毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜分離原理

毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜分離原理概述在電泳緩沖液中加入離子表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑的單體就結(jié)合在一起，形成一個(gè)球體，稱為膠束。膠束一般是由10--50個(gè)碳原子單位的長(zhǎng)鏈分子組成，具有頭部(或外層)親水、尾部(或內(nèi)層)疏水的特性。在溶液中，頭部露在外面，尾部包在膠束中。這種膠束的形成是疏水效應(yīng)的結(jié)果，能使系統(tǒng)的自由能減少。膠束可分為正相膠束和反相膠束兩類，以前者應(yīng)用較多。反相膠束則是指在有機(jī)溶劑中形成的膠束，尚未作系統(tǒng)研究。用來作為表面活性劑的化合物很多，大體有四類：陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子和非離子表面活性劑，其典型化合物及主要性質(zhì)如表4.1所示。表4.1四類表面活性劑中典型化合物的性質(zhì)國(guó)表面活性劑類型臨界咬束濃度(M)聚集度SDS?陰離子8.1X62ctab3)陽(yáng)高子9.2X10*461li旬-35司非離子1.0X10'440Sulfobetame51兩性離子3,3X1時(shí)55注：聚集度：分子數(shù)和膠束束之比；SDS:十二烷基硫酸鈉；CTAR:十六烷基三甲基季胺洪;B臥35:聚氧化乙烯-23-十二垸基膨Sulfcbetaiti秋N-十二燒基-NN二甲基胺*3■丙烷-L?橫酸,應(yīng)用最多的是前兩類，且尤以十二烷基硫酸鈉(SDS)等使用最為普遍。圖4.1是SDS膠束的結(jié)構(gòu)示意，里面有一個(gè)疏水內(nèi)核，外面布滿了.S03一離子。

圖4』SDS膠束的結(jié)構(gòu)在MECC系統(tǒng)中，實(shí)際上存在著類似于色譜的兩相，一是流動(dòng)的水相，另一是起到固定相作用的膠束相，溶質(zhì)在這兩相之間分配，由其在膠束中不同的保留能力而產(chǎn)生不同的保留值。與毛細(xì)管區(qū)帶電泳一樣，由于緩沖液在靠近管壁處形成的正電，使其顯示出強(qiáng)烈的電滲流而向陰極移動(dòng)。對(duì)于SDS膠束來說，由于其外殼帶很大的負(fù)電荷，本應(yīng)以較大的淌度朝陽(yáng)極遷移，但由于在一般情況下電滲流的速度大于膠束的遷移速度，這就迫使膠束最終以較低的速度向陰極移動(dòng)，如圖4.2所示。由此可見，毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜有別于普通色譜的一個(gè)重要特性為它的“固定相”是移動(dòng)的，這種移動(dòng)的“固定相”又被稱之為“準(zhǔn)固定相’?！?/_/L//L//////圖4?2毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜中膠束的移動(dòng)在毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜中，中性粒子由于本身疏水性的不同而得以分離.具有不同疏水性的粒子與膠束的相互作用不同，疏水性強(qiáng)的作用力就大，其留在膠束相中的時(shí)間就長(zhǎng)。由于膠束相的絕對(duì)速度很小，組分的保留時(shí)間就長(zhǎng)；反之組分較多地停留在緩沖液中按電滲的速度移動(dòng)，保留時(shí)間就較短。以上所述為使用陰離子表面活性劑的情況，如果使用陽(yáng)離子表面活性別，則清況相反。機(jī)理前己述及MECC中存在有兩相，一相是以膠束形式存在的準(zhǔn)固定相，另一相是作為載體的液相，又稱流動(dòng)相。試樣中的組分在MECC中的分離，從本質(zhì)上來說，是由它們的分子和膠束相及流動(dòng)相分子之間的相互作用的差異造成的，盡管對(duì)不同的膠束相互作用的形式不同，但是它們所反映的問題本質(zhì)是一樣的。具體來說，溶質(zhì)在毛細(xì)管柱內(nèi)受到兩種力，一是膠束對(duì)它的作用力，二是流動(dòng)相的溶解力，即溶質(zhì)處于兩個(gè)作用力場(chǎng)的平衡之中，作用力強(qiáng)，溶解力差時(shí)，溶質(zhì)有較大的保留；反之，則較早流出毛細(xì)管柱，見圖4.3.圖4,3MECC原理示意圖也就是說，不同組分分子和膠束相與流動(dòng)相分子相互作用的不同，最終將導(dǎo)致它們?cè)趦上嘀械臐舛缺炔煌?，或者說分配系數(shù)不同。設(shè)X物質(zhì)因相互作用較大，而在膠束相中的濃度較大，Y物質(zhì)因相互作用較小而濃度較小，則X的分配系數(shù)大于丫的分配系數(shù)（分配系數(shù)阡溶質(zhì)在膠束相的濃度/溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度），在這一MECC系統(tǒng)中，X在Y的后面流出。綜上所述，不同組分在毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜中的分離，從根本上來說是由于它們的分子與膠束和流動(dòng)相分子相互作用的差異造成的，而這種相互作用的差異通過分配系數(shù)的差異來反映，分配系數(shù)和上述一系列微觀參量都有明確的定量關(guān)系。問題的另一方面是，既然分配系數(shù)及其差異是引起組分在MECC中分離的根本原因，那么，必然地也會(huì)同MECC中可測(cè)宏觀參量之間存在著某種定量關(guān)系，事實(shí)上，MECC中通常采用容量因子K’的概念來間接地描繪分配系數(shù)。容量因子的定義為:k'二組分在膠束相中的量/組分在流動(dòng)相中的量序言高效毛細(xì)管電泳(HighPerformanceCapillaryElectrophoresis，簡(jiǎn)稱HPCE)是70-80年代迅速發(fā)展起來的一類新型的電泳和色譜相結(jié)合的分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已成為90年代重要的高效分離手段，在生物、化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、食品等領(lǐng)域等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。毛細(xì)管電泳和高效液相色譜(HPLC)都是液相分離技術(shù)，由于它們遵循不同的分離機(jī)理，除了具有自己的特點(diǎn)外兩者在很大程度上可以互為補(bǔ)充。但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細(xì)管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢(shì)。與HPLC相比，毛細(xì)管電泳的柱效更高一些，速度更快一些；同時(shí)它的用量?jī)H為HPLC的千分之一，且溶劑消耗量極小，又沒有泵輸運(yùn)系統(tǒng)，因此成本相對(duì)較低。毛細(xì)管電泳具備許多分離模式，通過改變其緩沖液成分、添加劑和柱型，毛細(xì)管電泳有很大的選擇性，可以根據(jù)不同的分子性質(zhì)(諸如大小、電荷數(shù)、手性、疏水性等)對(duì)極廣泛的對(duì)象進(jìn)行有效的分離。相比之下，為達(dá)到類似的日的，HPLC要消耗許多價(jià)格昂貴的柱子和溶劑，而且現(xiàn)在常用的HPLC方法存在分析時(shí)間長(zhǎng)，分離效率低及柱子易污染等缺點(diǎn)，因此毛細(xì)管電泳方法在這個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。毛細(xì)管電泳的結(jié)構(gòu)很簡(jiǎn)單：通常包括一個(gè)高壓源，一根毛細(xì)管，一個(gè)檢測(cè)器以及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入且又可和電源兩端相連的緩沖液貯槽，輸出信號(hào)和記錄裝置。裝置的示意圖如下所示：廠高莊電源時(shí)檢削器*6—^謎口池出口池毛細(xì)管電泳示意圖毛細(xì)管電泳的原理也并不復(fù)雜，其原理如下所述：1.概述分離原理：高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是溶液狀態(tài)的混合物以相對(duì)較窄的區(qū)帶引入到毛細(xì)管中并在電場(chǎng)作用下遷移。由于混合物中各物質(zhì)所帶的電荷和大小不同而具有不同的電泳淌度，因此遷移速度存在差異而實(shí)現(xiàn)分離。定量原理：根據(jù)朗伯-比爾定律定量。2.理論2.1電泳淌度當(dāng)一帶電離子在電場(chǎng)E中時(shí)，它受到電場(chǎng)力F的作用，其大小等于帶電粒子的凈電荷q與電場(chǎng)強(qiáng)度E的乘積，即F二q*E一旦帶電粒子開始運(yùn)動(dòng)，除電場(chǎng)力外，它還受到一個(gè)與運(yùn)動(dòng)方向相反的阻力作用。阻力Fd的大小與其遷移速度(v)成正比，即dFd=f*v其中f為平動(dòng)摩檫或阻力系數(shù)。當(dāng)電場(chǎng)力完全被阻力平衡后，粒子以穩(wěn)態(tài)速度遷移，該穩(wěn)態(tài)速度V與阻力系數(shù)的關(guān)系為：ssVss=qE/f若將帶電粒子的電泳淌度定義為單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的穩(wěn)態(tài)速度p=q/f很明顯，粒子的大小和電荷差異都可以引起電泳淌度的差異。2.2電滲流在毛細(xì)管電泳中，由于所用的毛細(xì)管多由熔融石英做成，它表面含有硅醇基團(tuán)(SiOH)，電解質(zhì)存在時(shí)這些硅醇基團(tuán)可以離子化。此時(shí)，熔融石英毛細(xì)管壁和緩沖液間的界面由三層組成：帶負(fù)電的石英表面(PH>2)，不可移動(dòng)層和陽(yáng)離子擴(kuò)散層。這三層與石英表面相連，趨向陰極移動(dòng)。這種陽(yáng)離子的遷移導(dǎo)致了整個(gè)毛細(xì)管內(nèi)流體向陰極遷移，這種液體在毛細(xì)管中的流動(dòng)稱作電滲流。電滲流的速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，故電滲流淌度定義為單位電場(chǎng)強(qiáng)度下得電滲流速度：peo=V/E2.3檢測(cè)方法：用于毛細(xì)管電泳的檢測(cè)I方法有UV-Vis吸收法、激光光熱法、熒光法、間接測(cè)定法、電導(dǎo)法、安培法、質(zhì)譜法、放射法、拉曼光譜法、折射指數(shù)法等多種。也有用CITP/CZE、HPCE/HPLC聯(lián)用方法進(jìn)行檢測(cè)。但是HPCE進(jìn)樣量小、分離速度快的特點(diǎn)要求檢測(cè)器具有靈敏度高、空間分辨率高、響應(yīng)快及在線檢測(cè)功能。目前已經(jīng)商品化的檢測(cè)器中，光學(xué)檢測(cè)器(紫外、二極管陣列、熒光)較為成熟，電化學(xué)檢測(cè)器及放射性同位素檢測(cè)器已開始應(yīng)用。質(zhì)譜聯(lián)用因靈敏度高也得到發(fā)展。利用HPCE時(shí)應(yīng)根據(jù)所分析物質(zhì)的特點(diǎn)選用相應(yīng)的檢測(cè)方法，以揚(yáng)長(zhǎng)避短。本實(shí)驗(yàn)選用的檢測(cè)方法為紫外檢測(cè)法。十九世紀(jì)初，法國(guó)人Derosne,Pelletier和德國(guó)人Sertuner159］等相繼從植物和藥材中分離出生物堿，并證明它們具有明顯的生理作用，推動(dòng)了植物藥材有效成分的研究。目前，應(yīng)著重如下研究：研究中草藥的種類和資源，尋找新藥源；研究中草藥的鑒別和化學(xué)成分，以鑒定中草藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣，保證中藥質(zhì)量；研究藥用動(dòng)植物的遺傳因素、生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境條件與有效成分積累的關(guān)系，以及中藥在采收、加工、炮制、儲(chǔ)藏合理的加工、炮制和貯藏，從而提高藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。以上幾方面都有賴于中藥有效成分的分析。而中藥有效成分的分析有其特殊復(fù)雜性，首先是中藥品種繁多，不同品種間活性成分的含量相差懸殊;其次中藥中有效成分還受產(chǎn)地、栽培、生長(zhǎng)環(huán)境和采收季節(jié)等因素的影響。對(duì)于由多種中藥組成的復(fù)方制劑，情況就更復(fù)雜了。目前用于中藥成分分析的方法有薄層色譜法((TLC)、氣相色譜法(GC),高效液相色譜法((HPLC)等，其中HPLC法常用，高效液相色譜法，其有諸多的優(yōu)點(diǎn)，如柱效高，選擇性好，適用面廣，但將其用于中草藥的分析時(shí)，有下列幾個(gè)不利因素。由于中草藥成分不但復(fù)雜且往往不甚清楚，增加了樣品前處理的困難，容易造成柱污染，嚴(yán)重地影響柱壽命。液相色譜所消耗的溶劑量大，增加了這種方法的成本，且造成環(huán)境污染。每根柱的柱效實(shí)際上不是很高(約幾千塔板數(shù))，所需分析時(shí)間一般較長(zhǎng)。與高效液相色譜相比，高效毛細(xì)管電泳在分析中草藥時(shí)具有下列幾點(diǎn)優(yōu)越毛細(xì)管柱易于全面清洗，不必?fù)?dān)心對(duì)柱子的污染而使柱子報(bào)廢。簡(jiǎn)化對(duì)樣品前處理的要求。柱效高、分析時(shí)間一般比HFLC短。由于柱效高，有可能使同一個(gè)分離條件適合多種樣品中多組分的分析。所用化學(xué)試劑量少，分析成本低。分離模式多，適合于中藥中存在的各類物質(zhì)。包括酸性、堿性和中性的物質(zhì)，如有機(jī)酸、生物堿、黃酮及其貳類、香豆類