~230220~360220~290200~2802min時幅度（%）38~6820~4225~5022~6155~90單峰或雙峰曲線雙峰雙峰雙峰單峰雙峰不同儀器及誘聚劑或者不同濃度、劑量的同種誘聚劑有不同的參考范第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板聚集曲線第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板聚集曲線PAgT應(yīng)用評價應(yīng)用評價本試驗是檢測血小板功能的基本試驗之一，試驗簡便、快速，成本低廉，在臨床上開展比較廣泛。血小板聚集率減低：見于血小板無力癥、血小板貯存池病、血管性血友病、巨大血小板綜合征、低（無）纖維蛋白原血癥、肝硬化、尿毒癥、維生素B12缺乏癥、細菌性心內(nèi)膜炎、急性白血病、骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、服用抗血小板藥物等。血小板聚集率增高血液高凝狀態(tài)和（或）血栓形成性疾病，如動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、腎小球腎炎、腎病綜合征、心臟瓣膜置換術(shù)后、深靜脈血栓形成、高脂飲食、口服避孕藥和吸煙等。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PAgT應(yīng)用評價第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PAgT注意事項標(biāo)本采集后置于室溫（25oC左右）下保存,并在3小時內(nèi)完成試驗;試驗前至少1周應(yīng)停用一切抑制血小板聚集的藥物，如阿司匹林、潘生丁、肝素、雙香豆素等。采血前一天應(yīng)避免使用牛奶、豆?jié){等高脂肪食物以免影響懸液透光度?？鼓齽?yīng)選用枸櫞酸鈉，而忌用EDTA。注意誘聚劑的保存，如ADP在保存過程中會自行分解產(chǎn)生AMP，故配制后溶液應(yīng)保存與-20oC冰箱，但保存一般不應(yīng)超過6個月；腎上腺素應(yīng)避光防止減少分解。此外，誘聚劑的種類和濃度對血小板聚集結(jié)果都有影響，臨床判斷是應(yīng)注明所用誘聚劑的種類和濃度。各實驗室也應(yīng)建立自己的參考值。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PAgT注意事項第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板第3因子有效性測定（PF3aT原理PF3是血小板活化過程中形成的一種膜表面磷脂成分（即磷脂酰絲氨酸），是血小板參與凝血過程的重要因子。試驗將正常人與受檢者的PRP(富含血小板血漿)和PPP（貧血小板血漿）交叉組合,利用白陶土作為血小板活化劑，氯化鈣作為凝血反應(yīng)啟動劑，促進PF3形成。通過測定各組標(biāo)本的凝固時間，比較各組時差，了解受檢者PF3是否有缺陷。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板第3因子有效性測定（PF3aT原理PF3PF3aT操作步驟采血，待測血樣和正常對照血樣各一份，加入抗凝劑混勻；分別制備PPP和PRP；準(zhǔn)備四只試管，按下表加樣；將上述4只試管置于37oC水浴預(yù)溫2min后，依次加入白陶土懸液0.2ml，并記錄時間；加入白陶土20min后，向小試管中依次加入0.025mol/L氯化鈣0.2ml，開動秒表測定凝固時間。組別患者血漿（ml）正常血漿（ml）PRPPPPPRPPPP10.10.120.10.130.10.140.10.1第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PF3aT操作步驟采血，待測血樣和正常對照血樣各一份，加入

PF3aT

參考區(qū)間第1組較第2組延長如超過5s以上，即為PF3有效性減低。第3組、第4組分別為患者和正常人（作為對照管），患者PF3有缺陷或內(nèi)源凝血因子有缺陷時（如血友?。?組凝固時間比第4組長。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PF3aT參考區(qū)間第1組較第2組延長如超過5s

PF3aT

應(yīng)用評價應(yīng)用評價PF3aT是最常用的血小板凝血活性檢測試驗，方法簡單，易于操作。PF3有效性減低：見于先天性血小板PF3缺乏癥、血小板無力癥、巨大血小板綜合征、肝硬化、尿毒癥、彌散性血管內(nèi)凝血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜、骨髓增生異常綜合征、急性白血病及服用抗血小板藥物等。PF3有效性增加：常見于高脂血癥、動脈粥樣硬化、心肌梗死、糖尿病伴血管病變等。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗PF3aT應(yīng)用評價應(yīng)用評價PF3aT是最血小板膜糖蛋白測定第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗

血小板膜糖蛋白（Glucoprotein，GP）是血小板功能和血小板與其他活性物質(zhì)作用的基礎(chǔ)，一些糖蛋白如GPIa、GPIb、GPIIb、GPIIIa等已被確定為血小板特異抗原。

GP分子數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常均可導(dǎo)致出血或血栓形成?；罨“迮c靜止血小板相比，GP的種類、結(jié)構(gòu)、含量等亦呈現(xiàn)顯著變化?？墒褂肊LISA或流式細胞術(shù)（FCM）分析血小板膜糖蛋白的表達。血小板膜糖蛋白測定第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血主要血小板膜糖蛋白及功能第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗名稱CD名稱分子量功能特性GPIaCD49b150000與GPIIa形成復(fù)合物，是膠原的受體GPIbCD42c170000與GPIX、GPV形成復(fù)合物，是vWF的受體，參與血小板粘附反應(yīng)，缺乏或減少時血小板粘附功能減低，見于巨大血小板綜合征GPIcCD49f140000與GPII形成復(fù)合物，是層素（laminin）的受體GPIIaCD29138000與GPIa和Ic形成復(fù)合物，是膠原和層素的受體GPIIb和IIIaCD41aIIb145000IIIa90000GPIIb與IIIa形成復(fù)合物，是纖維蛋白原（Fg）的受體，參與血小板聚集反應(yīng)，缺乏或減少時血小板聚集功能減低，見于血小板無力癥GPIVCD3688000是TSP的受體GPV82000和GPIb、GPIX構(gòu)成vWF受體GPIb-V-IXGPIXCD42a17000和GPIb、GPV形成復(fù)合物，構(gòu)成vWF受體P-selectin140000即α顆粒膜糖蛋白（GMP140）。血小板活化時，可移行至血小板將膜上，成為血小板活化的標(biāo)志。主要血小板膜糖蛋白及功能第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢

血小板自身抗體測定血小板自身抗體包括：

血小板相關(guān)免疫球蛋白（plateletassociatedimmunoglobulin，PAIg）（包括PAIgG、PAIgA、PAIgM）特異性膜糖蛋白自身抗體藥物相關(guān)自身抗體抗同種血小板抗體血小板自身抗體測定表達有助于判斷血小板減少的原因。檢測血小板免疫相關(guān)球蛋白的常用方法為ELISA及流式細胞術(shù)。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板自身抗體測定血小板自身抗體包括：第十三

血小板相關(guān)抗體測定的應(yīng)用評價特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）：90%以上的病人PAIgG增加，同時測定PAIgA、PAIgM及PAC3陽性率達100%。ITP病人在皮質(zhì)激素治療后，PAIgG不下降可作為切脾的指征。ITP療效監(jiān)測指標(biāo)，治療有效上述指標(biāo)下降，復(fù)發(fā)則增加。其他疾病：如同種免疫性血小板減少性紫癜（多次輸血后）、Evans綜合征、藥物免疫性血小板減少性紫癜、慢性活動性肝炎、膠原性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、惡性淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤等PAIg也可增加。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板相關(guān)抗體測定的應(yīng)用評價特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP血小板壽命測定原理利用阿司匹林可使血小板花生四烯酸（AA）代謝受阻，代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）和血栓烷B2（TXB2）生成減少，而新生血小板不受抑制，MDA和TXB2含量正常的原理，測量病人服用阿司匹林后血小板MDA和TXB2生成量恢復(fù)曲線來推算血小板的生存時間。該試驗是檢測血小板在體內(nèi)破壞或消耗速度的一項重要試驗，也稱為血小板生存時間測定（plateletsurvivaltime，PST）。第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板壽命測定原理利用阿司匹林可使血小板花生四烯血小板壽命測定的臨床意義

血小板消耗過多性疾?。篋IC等

各種血栓性疾病，如：心梗、肺梗死等

血小板破壞增多性疾病，如：ITP、脾亢、SLE等

血小板生存時間縮短見于

注意：在血小板數(shù)過低時本法敏感性較低第十三章第二節(jié)血小板止血作用及檢驗血小板壽命測定的臨床意義血小板消耗過多性疾病：DIC等

了解血液中凝血因子及機體凝血機制的基礎(chǔ)理論。理解并掌握凝血因子實驗室檢查的臨床應(yīng)用及評價。學(xué)習(xí)要點第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗第三節(jié)血液凝固及檢驗了解血液中凝血因子及機體凝血機制的基礎(chǔ)理論。學(xué)習(xí)要點第十三一、基本理論

14個：12個經(jīng)典凝血因子激肽釋放酶原+高分子量激肽原特殊：因子Ⅳ為鈣離子（Ca2+）,其余均為蛋白質(zhì)除因子Ⅲ即組織因子外，其余均存在于新鮮血漿中依賴維生素K的凝血因子：因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ

接觸凝血因子：因子Ⅻ、Ⅺ、激肽釋放酶原及高分子量激肽原。對凝血酶敏感的凝血因子：因子Ⅰ、V、Ⅷ、ⅩⅢ凝血因子概述第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗一、基本理論14個：12個經(jīng)典凝血因子凝血因子概述第十三章凝血因子一般特點第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗?zāi)蜃右话闾攸c第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗1．內(nèi)源凝血途徑因子Ⅻ因子Xa

固相激活：因子與帶負荷的物質(zhì)如體內(nèi)的膠原、微纖維等以及體外的玻璃、白陶土等接觸后，構(gòu)型發(fā)生改變而被激活為Ⅻa。

液相激活：因子Ⅻa在輔因子HMWK的參與下，水解PK使之被激活為K，K又可反饋激活因子Ⅻ，生成大量的Ⅻa。

二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ca2+及PK、HMWK1．內(nèi)源凝血途徑二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固2.外源凝血途徑因子Ⅲ

因子Xa

（1）因子Ⅲ（TF）是一種跨膜糖蛋白，作為因子Ⅶ的受體，可與因子Ⅶ或Ⅶa結(jié)合，啟動外源凝血途徑。（2）因子Ⅶ的激活當(dāng)TF結(jié)合到因子Ⅶ后，因子Ⅶ的構(gòu)型發(fā)生改變隨之被凝血酶、Xa激活為Ⅶa。因子Ⅶa與TF、Ca2+形成Ⅶ-TF-Ca2+復(fù)合物，其形成所需時間很短，一般不超過10秒。Ⅶ-TF-Ca2+復(fù)合物可激活因子X和因子Ⅸ，使內(nèi)源與外源凝血途徑相聯(lián)通，具有重要的生理和病理意義。

二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗因子Ⅶ、Ca2+2.外源凝血途徑二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固3.共同途徑因子Ⅹ

纖維蛋白

（1）凝血活酶的生成①因子X的激活：復(fù)合物Ⅶ-TF-Ca2+和Ⅸa-Ⅷa-Ca2+-PF3均可激活因子X生成有活性的因子Xa。②因子V的激活：在少量凝血酶的作用下，因子V被激活為Va。③磷脂的作用：主要指血小板膜脂質(zhì)雙層中的磷脂酰絲氨酸（PF3）。它提供反應(yīng)的催化表面。上述因子共同作用形成Xa-Va-Ca2+--PF3復(fù)合物，此即凝血活酶（凝血酶原酶）。

二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗3.共同途徑二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢3.共同途徑（2）凝血酶的生成在凝血活酶的作用下，凝血酶原被水解釋放出凝血酶原片段1和2（F1+2），變成凝血酶（因子Ⅱa）。凝血酶是一種蛋白水解酶，其活性中心位于絲氨酸殘基上，屬于絲氨酸蛋白酶類。凝血酶在止血與凝血的生理和病理過程中具有多種重要作用:①水解纖維蛋白原；②激活因子Ⅷ、V、Ⅶ、ⅩⅢ，稱為凝血酶的自身催化作用；③激活血小板；④激活抗凝系統(tǒng)的蛋白C；⑤抑制纖維蛋白（原）溶解活性。二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗3.共同途徑二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗3.共同途徑（3）纖維蛋白的形成①可溶性纖維蛋白的形成：在凝血酶的作用下，纖維蛋白原的Aα鏈和Bβ鏈先后被裂解，釋出富含負電荷的纖維蛋白肽A（fibrinopeptideA,FPA）和肽B（FPB）后，生成纖維蛋白單體（fibrinmonomer,FM），它們因負電荷減少，相互間排斥力明顯降低，故能以氫鍵聚合。這種聚合物很不穩(wěn)定，可溶于5mol/L（30%）尿素或1%單氯（碘）醋酸溶淮中（它們能解開氫鍵），故稱為可溶性纖維蛋白單體聚合物或可溶性纖維蛋白。②交聯(lián)纖維蛋白的形成：在凝血酶的作用下，因子ⅩⅢ被激活為具有轉(zhuǎn)谷氨酰酶活性的XⅢa。在因子XⅢa和Ca2+共同作用下，使FMγ鏈上的谷氨酸與另一個FMγ鏈上的賴氨酸以共價鍵交聯(lián)，形成穩(wěn)定的纖維蛋白。從內(nèi)源凝血途徑啟動到纖維蛋白形成稱為內(nèi)源凝血系統(tǒng)，從外源凝血途徑啟動到纖維蛋白形成稱為外源凝血系統(tǒng)。二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗3.共同途徑二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗。二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗。二、凝血機制第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗活化部分凝血活酶時間測定

，APTT原理在抗凝血中，加入足夠量的活化接觸因子激活劑（如白陶土）和部分凝血活酶（代替血小板的磷脂），再加入適量的鈣離子即可滿足內(nèi)源凝血的全部條件。從加入鈣離子到血漿凝固所需的時間即稱為活化部分凝血活酶時間（activatedpartialthromboplastintime,APTT）。APTT的長短反映了血漿中內(nèi)源凝血系統(tǒng)凝血因子（Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ）、共同途徑中凝血酶原、纖維蛋白原和因子Ⅴ、Ⅹ的水平。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗?zāi)蜃訉嶒炇覚z查活化部分凝血活酶時間測定，APTT原理在抗凝血APTT操作（一）血凝儀法1．預(yù)溫活化按儀器操作方法，取正常人混合血漿0.1ml于測量杯中并加入APTT試劑0.1ml混勻，37℃準(zhǔn)確孵育3min，其間輕輕搖動數(shù)次。2．加鈣計時在測量杯中加入0.1ml25mmol/L的CaCl2，儀器自動測定混合物凝固的終點并顯示正常人混合血漿APTT秒數(shù)。3．取待測血漿重復(fù)1～2的操作步驟，測定待測血漿的APTT秒數(shù)。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT操作（一）血凝儀法第十三章第三節(jié)血液APTT操作（二）試管法1．預(yù)溫活化加正常人混合血漿和APTT試劑各0.1ml于塑料試管中混勻，37℃準(zhǔn)確孵育3min，其間輕輕搖動數(shù)次。2．加鈣計時加入預(yù)溫的0.1ml25mmol/LCaCl2，混勻，并立即開動秒表計時，置水浴中不斷振搖。20s后，不時取出試管觀察混合液流動狀態(tài)（傾斜30°），當(dāng)液體停止流動時終止計時，記錄其秒數(shù)。一般應(yīng)重復(fù)測2～3次取平均值。3．取待測血漿重復(fù)1～2的操作步驟，測定待測血漿APTT秒數(shù)，一般應(yīng)重復(fù)2～3次測定取平均值。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT操作（二）試管法第十三章第三節(jié)血液凝

每個實驗室應(yīng)建立所用測定方法相應(yīng)的參考區(qū)間。男性(37±3.3)s，范圍為31.5～43.5s；女性(37.5±2.8)s，范圍為32～43s。待測者測定值較正常對照延長10s以上才有病理意義。

APTT參考區(qū)間第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗每個實驗室應(yīng)建立所用測定方法相應(yīng)的

1．取血要順利，血液應(yīng)與抗凝劑充分混合避免發(fā)生微小凝塊，樣品采集后在2h內(nèi)完成測定。2．樣本測定前應(yīng)測定正常人混合血漿，其APTT值在允許的范圍內(nèi)方可測定樣本。3．APTT測定因所用的激活劑不同，以及部分凝血活酶來源及制備的不同，均可影響測定結(jié)果。部分凝血活酶（磷脂）主要來源于兔腦組織（腦磷脂）。不同制劑質(zhì)量不同，一般選用對因子Ⅷ：C、Ⅸ和Ⅺ在血漿濃度為200～250U/L時敏感的試劑。

APTT注意事項第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗1．取血要順利，血液應(yīng)與抗凝劑充分混合避免發(fā)生微小凝塊，樣APTT臨床意義APTT是一個臨床常用、較為敏感的檢測內(nèi)源凝血因子缺乏的簡便試驗，已替代普通試管法CT測定。但APTT對診斷血栓性疾病（thromboticdisease）和血栓前狀態(tài)（prethromboticstate）缺乏敏感性，也無特異性，臨床價值有限。新生兒由于凝血系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，多種凝血因子尤其是維生素K依賴凝血因子（FII、FVII、FIX、FX）和接觸系統(tǒng)凝血因子（FXI、FXII、PK、HMWK）血漿水平不到成人的50%，其APTT檢測將延長，一般出生后半年凝血因子可達正常成人水平。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT臨床意義第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT臨床意義

1．APTT延長主要見于：①輕型血友病，可檢出FVIII活性低于15%的患者，對FVIII活性超過30%和血友病攜帶者靈敏度欠佳。在中、輕度FVIII、FIX、FXI缺乏時，APTT可正常。②vWD，Ⅰ型和Ⅲ型患者APTT可顯著延長，但不少Ⅱ型患者APTT并不延長。③血中抗凝物如凝血因子抑制物、狼瘡抗凝物、華法林或肝素水平增高，F(xiàn)II、FI及FV、FX缺乏時靈敏度略差。④纖溶亢進，大量纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）抑制纖維蛋白聚合，使APTT延長，DIC晚期時，伴隨凝血因子大量被消耗，APTT延長更為顯著。⑤其他如肝病、DIC、大量輸入庫血等。2．APTT縮短見于血栓前狀態(tài)及血栓性疾病、DIC早期（動態(tài)觀察APTT變化有助于DIC的診斷）。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT臨床意義第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT應(yīng)用評價

APTT對血漿肝素的濃度較敏感，是目前廣泛應(yīng)用的肝素治療監(jiān)測指標(biāo)。此時，要注意APTT測定結(jié)果必須與肝素治療范圍的血漿濃度呈線性關(guān)系，否則不宜使用。一般在肝素治療期間，APTT維持在正常對照的1.5～3.0倍為宜。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗APTT應(yīng)用評價第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗簡易凝血活酶生成試驗，STGT原理用受檢者稀釋全血作為本試驗中所需的全部凝血因子的來源，自身紅細胞溶解產(chǎn)物即紅細胞素代替PF3，按一定時間加入正?；|(zhì)血漿（提供凝血酶原和纖維蛋白原），測定基質(zhì)血漿的凝固時間，以檢查內(nèi)源凝血系統(tǒng)凝血活酶生成有無障礙。

第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗簡易凝血活酶生成試驗，STGT原理用受檢者稀釋全STGT操作1．取受檢者全血0.4ml注入5ml蒸餾水內(nèi)，混勻，使其完全溶解，此為溶血液。2．取0.5ml溶血液加0.308mol/L氯化鈉溶液0.5ml，混勻，37℃預(yù)溫2min，使其變?yōu)榈葷B液。3．于上液中加已預(yù)溫的0.025mol/L氯化鈣溶液0.25ml，啟動秒表。同時放一竹簽以挑除形成的微量纖維蛋白絲。此為溫育混合液。4．分別加0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml于6支大試管內(nèi)，置37℃水浴中，備用。5．在1min45s時，吸0.1ml溫育混合液注入第1支含有氯化鈣溶液的試管內(nèi)；在準(zhǔn)2min時，將已預(yù)溫的正?；|(zhì)血漿0.1ml也加至第1支試管內(nèi)，啟動第2個秒表，記錄凝固時間。每隔2min重復(fù)以上步驟1次，共6次。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗STGT操作1．取受檢者全血0.4ml注入5ml蒸餾

以最短的凝固時間作為本試驗中最有價值的計數(shù)。正常人為(11.99±0.72)s，>15s為異常。

注意事項1．等滲化的血液不宜放置過久。

2．溫育混合液的準(zhǔn)備要嚴(yán)格記時。

STGT參考區(qū)間第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗以最短的凝固時間作為本試驗中最有價值的計數(shù)。正STGT臨床意義STGT延長（>15s），主要見于：①先天性因子VIII、IX、XI缺乏；②獲得性因子VIII、IX、XI缺乏，如DIC、原發(fā)性纖溶以及肝臟疾病、維生素K缺乏癥等；③血循環(huán)中有抗凝物質(zhì)，如肝素、口服抗凝劑以及其他抗凝物質(zhì)等。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗STGT臨床意義第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗STGT糾正試驗

原理

在STGT延長的受檢稀釋全血血液中分別加入1/100容量的正常BaSO4吸附血漿（提供FⅧ、Ⅺ、Ⅻ）正常血清（Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ）和正常新鮮血漿（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ），分別測定正?；|(zhì)血漿的最短凝固時間，以確定內(nèi)源性凝血活酶生成缺陷的因子。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗操作1．取小試管3支，分別加入正常吸附血漿、正常血清、正常新鮮血漿各0.005ml。2．于上述3支試管中，再各加受檢溶血液0.5ml，再加0.308mol/L氯化鈉溶液0.5ml，混勻，37℃水浴2min。3．按測定STGT的第3～5步驟繼續(xù)操作。STGT糾正試驗原理第十三章第三節(jié)血液凝固參考區(qū)間

加入各種糾正血漿或血清后，延長時間糾正到正常范圍之內(nèi)(即10～15s)。注意事項1．吸附血漿制備時以0.1mol/L草酸鈉抗凝為好。

2．正常血漿、血清和吸附血漿需新鮮制備。臨床意義本試驗敏感性較差，尤其對因子XI、IX的缺乏評價更低，應(yīng)以凝血因子活性檢測來替代。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗STGT糾正試驗參考區(qū)間第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗STGT糾正試STGT臨床意義

第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗STGT臨床意義第十三章第三節(jié)血

血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定原理

受檢者稀釋血漿分別與缺乏因子II：C、V：C、VII：C、X：C的基質(zhì)血漿混合，再加兔腦粉浸出液和鈣溶液，作凝血酶原時間測定。將測得的結(jié)果與正常人新鮮混合血漿作比較，分別計算受檢血漿中所含因子II：C、V：C、VII：C、X：C相當(dāng)于正常人的百分率。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定原理受檢者血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定

操作1．取至少30人份正常人的血漿混合，以生理鹽水作1：10、1：20、1：40、1：80、1：160稀釋，其中以1：10稀釋作為100%的促凝活性。2．取各稀釋標(biāo)本0.1ml、缺乏因子的基質(zhì)血漿0.1ml、兔腦或人腦浸出液0.1ml相加并混勻，37℃水浴溫育30S后，加入預(yù)溫的25mmol/LCaCl2溶液0.1ml，在37℃水浴中搖動，記錄凝固時間。3．以所測凝固時間（S）為縱坐標(biāo)，稀釋標(biāo)本濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或建立回歸方程。4．受檢血漿用生理鹽水作1：20稀釋后，按上述操作取得凝固時間，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程，得出相當(dāng)于正常人因子活性的百分比，將該值再乘以2，即為受檢血漿凝血因子活性的水平相當(dāng)于正常人的百分率（%）。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定操作1．取至少30血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定

參考區(qū)間FII：C：97.7%±16.7%FV：C：102.4%±30.9%FVII：C：103.0%±l7.3%FX：C：103.0%±l9.0%注意事項1．樣品采集后應(yīng)在2h內(nèi)完成測定，或分離血漿后置于-80℃冰箱中，2～3個月內(nèi)檢測并避免反復(fù)凍融。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時數(shù)據(jù)可以用半對數(shù)或雙對數(shù)處理。3．缺乏因子的基質(zhì)血漿應(yīng)保證相應(yīng)凝血因子的活性少于1%，而其他因子水平正常。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定參考區(qū)間FII：C血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定

臨床意義1．活性增高主要見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。2．活性減低見于先天性因子II、V、VII、X缺乏癥，但較少見。獲得性減低者見于維生素K缺乏癥、肝臟疾?。ㄗ疃嗪妥钕葴p少的是因子VII，其次和中度減少的是因子II和X，最后和最少減少的是因子V）、DIC和口服抗凝劑等。在血循環(huán)中有上述凝血因子的抑制物時，這些因子的血漿水平也減低。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定臨床意義1．活性增血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定

應(yīng)用評價

目前因子II:C、V:C、VII:C、X:C的測定主要用于肝臟受損的檢查，因子VII:C下降在肝病的早期即可發(fā)生；因子V:C的測定在肝損傷和肝移植中應(yīng)用較多。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子II、V、VII、X促凝活性測定應(yīng)用評價血漿因子VIII、IX、XI、XII促凝活性測定原理待測血漿分別加入乏FⅧ、FⅨ、FⅪ和FⅫ基質(zhì)血漿、白陶土-腦磷脂懸液和鈣離子溶液，進行APTT測定。將正常人混合血漿與乏因子血漿混合，測定APTT，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線中分別計算出受檢血漿中FⅧ：C、FⅨ：C、FⅪ：C和FⅫ：C相當(dāng)于正常人的百分率（%）。

第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子VIII、IX、XI、XII促凝活性測定原理血漿因子VIII、IX、XI、XII促凝活性測定

操作1．空白管測定取基質(zhì)血漿、咪唑緩沖液、腦磷脂懸液及5g/L白陶土生理鹽水懸液各0.1ml，混勻，37℃水浴2min，加預(yù)溫的0.05mol/L氯化鈣溶液0.1ml，記錄凝固時間。要求空白管測定時間控制在240s～250s，其時間的長短可以用腦磷脂的濃度來調(diào)節(jié)。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制正常人新鮮混合血漿以咪唑緩沖液作1：10、1：20、1：40、1：80、1：160稀釋。將各稀釋混合血漿0.1ml、各種乏因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的基質(zhì)血漿0.1ml、腦磷脂懸液0.1ml和5g/L白陶土生理鹽水懸液0.1ml混勻，37℃水浴溫育2min后，加入預(yù)溫的0.05mol/LCaCl2溶液0.1ml，在37℃水浴中搖動，記錄凝固時間。以1:10稀釋的標(biāo)本為100%促凝活性，稀釋度對數(shù)作橫坐標(biāo)，凝固時間對數(shù)作縱坐標(biāo)，在雙對數(shù)曲線上繪制曲線或計算回歸方程。3．受檢標(biāo)本測定取置于冰浴中的受檢血漿以咪唑工作液作1：20稀釋后，按上述操作取得凝固時間，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程，得出各因子活性再乘以2，即為受檢血漿凝血因子活性的水平相當(dāng)于正常人的百分率（%）。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子VIII、IX、XI、XII促凝活性測定操作1．空血漿因子VⅢ、IX、XI、XII促凝活性測定

參考區(qū)間FVⅢ:C：103.0%±25.7%；FIX:C：98.1%±30.4%；FXI:C：100.0%±18.4%；FXII:C：92.4%±20.7%。注意事項1．缺乏某因子的基質(zhì)血漿應(yīng)保證相應(yīng)凝血因子的活性少于1%，而其它因子水平正常。2．樣品采集后應(yīng)在2h內(nèi)完成測定，或分離血漿后置于-80℃冰箱中，2～3個月內(nèi)檢測并避免反復(fù)凍融。3．受檢標(biāo)本檢測凝固時間不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可稀釋后檢測。4．所有標(biāo)本包括正常新鮮混合血漿檢測前都應(yīng)放置在冰水浴中。5．每次測定都應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。至少選擇30人以上制備正常新鮮混合血漿，凍干-80℃可保存3個月以上?？捎蒙唐坊腁PTT試劑代替腦磷脂懸液和白陶土生理鹽水懸液，但濃度需另做調(diào)整。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子VⅢ、IX、XI、XII促凝活性測定參考區(qū)間FVⅢ血漿因子VIII、IX、XI、XII促凝活性測定

臨床意義FⅧ：C在急性時相反應(yīng)時可明顯升高，在嚴(yán)重肝實質(zhì)損傷時，F(xiàn)Ⅷ：C可明顯升高。FⅧ：C減低時，需與vWF含量同時測定，以篩選出vWF缺陷的可能。1．增高血漿中凝血因子VⅢ:C、IX:C、XI:C水平增高，主要見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如靜脈血栓形成、肺栓塞、妊娠高血壓綜合征、晚期妊娠、口服避孕藥、腎病綜合征、惡性腫瘤等。肝病時，因子VⅢ:C增高。2．減低因子VⅢ:C減低見于血友病甲（其中重型≤1%；中型2%～5%；輕型6%～25%；亞臨床型26%～45%）、血管性血友?。ㄓ绕涫荌型和Ⅲ型）、DIC、血中存在因子VⅢ抗體（此情況少見）。因子IX:C減低見于血友病乙（臨床分型同血友病甲）、肝臟疾病、DIC、VitK缺乏癥、口服抗凝劑及抗IX因子抗體存在等。因子XI:C減低見于XI因子缺乏癥、DIC、肝臟疾病以及抗XI因子抗體存在等。因子XⅡ:C減低見于先天性因子XⅡ缺乏癥、DIC、肝臟疾病以及部分血栓病患者。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子VIII、IX、XI、XII促凝活性測定臨床意義F

凝血因子XⅢ定性試驗原理在鈣離子作用下，因子XⅢ能使溶于尿素或單氯乙酸的可溶性纖維蛋白單體聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白凝塊，不再溶于尿素或單氯乙酸溶液。如受檢血漿中缺乏因子XⅢ，則血漿凝塊可再行溶解。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗?zāi)蜃覺Ⅲ定性試驗原理在鈣離子作用下，因子XⅢ凝血因子XⅢ定性試驗操作1．受檢血漿0.1ml,加0.025mol/LCaCl2溶液0.1ml，混合后置37℃水浴。2．待凝塊形成后，取出檢測試管，盡量去除管中液體，移入5mol/L尿素或10g/L單氯乙酸溶液5ml，置37℃水浴。3．先每15min觀察1次，共2h，以后每2～4h觀察1次，共24h。參考區(qū)間

24h內(nèi)纖維蛋白凝塊不溶解。注意事項1．鈣離子溶液需新鮮配制，防止假陰性結(jié)果。2．凝塊加入5mol/L尿素或10g/L單氯乙酸溶液后，應(yīng)使其懸浮于溶液中。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗?zāi)蜃覺Ⅲ定性試驗操作1．受檢血漿0.1ml,加0.凝血因子XⅢ定性試驗應(yīng)用評價

本試驗簡單、可靠，是十分實用的過篩試驗。在臨床上若發(fā)現(xiàn)傷口愈合緩慢、滲血不斷或懷疑有凝血因子XIII缺陷者，均可首先選擇本試驗。若纖維蛋白凝塊在24h內(nèi)，尤其2h內(nèi)完全溶解，表示因子XIII缺乏，見于先天性因子XIII缺乏癥和獲得性因子XIII明顯缺乏，后者見于肝病、SLE、DIC、原發(fā)性纖溶癥、轉(zhuǎn)移性肝癌、惡性淋巴瘤以及抗FXIII抗體存在等。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗?zāi)蜃覺Ⅲ定性試驗應(yīng)用評價第十三章第三節(jié)血液凝固及檢

血漿因子XⅢ亞基抗原測定原理免疫火箭電泳法：凝血因子ⅩⅢ由α和β兩個亞基構(gòu)成。在含有FⅩⅢα亞基和β亞基抗血清的瓊脂凝膠板中，加入受檢血漿（抗原），在電場作用下，出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)形成的火箭樣沉淀峰，此峰的高度與受檢血漿中FⅩⅢ亞基的濃度成正比。根據(jù)沉淀峰的高度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出FⅩⅢα：Ag和FⅩⅢβ：Ag相當(dāng)于正常人的百分率。。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子XⅢ亞基抗原測定原理免疫火箭電泳法血漿因子XⅢ亞基抗原測定

操作1．制板（1）將1%瓊脂糖煮沸溶解后置于50～56℃水浴中備用；（2）取一只小燒杯，根據(jù)抗血清的效價，進行適當(dāng)調(diào)整，按每次試驗所需量加入抗因子ⅩⅢα、抗ⅩⅢβ亞基血清，充分混勻，盡量避免氣泡；（3）取10cm×10cm玻璃板兩塊，中間放入有機玻璃框，三邊用夾子固定，于上口迅速倒入含抗血清的瓊脂糖，每板加10ml左右，4℃冰箱中10～15min，凝固后除去一塊玻璃板，在距玻璃板下緣1.5cm處打10個孔，孔徑3mm，孔距5mm。2．標(biāo)準(zhǔn)品制備取30例正常人新鮮血漿或冰凍混合血漿，并用Tris-巴比妥緩沖液作1：2、1：4、1：8、1：16稀釋。3．受檢標(biāo)本制備將受檢血漿用Tris-巴比妥緩沖液作1：2稀釋。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子XⅢ亞基抗原測定操作1．制板（1）將1%瓊脂糖血漿因子XⅢ亞基抗原測定

操作4．加樣每孔加入受檢樣品10μl，每板均同時各加上述5種不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品10μl，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。5．電泳（1）每側(cè)電泳槽內(nèi)加入Tris-巴比妥緩沖液約500～1000ml，兩槽的液面應(yīng)一致；（2）將玻璃板放在兩槽之間，孔朝向陰極，火箭方向朝陽極，用兩層濾紙搭橋，電橋間距為5.3cm左右；（3）調(diào)節(jié)電壓至于110V，電泳18h。6．染色電泳完畢，取出玻璃板，浸入1%磷鉬酸溶液中20～30min。7．測定火箭電泳高度用兩分規(guī)從加樣孔上緣至頂峰測量火箭峰高度。8．計算用標(biāo)準(zhǔn)血漿的5個數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程，求出各測定樣品的含量，再乘以稀釋倍數(shù)2，得到因子ⅩⅢα：Ag、ⅩⅢβ:Ag相當(dāng)于正常人的百分含量。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子XⅢ亞基抗原測定操作4．加樣每孔加入受檢樣品1參考區(qū)間

FXⅢα:100.4%±12.9%；FXⅢβ:98.8%±12.5%。注意事項1．根據(jù)抗體效價，選擇抗體與抗原結(jié)合良好的稀釋倍數(shù)。2．每次檢測均應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。臨床意義1．先天性因子XⅢ缺乏癥純合子型者的FXⅢα:Ag明顯減低（≤1%），F(xiàn)Ⅲβ：Ag輕度減低；雜合子型者的FⅢα:Ag減低（?！?0%），F(xiàn)Ⅲβ：Ag正常。2．獲得性因子XⅢ減少癥見于肝疾病、DIC、原發(fā)性纖溶癥、急性心肌梗死、急性白血病、惡性淋巴瘤、免疫性血小板減少性紫癜、SLE等。一般認(rèn)為，上述疾病的因子XⅢα:Ag有不同程度的降低，而因子XⅢβ:Ag正常。第十三章第三節(jié)血液凝固及檢驗血漿因子XⅢ亞基抗原測定

操作參考區(qū)間FXⅢα:100.4%±12.9%；FXⅢβ:98

了解抗凝物質(zhì)如抗凝血酶、蛋白C系統(tǒng)、組織因子途徑抑制物等的基本理論。理解并掌握抗凝物質(zhì)實驗室檢查的臨床應(yīng)用及評價。學(xué)習(xí)要點第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗了解抗凝物質(zhì)如抗凝血酶、蛋白C系統(tǒng)、組織因?qū)W習(xí)要點第十三章一、基本理論抗凝血酶（antithrombin，AT）是一種單鏈糖蛋白，由肝、血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成，屬于α2球蛋白。AT作用：AT是肝素依賴的絲氨酸蛋白酶抑制物，抑酶譜很廣，能抑制FⅡa、FVⅡa、FIXa、Fxa、FXⅡa以及纖溶酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶等，作用機制相同。

AT作用機制：肝素與AT結(jié)合后，導(dǎo)致AT構(gòu)型發(fā)生改變，后者可與這些酶活性中心的絲氨酸殘基結(jié)合，“封閉”了這些酶的活性中心而使之失活。此時肝素可從復(fù)合物中重新釋出，再與其他游離的AT結(jié)合，繼續(xù)發(fā)揮肝素增強AT抗凝功能的作用?？鼓父攀龅谑碌谒墓?jié)抗凝物質(zhì)及檢驗一、基本理論抗凝血酶（antithrombin，A一、基本理論蛋白C系統(tǒng)包括蛋白C（proteinC,PC）、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin,TM）、蛋白S（proteinS,PS）、活性蛋白C抑制物（activatedproteinCinhibitor,APCI）和內(nèi)皮細胞蛋白C受體（endothelialproteinCreceptor,EPCR）。蛋白C、蛋白S、APCI由肝臟產(chǎn)生，TM和EPCR由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和表達。蛋白C概述第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗一、基本理論蛋白C系統(tǒng)包括蛋白C（proteinC,PC）一、基本理論APC作用機制：蛋白C被凝血酶與凝血酶調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活形成活化的蛋白C（APC），這一過程在EPCR輔助下完成。APC在蛋白S的協(xié)同下，發(fā)揮抗凝作用，主要表現(xiàn)在裂解因子Va、Ⅷa，抑制因子Xa與血小板膜磷脂的結(jié)合。

APCI作用機制：APCI通過和APC結(jié)合使之失去滅活因子Va、Ⅷa的作用。如果蛋白C或蛋白S有缺陷，與AT缺陷一樣（它們均有遺傳性缺陷），可引起機體凝血和抗凝平衡失調(diào)，導(dǎo)致血栓形成。蛋白C概述第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗一、基本理論APC作用機制：蛋白C被凝血酶與凝血酶調(diào)節(jié)蛋白一、基本理論組織因子途徑抑制物（tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI）是一種單鏈糖蛋白，主要由血管內(nèi)皮細胞、血小板、單核細胞等合成和分泌。

TFPI在血漿中以與脂蛋白結(jié)合和游離兩種形在存在。TFPI作用機制：TFPI存在于Ⅶa和Ⅹa的結(jié)合部位，通過和TF-Ⅶa復(fù)合物結(jié)合抑制其活性，從而對組織因子凝血途徑發(fā)揮重要調(diào)控作用。TFPI概述第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗一、基本理論組織因子途徑抑制物（tissuefactor一、基本理論生理性抗凝物質(zhì)包括肝素輔因子Ⅱ（hepauinco-factorⅡ，HCⅡ）、a2-巨球蛋白（a2-macroglobulin,a2-MG）和a1-抗胰蛋白酶（a1-antit-rypsin,a1-AT）等。

病理性抗凝物質(zhì)主要包括肝素及類肝素物質(zhì)、狼瘡抗凝物（lupusanticoagulation,LAC）、凝血因子抑制物等。

生理性和病理性抗凝物質(zhì)概述第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗一、基本理論生理性抗凝物質(zhì)包括肝素輔因子Ⅱ（hepauin抗凝血酶抗原含量測定，AT：Ag原理以抗凝血酶（AT）抗體包被酶標(biāo)反應(yīng)板，標(biāo)本中的AT與固相的抗AT抗體相結(jié)合，再加入酶標(biāo)抗AT抗體，則形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，加入顯色基質(zhì)后，根據(jù)顯色程度來判斷標(biāo)本中的AT含量。第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗抗凝物質(zhì)的實驗室檢查抗凝血酶抗原含量測定，AT：Ag原理以抗凝血酶AT：Ag

操作1．用碳酸鹽緩沖液將抗AT單抗配制為適當(dāng)濃度，加入到酶標(biāo)板中，0.1ml/孔，4℃過夜。2．洗滌液洗去未結(jié)合的單抗。3．將經(jīng)樣品稀釋液系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測標(biāo)本加入含固相抗體的酶標(biāo)板中，0.1ml/孔，37℃溫育2h后，洗滌液洗滌3次。4．每孔加0.1ml適當(dāng)濃度的酶標(biāo)抗AT抗體，37℃再溫育2h，洗滌液洗滌3次。5．加新鮮配制的鄰苯二胺、3%過氧化氫的枸櫞酸鹽緩沖液，0.1ml/孔，顯色10min。第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗AT：Ag操作1．用碳酸鹽緩沖液將抗AT單抗配制為AT：Ag

操作6．每孔加0.05ml3mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)。7．酶標(biāo)儀上492nm波長測各孔吸光度值。8．以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算回歸方程。9．以待測樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程查出相應(yīng)的數(shù)值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中AT抗原的含量。第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗AT：Ag操作6．每孔加0.05ml3mol/LAT抗原(290±30.2)mg/L注意事項1．所有標(biāo)本不能用肝素抗凝。2．待檢血漿及標(biāo)準(zhǔn)品從冰箱取出后應(yīng)立即置37℃水浴中解凍，并避免反復(fù)凍融。3．每次測定時需做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。參考區(qū)間第十三章第四節(jié)抗凝物質(zhì)及檢驗AT：Ag

操作AT抗原(290±30.2)mg/L參考區(qū)間第十

AT：Ag

應(yīng)用評價

AT抗原和AT活性以同時測定為好。兩者臨床意義相似，但不一定平行，尤其在先天性AT缺陷時，并非AT合成量的減少，而是合成了結(jié)構(gòu)異常的AT分子，測其抗原量正常，而活性減低。

1．AT抗原水平減低見于先天性AT缺陷；