三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件

實驗三懸浮細胞與貼壁細胞

的培養(yǎng)與觀察實驗三懸浮細胞與貼壁細胞

1細胞培養(yǎng)的基本概念

細胞傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。細胞培養(yǎng)的基本概念2三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件3細胞系cellline細胞株cellstrain

三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件4培養(yǎng)細胞的特性培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞培養(yǎng)細胞的特性5

每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）

每代貼附生長細胞的生長過程6游離期：

細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘一4小時游離期：7貼壁期：

細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）貼壁期：8三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件9潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。潛伏期10對數生長期：細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。對數生長期：11停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性停止期（平臺期）：12培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要13

實驗準備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管

實驗準備實驗用品：14壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件15無菌細胞培養(yǎng)室無菌細胞培養(yǎng)室16其它物品細胞凍存管其它物品細胞凍存管17超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。

超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除18濾器濾器19三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件20CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內滅菌蒸餾水3000毫升，以保持箱內濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃21三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件22自動雙重純水蒸餾器純水儀自動雙重純水蒸餾器23酶標儀微孔板震蕩器酶標儀24培養(yǎng)板培養(yǎng)板25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶26常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗27清潔液的配制清潔液的配制282細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml2細胞培養(yǎng)用液的配制29消化液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用消化液：30培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然31合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類32人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長33血清中含有：①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分血清中含有：34一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．血清中不僅存在促細胞生長因子，提供細胞體外適于生存的微環(huán)境．一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數細胞可以維持細胞不死35血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量最好。優(yōu)質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。36抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養(yǎng)基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100u。抗菌素的使用：37完全培養(yǎng)基的組成基礎培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升完全培養(yǎng)基的組成基礎培養(yǎng)基38完全培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

完全培養(yǎng)基的配制39細胞傳代方法根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：

1懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。細胞傳代方法根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：402半懸浮生長細胞傳代

此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3貼壁生長細胞傳代

采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。2半懸浮生長細胞傳代41一、實驗目的

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況的方法。2.掌握細胞傳代的方法。一、實驗目的

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況的方42二、實驗原理細胞傳代培養(yǎng)是指細胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的比例轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的操作過程。傳代后的細胞生長密度降低，可獲取新鮮培養(yǎng)基中的豐富營養(yǎng)，有利于細胞在體外環(huán)境更好的生長與繁殖。二、實驗原理細胞傳代培養(yǎng)是指細胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的43三、實驗器材與試劑

1.材料：懸浮細胞、貼壁細胞2.器材與儀器：刻度吸管、吸球、橡皮吸頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）、華氏管等。（上述器材需徹底清洗，玻璃器材160?C烤干或塑料器材烘干，包裝后高壓蒸汽滅菌30min或輻照滅菌，備用。）超凈工作臺、倒置顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、廢液缸等。3.試劑：無鈣鎂PBS溶液、0.25%胰蛋白酶等。三、實驗器材與試劑

1.材料：懸浮細胞、貼壁細胞44四、實驗內容1、準備工作：1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用75%的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時，用酒精棉球擦拭超凈臺。2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。3）打開超凈臺內的紫外燈，照射20min。同時，將實驗所需材料也放入超凈臺進行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）4）倒置顯微鏡下，觀察細胞的狀態(tài)，是否已經長滿培養(yǎng)瓶，需要進行分瓶。2、關閉超凈臺的紫外燈，打開風機。四、實驗內容1、準備工作：1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用453、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。4、在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意吸管不要碰到布滿細胞的培養(yǎng)瓶的側壁。加入無鈣鎂PBS洗滌細胞，再用吸管吸去液體。5、對于貼壁細胞的傳代培養(yǎng)方法，將0.25%胰酶加入培養(yǎng)瓶內，顯微鏡下隨時觀察，見到細胞的突起消失、細胞變圓時，立即翻轉培養(yǎng)瓶，吸出胰酶。記住不要消化時間過長，否則，細胞會被胰酶消化掉。6、加入適量無鈣鎂PBS或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。3、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待467、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打細胞，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，再補加培養(yǎng)基，按1:3進行分瓶。然后，用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋，在瓶外注明細胞名稱、日期、實驗人員姓名等，放入CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。對于懸浮細胞的傳代培養(yǎng)方法，只需要將細胞進行離心，1000rpm/5min，然后，換入新的培養(yǎng)基即可，再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。不健康的細胞質中有空泡，細胞內有顆粒樣物質，細胞間空隙增大、變形、不規(guī)則，失去原有的特點。7、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打細胞，一定要輕輕吹478、結果觀察一般情況下，傳代后的貼壁細胞在2h后貼壁，2~4d可在瓶底形成單層，需要再次進行傳代。細胞培養(yǎng)過程中，需要每天在倒置顯微鏡下進行觀察，重點注意以下幾點：1）觀察細胞是否污染。注意培養(yǎng)液的顏色變化與澄清與否。2）觀察細胞是否增殖，細胞密度是否發(fā)生變化。3）觀察細胞形態(tài)特征。4）對活細胞占細胞總數的比例，可用0.5%臺盼藍染液進行染色。8、結果觀察48五、注意事項

注意每個操作環(huán)節(jié)，嚴格防止細胞污染。傳代或換液24~48h注意觀察細胞是否被污染，污染的細胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲。如果細胞生長緩慢，生長特性改變，胞質內顆粒性物質增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細胞立即從培養(yǎng)箱中取走，以免污染其它細胞。

五、注意事項

注意每個操作環(huán)節(jié)，嚴格防止細胞污染。傳代或換液49細胞生長曲線的測定（示教）原理：生長曲線的測定（計數法）是測定細胞絕對生長數的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，為培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數之一。生長曲線常用于測定細胞體外生長的趨勢或藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般細胞傳代之后，經過短暫的懸浮到貼壁，隨后經歷潛伏期，再進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。

細胞生長曲線的測定（示教）原理：50實驗器材與試劑：1、器材：細胞培養(yǎng)所需器材（同前）、細胞計數器、倒置顯微鏡、細胞計數板、微量加樣器、塑料槍頭等2、試劑：完全培養(yǎng)基、無鈣鎂PBS、0.25%胰酶溶液、0.5%臺盼藍染液、藥物實驗器材與試劑：51正常細胞生長曲線的測定：1.

胰酶消化細胞，用新鮮培養(yǎng)基中止，輕輕吹打，制成細胞懸液，計數。2.根據計數結果，每個方瓶中接種細胞3×105個，加3ml培養(yǎng)基，共接種7瓶（由于是學生實驗，細胞用量較大，故每實驗組不做重復計數，最后可用每班所計數的值求均數。也可接種9瓶細胞，計數9天）。3.每間隔24h，共7天，分別計數每瓶細胞數。4.計數時，用胰酶消化至鏡下見細胞縮成圓形，用一定體積的原培養(yǎng)基中止消化，然后將細胞吹打成單細胞懸液，再用27ul細胞加入3ul臺盼藍染色液混合，顯微鏡下計數活細胞數，換算成單位體積的活細胞數（根據細胞生長的濃度，細胞懸液與臺盼藍染色液的比例可調整）。以每班計數的細胞數取平均數。6.以細胞數（105/ml）為縱軸，以時間（h或d）為橫軸，繪制生長曲線圖。7.繪制實驗結果。正常細胞生長曲線的測定：52正常細胞生長曲線圖正常細胞生長曲線圖53復習思考題：細胞培養(yǎng)的過程中應注意哪些事項？復習思考題：54實驗三懸浮細胞與貼壁細胞

的培養(yǎng)與觀察實驗三懸浮細胞與貼壁細胞

55細胞培養(yǎng)的基本概念

細胞傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。細胞培養(yǎng)的基本概念56三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件57細胞系cellline細胞株cellstrain

三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件58培養(yǎng)細胞的特性培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞培養(yǎng)細胞的特性59

每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）

每代貼附生長細胞的生長過程60游離期：

細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘一4小時游離期：61貼壁期：

細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）貼壁期：62三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件63潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。潛伏期64對數生長期：細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。對數生長期：65停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性停止期（平臺期）：66培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要67

實驗準備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管

實驗準備實驗用品：68壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件69無菌細胞培養(yǎng)室無菌細胞培養(yǎng)室70其它物品細胞凍存管其它物品細胞凍存管71超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。

超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除72濾器濾器73三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件74CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內滅菌蒸餾水3000毫升，以保持箱內濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃75三懸浮細胞與貼壁細胞的培養(yǎng)與觀察課件76自動雙重純水蒸餾器純水儀自動雙重純水蒸餾器77酶標儀微孔板震蕩器酶標儀78培養(yǎng)板培養(yǎng)板79培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶80常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗81清潔液的配制清潔液的配制822細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml2細胞培養(yǎng)用液的配制83消化液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用消化液：84培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然85合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類86人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長87血清中含有：①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分血清中含有：88一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．血清中不僅存在促細胞生長因子，提供細胞體外適于生存的微環(huán)境．一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數細胞可以維持細胞不死89血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量最好。優(yōu)質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。90抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養(yǎng)基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100u?？咕氐氖褂茫?1完全培養(yǎng)基的組成基礎培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升完全培養(yǎng)基的組成基礎培養(yǎng)基92完全培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

完全培養(yǎng)基的配制93細胞傳代方法根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：

1懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。細胞傳代方法根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：942半懸浮生長細胞傳代

此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3貼壁生長細胞傳代

采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。2半懸浮生長細胞傳代95一、實驗目的

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況的方法。2.掌握細胞傳代的方法。一、實驗目的

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況的方96二、實驗原理細胞傳代培養(yǎng)是指細胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的比例轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的操作過程。傳代后的細胞生長密度降低，可獲取新鮮培養(yǎng)基中的豐富營養(yǎng)，有利于細胞在體外環(huán)境更好的生長與繁殖。二、實驗原理細胞傳代培養(yǎng)是指細胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的97三、實驗器材與試劑

1.材料：懸浮細胞、貼壁細胞2.器材與儀器：刻度吸管、吸球、橡皮吸頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）、華氏管等。（上述器材需徹底清洗，玻璃器材160?C烤干或塑料器材烘干，包裝后高壓蒸汽滅菌30min或輻照滅菌，備用。）超凈工作臺、倒置顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、廢液缸等。3.試劑：無鈣鎂PBS溶液、0.25%胰蛋白酶等。三、實驗器材與試劑

1.材料：懸浮細胞、貼壁細胞98四、實驗內容1、準備工作：1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用75%的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時，用酒精棉球擦拭超凈臺。2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。3）打開超凈臺內的紫外燈，照射20min。同時，將實驗所需材料也放入超凈臺進行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）4）倒置顯微鏡下，觀察細胞的狀態(tài)，是否已經長滿培養(yǎng)瓶，需要進行分瓶。2、關閉超凈臺的紫外燈，打開風機。四、實驗內容1、準備工作：1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用993、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。4、在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意吸管不要碰到布滿細胞的培養(yǎng)瓶的側壁。加入無鈣鎂PBS洗滌細胞，再用吸管吸去液體。5、對于貼壁細胞的傳代培養(yǎng)方法，將0.25%胰酶加入培養(yǎng)瓶內，顯微鏡下隨時觀察，見到細胞的突起消失、細胞變圓時，立即翻轉培養(yǎng)瓶，吸出胰酶。記住不要消化時間過長，否則，細胞會被胰酶消化掉。6、加入適量無鈣鎂PBS或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。3、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待1007、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打細胞，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中