毛細管膠束電動色譜分離原理

毛細管膠束電動色譜分離原理概述在電泳緩沖液中加入離子表面活性劑，當溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑的單體就結(jié)合在一起，形成一個球體，稱為膠束。膠束一般是由10--50個碳原子單位的長鏈分子組成，具有頭部(或外層)親水、尾部(或內(nèi)層)疏水的特性。在溶液中，頭部露在外面，尾部包在膠束中。這種膠束的形成是疏水效應的結(jié)果，能使系統(tǒng)的自由能減少。膠束可分為正相膠束和反相膠束兩類，以前者應用較多。反相膠束則是指在有機溶劑中形成的膠束，尚未作系統(tǒng)研究。用來作為表面活性劑的化合物很多，大體有四類：陰離子、陽離子、兩性離子和非離子表面活性劑，其典型化合物及主要性質(zhì)如表4.1所示。表4.1四類表面活性劑中典型化合物的性質(zhì)國表面活性劑類型臨界咬束濃度(M)聚集度SDS?陰離子8.1X62ctab3)陽高子9.2X10*461li旬-35司非離子1.0X10'440Sulfobetame51兩性離子3,3X1時55注：聚集度：分子數(shù)和膠束束之比；SDS:十二烷基硫酸鈉；CTAR:十六烷基三甲基季胺洪;B臥35:聚氧化乙烯-23-十二垸基膨Sulfcbetaiti秋N-十二燒基-NN二甲基胺*3■丙烷-L?橫酸,應用最多的是前兩類，且尤以十二烷基硫酸鈉(SDS)等使用最為普遍。圖4.1是SDS膠束的結(jié)構(gòu)示意，里面有一個疏水內(nèi)核，外面布滿了.S03一離子。

圖4』SDS膠束的結(jié)構(gòu)在MECC系統(tǒng)中，實際上存在著類似于色譜的兩相，一是流動的水相，另一是起到固定相作用的膠束相，溶質(zhì)在這兩相之間分配，由其在膠束中不同的保留能力而產(chǎn)生不同的保留值。與毛細管區(qū)帶電泳一樣，由于緩沖液在靠近管壁處形成的正電，使其顯示出強烈的電滲流而向陰極移動。對于SDS膠束來說，由于其外殼帶很大的負電荷，本應以較大的淌度朝陽極遷移，但由于在一般情況下電滲流的速度大于膠束的遷移速度，這就迫使膠束最終以較低的速度向陰極移動，如圖4.2所示。由此可見，毛細管膠束電動色譜有別于普通色譜的一個重要特性為它的“固定相”是移動的，這種移動的“固定相”又被稱之為“準固定相’?！?/_/L//L//////圖4?2毛細管膠束電動色譜中膠束的移動在毛細管膠束電動色譜中，中性粒子由于本身疏水性的不同而得以分離.具有不同疏水性的粒子與膠束的相互作用不同，疏水性強的作用力就大，其留在膠束相中的時間就長。由于膠束相的絕對速度很小，組分的保留時間就長；反之組分較多地停留在緩沖液中按電滲的速度移動，保留時間就較短。以上所述為使用陰離子表面活性劑的情況，如果使用陽離子表面活性別，則清況相反。機理前己述及MECC中存在有兩相，一相是以膠束形式存在的準固定相，另一相是作為載體的液相，又稱流動相。試樣中的組分在MECC中的分離，從本質(zhì)上來說，是由它們的分子和膠束相及流動相分子之間的相互作用的差異造成的，盡管對不同的膠束相互作用的形式不同，但是它們所反映的問題本質(zhì)是一樣的。具體來說，溶質(zhì)在毛細管柱內(nèi)受到兩種力，一是膠束對它的作用力，二是流動相的溶解力，即溶質(zhì)處于兩個作用力場的平衡之中，作用力強，溶解力差時，溶質(zhì)有較大的保留；反之，則較早流出毛細管柱，見圖4.3.圖4,3MECC原理示意圖也就是說，不同組分分子和膠束相與流動相分子相互作用的不同，最終將導致它們在兩相中的濃度比不同，或者說分配系數(shù)不同。設(shè)X物質(zhì)因相互作用較大，而在膠束相中的濃度較大，Y物質(zhì)因相互作用較小而濃度較小，則X的分配系數(shù)大于丫的分配系數(shù)（分配系數(shù)阡溶質(zhì)在膠束相的濃度/溶質(zhì)在流動相的濃度），在這一MECC系統(tǒng)中，X在Y的后面流出。綜上所述，不同組分在毛細管膠束電動色譜中的分離，從根本上來說是由于它們的分子與膠束和流動相分子相互作用的差異造成的，而這種相互作用的差異通過分配系數(shù)的差異來反映，分配系數(shù)和上述一系列微觀參量都有明確的定量關(guān)系。問題的另一方面是，既然分配系數(shù)及其差異是引起組分在MECC中分離的根本原因，那么，必然地也會同MECC中可測宏觀參量之間存在著某種定量關(guān)系，事實上，MECC中通常采用容量因子K’的概念來間接地描繪分配系數(shù)。容量因子的定義為:k'二組分在膠束相中的量/組分在流動相中的量序言高效毛細管電泳(HighPerformanceCapillaryElectrophoresis，簡稱HPCE)是70-80年代迅速發(fā)展起來的一類新型的電泳和色譜相結(jié)合的分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、應用范圍廣等特點，已成為90年代重要的高效分離手段，在生物、化學、醫(yī)藥、環(huán)保、食品等領(lǐng)域等領(lǐng)域有很好的應用前景。毛細管電泳和高效液相色譜(HPLC)都是液相分離技術(shù)，由于它們遵循不同的分離機理，除了具有自己的特點外兩者在很大程度上可以互為補充。但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢。與HPLC相比，毛細管電泳的柱效更高一些，速度更快一些；同時它的用量僅為HPLC的千分之一，且溶劑消耗量極小，又沒有泵輸運系統(tǒng)，因此成本相對較低。毛細管電泳具備許多分離模式，通過改變其緩沖液成分、添加劑和柱型，毛細管電泳有很大的選擇性，可以根據(jù)不同的分子性質(zhì)(諸如大小、電荷數(shù)、手性、疏水性等)對極廣泛的對象進行有效的分離。相比之下，為達到類似的日的，HPLC要消耗許多價格昂貴的柱子和溶劑，而且現(xiàn)在常用的HPLC方法存在分析時間長，分離效率低及柱子易污染等缺點，因此毛細管電泳方法在這個領(lǐng)域的應用越來越受到人們的關(guān)注。毛細管電泳的結(jié)構(gòu)很簡單：通常包括一個高壓源，一根毛細管，一個檢測器以及兩個供毛細管兩端插入且又可和電源兩端相連的緩沖液貯槽，輸出信號和記錄裝置。裝置的示意圖如下所示：廠高莊電源時檢削器*6—^謎口池出口池毛細管電泳示意圖毛細管電泳的原理也并不復雜，其原理如下所述：1.概述分離原理：高效毛細管電泳(HPCE)是溶液狀態(tài)的混合物以相對較窄的區(qū)帶引入到毛細管中并在電場作用下遷移。由于混合物中各物質(zhì)所帶的電荷和大小不同而具有不同的電泳淌度，因此遷移速度存在差異而實現(xiàn)分離。定量原理：根據(jù)朗伯-比爾定律定量。2.理論2.1電泳淌度當一帶電離子在電場E中時，它受到電場力F的作用，其大小等于帶電粒子的凈電荷q與電場強度E的乘積，即F二q*E一旦帶電粒子開始運動，除電場力外，它還受到一個與運動方向相反的阻力作用。阻力Fd的大小與其遷移速度(v)成正比，即dFd=f*v其中f為平動摩檫或阻力系數(shù)。當電場力完全被阻力平衡后，粒子以穩(wěn)態(tài)速度遷移，該穩(wěn)態(tài)速度V與阻力系數(shù)的關(guān)系為：ssVss=qE/f若將帶電粒子的電泳淌度定義為單位電場強度下的穩(wěn)態(tài)速度p=q/f很明顯，粒子的大小和電荷差異都可以引起電泳淌度的差異。2.2電滲流在毛細管電泳中，由于所用的毛細管多由熔融石英做成，它表面含有硅醇基團(SiOH)，電解質(zhì)存在時這些硅醇基團可以離子化。此時，熔融石英毛細管壁和緩沖液間的界面由三層組成：帶負電的石英表面(PH>2)，不可移動層和陽離子擴散層。這三層與石英表面相連，趨向陰極移動。這種陽離子的遷移導致了整個毛細管內(nèi)流體向陰極遷移，這種液體在毛細管中的流動稱作電滲流。電滲流的速度與電場強度成正比，故電滲流淌度定義為單位電場強度下得電滲流速度：peo=V/E2.3檢測方法：用于毛細管電泳的檢測I方法有UV-Vis吸收法、激光光熱法、熒光法、間接測定法、電導法、安培法、質(zhì)譜法、放射法、拉曼光譜法、折射指數(shù)法等多種。也有用CITP/CZE、HPCE/HPLC聯(lián)用方法進行檢測。但是HPCE進樣量小、分離速度快的特點要求檢測器具有靈敏度高、空間分辨率高、響應快及在線檢測功能。目前已經(jīng)商品化的檢測器中，光學檢測器(紫外、二極管陣列、熒光)較為成熟，電化學檢測器及放射性同位素檢測器已開始應用。質(zhì)譜聯(lián)用因靈敏度高也得到發(fā)展。利用HPCE時應根據(jù)所分析物質(zhì)的特點選用相應的檢測方法，以揚長避短。本實驗選用的檢測方法為紫外檢測法。十九世紀初，法國人Derosne,Pelletier和德國人Sertuner159］等相繼從植物和藥材中分離出生物堿，并證明它們具有明顯的生理作用，推動了植物藥材有效成分的研究。目前，應著重如下研究：研究中草藥的種類和資源，尋找新藥源；研究中草藥的鑒別和化學成分，以鑒定中草藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣，保證中藥質(zhì)量；研究藥用動植物的遺傳因素、生長發(fā)育、環(huán)境條件與有效成分積累的關(guān)系，以及中藥在采收、加工、炮制、儲藏合理的加工、炮制和貯藏，從而提高藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。以上幾方面都有賴于中藥有效成分的分析。而中藥有效成分的分析有其特殊復雜性，首先是中藥品種繁多，不同品種間活性成分的含量相差懸殊;其次中藥中有效成分還受產(chǎn)地、栽培、生長環(huán)境和采收季節(jié)等因素的影響。對于由多種中藥組成的復方制劑，情況就更復雜了。目前用于中藥成分分析的方法有薄層色譜法((TLC)、氣相色譜法(GC),高效液相色譜法((HPLC)等，其中HPLC法常用，高效液相色譜法，其有諸多的優(yōu)點，如柱效高，選擇性好，適用面廣，但將其用于中草藥的分析時，有下列幾個不利因素。由于中草藥成分不但復雜且往往不甚清楚，增加了樣品前處理的困難，容易造成柱污染，嚴重地影響柱壽命。液相色譜所消耗的溶劑量大，增加了這種方法的成本，且造成環(huán)境污染。每根柱的柱效實際上不是很高(約幾千塔板數(shù))，所需分析時間一般較長。與高效液相色譜相比，高效毛細管電泳在分析中草藥時具有下列幾點優(yōu)越毛細管柱易于全面清洗，不必擔心對柱子的污染而使柱子報廢。簡化對樣品前處理的要求。柱效高、分析時間一般比HFLC短。由于柱效高，有可能使同一個分離條件適合多種樣品中多組分的分析。所用化學試劑量少，分析成本低。分離模式多，適合于中藥中存在的各類物質(zhì)。包括酸性、堿性和中性的物質(zhì)，如有機酸、生物堿、黃酮及其貳類、香豆類