蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)

關(guān)于蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第1頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵連接在一起的線性序列。具有游離的氨基和游離的羧基第2頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)通論蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類蛋白質(zhì)的分子性狀與大小蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)功能的多樣性第3頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第4頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六凱氏定氮原理蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。第5頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第6頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第7頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量變化極大。單體蛋白質(zhì)：一條多肽鏈構(gòu)成（肌紅蛋白和溶菌酶）寡聚蛋白質(zhì)或多聚蛋白質(zhì)：兩條或多條多肽鏈構(gòu)成。每條多肽鏈稱為亞基或亞單位，亞基間通過非共價(jià)鍵結(jié)合第8頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)的構(gòu)象蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象構(gòu)型：具有相同結(jié)構(gòu)式的立體異構(gòu)體中取代基的空間取向，沒有共價(jià)鍵的斷裂，不同的構(gòu)型不能互變。構(gòu)象：具有相同結(jié)構(gòu)式和相同構(gòu)型的的分子在空間可能的多種形態(tài)，構(gòu)象形態(tài)間的變化不涉及共價(jià)鍵的斷裂。第9頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六

1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次:

primarystructure 一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸序列

secondarystructure二級(jí)結(jié)構(gòu)：α螺旋，β折疊

tertiarystructure 三級(jí)結(jié)構(gòu)：所有原子空間位置

quanternarystructure四級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多聚體

1969年正式將一級(jí)結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對(duì)獨(dú)立）這兩個(gè)層次。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次第10頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第11頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第12頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第13頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六二肽肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽的理化性質(zhì)天然存在的活性肽第14頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第15頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六概念二肽寡肽多肽氨基酸殘基氨基酸殘基與水分子的關(guān)系第16頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六肽鏈書寫方法游離的ɑ-氨基在左邊，游離的ɑ-羧基在右邊，氨基酸間用“-”表示肽鍵三肽+H3N-絲氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COO-，簡寫為Ser-Leu-PheSer-Gly-Tyr-Ala-LeuLeu-Ala-Tyr-Gly-Ser第17頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第18頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)

形成酰胺平面

產(chǎn)生鍵的平均化

肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體第19頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第20頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第21頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六肽的理化性質(zhì)晶體熔點(diǎn)高酸堿性質(zhì)取決于游離的氨基、游離的羧基以及側(cè)鏈R-基上的可解離功能團(tuán)第22頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六雙縮脲反應(yīng)肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，氨基酸沒有。含有一個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物與硫酸銅堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，得到紫紅色或藍(lán)紫色復(fù)合物第23頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六雙縮脲法的原理:雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中有多個(gè)肽鍵，也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律(光被吸收的量正比于光程中產(chǎn)生光吸收的分子數(shù)目)，所以可用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

第24頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六雙縮脲反應(yīng)主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性影響較小。試劑價(jià)廉易得，操作簡便，可測(cè)定的范圍為1～10mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，能測(cè)出的蛋白質(zhì)含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點(diǎn)是靈敏度差、所需樣品量大。第25頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六天然存在的活性肽（activepeptide）具有特殊的生物學(xué)功能（多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能），易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性極高，是當(dāng)前國際食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。

第26頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六大豆肽大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)酸法或酶法水解后分離、精制而得到的多肽混合物，以3～6個(gè)氨基酸組成的小分子肽為主，還含有少量大分子肽、游離氨基酸、糖類和無機(jī)鹽等成分大豆肽的蛋白質(zhì)含量為85％左右，其氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)相同，必需氨基酸的平衡良好，含量豐富。與大豆蛋白相比，具有消化吸收率高、提供能量迅速、降低膽固醇、降血壓和促進(jìn)脂肪代謝的生理功能以及無豆腥味、無蛋白變性、酸性不沉淀、加熱不凝固、易溶于水、流動(dòng)性好等良好的加工性能，是優(yōu)良的保健食品素材。第27頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六乳鐵素B(牛乳鐵蛋白活性肽)牛乳鐵蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽，具有較強(qiáng)抗菌活性.研究表明，乳鐵素B對(duì)大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.4mg/mL；第28頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、硫酸銨在0～10mg/mL，乳糖、可溶性淀粉在0～4mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)乳鐵素B的抗菌活性影響不大；當(dāng)NaCl或KCl的濃度為25～100mmol/L，MgCl2或CaCl2的濃度為1.0～5.0mmol/L時(shí)，乳鐵素B的抗菌活性就會(huì)大大降低；隨著緩沖鹽濃度和有機(jī)酸濃度（25～100mmol/L）的增大，乳鐵素B的抗菌活性呈下降趨勢(shì)，在微堿性環(huán)境下乳鐵素B表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活力.

第29頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第30頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六谷胱甘肽的作用加強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)的免疫活性,抗氧化劑和自由基清除劑機(jī)體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的許多自由基會(huì)損傷細(xì)胞膜，侵襲生命大分子，促進(jìn)機(jī)體衰老，并誘發(fā)腫瘤或動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生

調(diào)節(jié)其他抗氧化劑，保護(hù)身體免受疾病.中和解毒作用。GSH能與進(jìn)入機(jī)體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合，并促其排出體外，起到中和解毒作用

第31頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六

谷胱甘肽有還原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）兩種形式，在生理?xiàng)l件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù)。谷胱甘肽還原酶催化兩型間的互變。該酶的輔酶為磷酸糖旁路代謝提供的NADPH。

第32頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六由于還原型谷胱甘肽本身易受某些物質(zhì)氧化，能夠保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被如自由基等有害物質(zhì)氧化，從而發(fā)揮其生理功能。第33頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六人體紅細(xì)胞中谷胱甘肽的含量很多，對(duì)保護(hù)紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài)，防止溶血具有重要意義，還可以保護(hù)血紅蛋白不受過氧化氫、自由基等氧化而持續(xù)正常在發(fā)揮運(yùn)輸氧的能力。第34頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六紅細(xì)胞中部分血紅蛋白在過氧化氫等氧化劑的作用下，其中二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，使血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而失去了帶氧能力。還原型谷胱甘肽既能直接與過氧化氫等氧化劑結(jié)合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能夠?qū)⒏哞F血紅蛋白還原為血紅蛋白。

第35頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六人工已研制開發(fā)出了谷胱甘肽藥物，廣泛應(yīng)用于臨床，除利用其巰基以螯合重金屬、氟化物、芥子氣等毒素中毒外，還用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜疾病等，作為輔助治療的藥物第36頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第37頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六歷史上第一個(gè)被確定

氨基酸序列的蛋白質(zhì)

胰島素

insulin第38頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六胰島素的歷史第一個(gè)生化藥物動(dòng)物胰腺?細(xì)胞分泌的一種激素,運(yùn)輸糖、氨基酸、K+；最小的蛋白質(zhì)，由A鏈(21AA)和B(30AA)組成；1921年Banting&Best從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，1923年Banting&Macleod獲Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；1943－53年，Sanger確定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，1958年獲得Nobel化學(xué)獎(jiǎng)；1981年，Berg（因DNA重組技術(shù)得獎(jiǎng)）在大腸桿菌中表達(dá)了人胰島素.第39頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定對(duì)樣品的要求均一，純度97%以上相對(duì)分子量已知第40頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟1、蛋白質(zhì)的分離純化

2、測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目3、亞基分離4、二硫鍵的拆分與保護(hù)5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成6、鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基7、多種方法的部分水解8、測(cè)序9、重疊10、二硫鍵位置的確定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟第41頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六1.蛋白質(zhì)的分離純化（1）根據(jù)溶解度不同的方法鹽析、等電點(diǎn)沉淀法、低溫有機(jī)溶劑沉淀法（2）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的方法透析與超濾、凝膠過濾法（3）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離的方法電泳、離子交換層析（4）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法

第42頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六透析——只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)第43頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第44頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六超過濾——除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液第45頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六凝膠層析第46頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第47頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六親和層析法（afinitychromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。第48頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。第49頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六2、測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目

通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。第50頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六多肽鏈的拆分

由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).第51頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六4、二硫鍵的拆分與保護(hù)

幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止重新被氧化。通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第52頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六

★巰基的保護(hù)④測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽鏈的N-末端和C-末端

★末端氨基酸的測(cè)定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測(cè)定的主要方法有：第53頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成第54頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六N端的測(cè)定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法第55頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)

（sanger反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸第56頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六Sanger試劑(FDNB)標(biāo)記N末端Sanger試劑標(biāo)記反應(yīng)第57頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB測(cè)定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高酰化反應(yīng)第58頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)

（Edman反應(yīng)）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+第59頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六Edman降解法(I)DABITC:有色Edman試劑在Edman試劑上加發(fā)色基團(tuán)Edman降解法1第60頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六Edman降解法(II)Edman降解法2第61頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六無冕英雄PehrVictorEdman

1946-47年在美國留學(xué)時(shí)想到改進(jìn)1930年Abderhalden&Brockmann發(fā)明的

PITC試劑的反應(yīng),50年發(fā)明Edmandegradation反應(yīng).ActaChemScand4:283(1950)1957年移居墨爾本,遠(yuǎn)離國際學(xué)術(shù)中心開始過隱居生活,1967年研制的自動(dòng)化儀器可以達(dá)到每小時(shí)一個(gè)氨基酸的速度;他堅(jiān)持不申請(qǐng)專利,給了美國公司得以隨便開發(fā)儀器的方便.1972年到德國,77年因腦瘤過世.第62頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六由于Edman降解產(chǎn)物需要在紫外域進(jìn)行檢測(cè),只有HPLC和相應(yīng)的紫外檢測(cè)手段進(jìn)步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用該反應(yīng)測(cè)定了RNase的一級(jí)結(jié)構(gòu),遺憾的是Edman沒有和他們分享Nobel化學(xué)獎(jiǎng).第63頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六1、肼法2、還原法3、酶降解法C端的測(cè)定方法第64頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)與無水肼加熱

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

|

|

Rx

Ry

--+--+NH-CH-CONH-NH2

+

NH2-CH-COOH

|

|

Rx

Ry肼(hydrazine)法測(cè)定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有機(jī)溶劑而被除去多種方法確定肼法C端測(cè)定第65頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六還原法碳末端氨基酸通過硼氫化鋰還原為氨基醇，水解后氨基醇可以進(jìn)行鑒別第66頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六羧肽酶法：

羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。第67頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六常用的羧肽酶羧肽酶A：釋放除了Pro、Arg、Lys之外的所有C-末端殘基羧肽酶B：僅能水解Arg、Lys為C-末端的氨基酸殘基二者混用羧肽酶Y：作用于任何一個(gè)C-末端殘基第68頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六二硫橋的斷裂過甲酸氧化法巰基化合物還原法注意

1暴露二硫鍵

2保護(hù)巰基第69頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六使用的還原劑有巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇（DTT）

-巰基乙醇H0－CH2CH2－SH巰基保護(hù)劑：碘乙酰胺、碘乙酸、3－溴丙胺等。第70頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六氨基酸組成的分析方法：酸水解，輔以堿水解表達(dá)方法每摩爾蛋白質(zhì)中含有的氨基酸殘基的摩爾數(shù)

100克蛋白質(zhì)中含有的氨基酸的克數(shù)。第71頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)將肽鏈的氨基酸從N端

(aminopeptidase)或C端

(carboxypeptidase)一個(gè)接一個(gè)游離出來，

在不同時(shí)間取樣進(jìn)行分析，根據(jù)所游離的氨基酸判斷氨基酸的排列順序。酶解法末端測(cè)序酶解法末端測(cè)序第72頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六常

用

的

酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶第73頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六胰蛋白酶肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，是不可缺少的工具。牛的胰蛋白酶氨基酸殘基223個(gè)，分子量為23300，活性部位的絲氨酸殘基是不可缺少的絲氨酸蛋白酶。第74頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）屬于肽鏈內(nèi)切酶，主要切斷多肽鏈中的芳香族氨基酸殘基的羧基一側(cè)斷裂點(diǎn)鄰近的基團(tuán)為堿性，斷裂能力增強(qiáng)；酸性斷裂能力減弱第75頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六胃蛋白酶胃蛋白酶在對(duì)蛋白或多肽進(jìn)行剪切時(shí)，具有一定的氨基酸序列特異性。斷裂點(diǎn)兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸胃蛋白酶在酸性環(huán)境中具有較高活性，其最適pH值約為3。在中性或堿性pH值的溶液中，胃蛋白酶會(huì)發(fā)生解鏈而喪失活性。常用來確定二硫鍵的位置

第76頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六肽鍵的專一性水解(化學(xué)法)化學(xué)法:CNBr,H+,NH2OH,etc化學(xué)法專一性水解第77頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六溴化氰水解法(CNBr):切割Met

的羧基所形成的肽鍵。用羥胺斷裂:它斷裂－Asn-Gly-,但專一性不高。蛋白質(zhì)中出現(xiàn)機(jī)率低，適于分子量大的蛋白質(zhì)序列的測(cè)定。第78頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）第79頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六氨基酸的鑒定、分離純化PTH-AA氨基酸的確定第80頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六肽段在多肽鏈中次序的決定資料：N-末端殘基H,C-末端殘基S;第一套肽段第二套肽段OUS

SEOPS

WTOUEOVE

VERLRLA

APSHOWT

HO第81頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六借助重疊肽確定肽段次序：末端殘基HS末端肽段HOWT

APS

或

OUS第一套肽段：HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段：HO

WTOU

SEO

VERL

APS推斷全序列:

HOWTOUSEOVERLAPS第82頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第83頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第84頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂第85頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：

一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。第86頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六1、為防止Cys跟Cys-Cys發(fā)生交換反應(yīng)，先將自由SH基封閉;2、進(jìn)行專一性部分水解;3、紙層析分離水解產(chǎn)物;4、氣相過甲酸法切斷S-S鍵，作第二相紙層析;5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進(jìn)行測(cè)序經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法二硫鍵位置確定第87頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六點(diǎn)樣。水解后的混合肽段點(diǎn)在濾紙中央，PH6.5，進(jìn)行一向電泳，肽段分離開濾紙?jiān)诩姿嵴魵庵斜┞稊嗔讯蜴I。含二硫鍵的肽段被氧化成一對(duì)含磺基丙氨酸的肽。濾紙轉(zhuǎn)90度在與第一向相同的條件下，進(jìn)行二向電泳肽斑用茚三酮顯色確定第88頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六對(duì)角線電泳示意圖第89頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六現(xiàn)用蛋白質(zhì)一級(jí)

結(jié)構(gòu)分析方法第90頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六分離純化蛋白質(zhì)酶切部分水解后分離短肽對(duì)短肽進(jìn)行測(cè)序構(gòu)建cDNA文庫根據(jù)序列設(shè)計(jì)探針篩選cDNA文庫根據(jù)cDNA序列推測(cè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)第91頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六

N末端和C末端的測(cè)序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究以外，最常用于基因工程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析。末端測(cè)序的用途第92頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六常利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫//第93頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)氨基酸順序與生物功能

研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。第94頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六例1鐮刀形貧血病

患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血這說明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性第95頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異第96頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第97頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六例2一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活

體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時(shí)，是一個(gè)比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原第98頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號(hào)肽.信號(hào)肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個(gè)殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.第99頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六例3同源蛋白

同源蛋白：是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.第100頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六例：細(xì)胞色素C60個(gè)物種中，有27個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹）.第101頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六第102頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六黃色：不變殘基（invariableresidues）藍(lán)色：保守氨基酸（conservativeresidues）未標(biāo)記：可變殘基（variableresidues）第103頁，共109頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)48分，星期六不同生物來源的細(xì)胞色素c中不變的AA殘基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTr