蛋白質的共價結構

關于蛋白質的共價結構第1頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質蛋白質是氨基酸以肽鍵連接在一起的線性序列。具有游離的氨基和游離的羧基第2頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質通論蛋白質的化學組成與分類蛋白質的分子性狀與大小蛋白質構象和結構的組織層次蛋白質功能的多樣性第3頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第4頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六凱氏定氮原理蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質含量。第5頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第6頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第7頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質的分子量蛋白質相對分子質量變化極大。單體蛋白質：一條多肽鏈構成（肌紅蛋白和溶菌酶）寡聚蛋白質或多聚蛋白質：兩條或多條多肽鏈構成。每條多肽鏈稱為亞基或亞單位，亞基間通過非共價鍵結合第8頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質的構象蛋白質的三維結構被稱為蛋白質的構象構型：具有相同結構式的立體異構體中取代基的空間取向，沒有共價鍵的斷裂，不同的構型不能互變。構象：具有相同結構式和相同構型的的分子在空間可能的多種形態(tài)，構象形態(tài)間的變化不涉及共價鍵的斷裂。第9頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六

1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質的結構可以分成四個層次:

primarystructure 一級結構：氨基酸序列

secondarystructure二級結構：α螺旋，β折疊

tertiarystructure 三級結構：所有原子空間位置

quanternarystructure四級結構：蛋白質多聚體

1969年正式將一級結構定義為氨基酸序列介于二級結構和三級結構之間還存在超二級結構（二級結構的組合）和結構域（在空間上相對獨立）這兩個層次。

蛋白質的結構層次第10頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第11頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第12頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第13頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六二肽肽和肽鍵的結構肽的理化性質天然存在的活性肽第14頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第15頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六概念二肽寡肽多肽氨基酸殘基氨基酸殘基與水分子的關系第16頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六肽鏈書寫方法游離的ɑ-氨基在左邊，游離的ɑ-羧基在右邊，氨基酸間用“-”表示肽鍵三肽+H3N-絲氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COO-，簡寫為Ser-Leu-PheSer-Gly-Tyr-Ala-LeuLeu-Ala-Tyr-Gly-Ser第17頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第18頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結果：限制繞肽鍵的自由旋轉

形成酰胺平面

產(chǎn)生鍵的平均化

肽鍵呈反式構型sp2sp2sp2sp3共振雜化體第19頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第20頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第21頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六肽的理化性質晶體熔點高酸堿性質取決于游離的氨基、游離的羧基以及側鏈R-基上的可解離功能團第22頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六雙縮脲反應肽和蛋白質特有的反應，氨基酸沒有。含有一個或兩個以上肽鍵的化合物與硫酸銅堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應，得到紫紅色或藍紫色復合物第23頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六雙縮脲法的原理:雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生紫紅色的絡合物，這一反應稱為雙縮脲反應。因為蛋白質中有多個肽鍵，也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質的含量的關系在一定范圍內符合比爾定律(光被吸收的量正比于光程中產(chǎn)生光吸收的分子數(shù)目)，所以可用雙縮脲法測定蛋白質的含量。

第24頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質特異性影響較小。試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1～10mg蛋白質，適于精度要求不太高的蛋白質含量的測定，能測出的蛋白質含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點是靈敏度差、所需樣品量大。第25頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六天然存在的活性肽（activepeptide）具有特殊的生物學功能（多種人體代謝和生理調節(jié)功能），易消化吸收，有促進免疫、激素調節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性極高，是當前國際食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。

第26頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六大豆肽大豆肽是大豆蛋白質經(jīng)酸法或酶法水解后分離、精制而得到的多肽混合物，以3～6個氨基酸組成的小分子肽為主，還含有少量大分子肽、游離氨基酸、糖類和無機鹽等成分大豆肽的蛋白質含量為85％左右，其氨基酸組成與大豆蛋白質相同，必需氨基酸的平衡良好，含量豐富。與大豆蛋白相比，具有消化吸收率高、提供能量迅速、降低膽固醇、降血壓和促進脂肪代謝的生理功能以及無豆腥味、無蛋白變性、酸性不沉淀、加熱不凝固、易溶于水、流動性好等良好的加工性能，是優(yōu)良的保健食品素材。第27頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六乳鐵素B(牛乳鐵蛋白活性肽)牛乳鐵蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽，具有較強抗菌活性.研究表明，乳鐵素B對大腸桿菌的最小抑菌質量濃度為0.5mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.4mg/mL；第28頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、硫酸銨在0～10mg/mL，乳糖、可溶性淀粉在0～4mg/mL的質量濃度范圍內，對乳鐵素B的抗菌活性影響不大；當NaCl或KCl的濃度為25～100mmol/L，MgCl2或CaCl2的濃度為1.0～5.0mmol/L時，乳鐵素B的抗菌活性就會大大降低；隨著緩沖鹽濃度和有機酸濃度（25～100mmol/L）的增大，乳鐵素B的抗菌活性呈下降趨勢，在微堿性環(huán)境下乳鐵素B表現(xiàn)出較強的抗菌活力.

第29頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第30頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六谷胱甘肽的作用加強人體免疫系統(tǒng)的免疫活性,抗氧化劑和自由基清除劑機體內新陳代謝產(chǎn)生的許多自由基會損傷細胞膜，侵襲生命大分子，促進機體衰老，并誘發(fā)腫瘤或動脈粥樣硬化的產(chǎn)生

調節(jié)其他抗氧化劑，保護身體免受疾病.中和解毒作用。GSH能與進入機體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質等相結合，并促其排出體外，起到中和解毒作用

第31頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六

谷胱甘肽有還原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）兩種形式，在生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù)。谷胱甘肽還原酶催化兩型間的互變。該酶的輔酶為磷酸糖旁路代謝提供的NADPH。

第32頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六由于還原型谷胱甘肽本身易受某些物質氧化，能夠保護許多蛋白質和酶等分子中的巰基不被如自由基等有害物質氧化，從而發(fā)揮其生理功能。第33頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六人體紅細胞中谷胱甘肽的含量很多，對保護紅細胞膜上蛋白質的巰基處于還原狀態(tài)，防止溶血具有重要意義，還可以保護血紅蛋白不受過氧化氫、自由基等氧化而持續(xù)正常在發(fā)揮運輸氧的能力。第34頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六紅細胞中部分血紅蛋白在過氧化氫等氧化劑的作用下，其中二價鐵氧化為三價鐵，使血紅蛋白轉變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而失去了帶氧能力。還原型谷胱甘肽既能直接與過氧化氫等氧化劑結合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能夠將高鐵血紅蛋白還原為血紅蛋白。

第35頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六人工已研制開發(fā)出了谷胱甘肽藥物，廣泛應用于臨床，除利用其巰基以螯合重金屬、氟化物、芥子氣等毒素中毒外，還用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白內障和視網(wǎng)膜疾病等，作為輔助治療的藥物第36頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第37頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六歷史上第一個被確定

氨基酸序列的蛋白質

胰島素

insulin第38頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六胰島素的歷史第一個生化藥物動物胰腺?細胞分泌的一種激素,運輸糖、氨基酸、K+；最小的蛋白質，由A鏈(21AA)和B(30AA)組成；1921年Banting&Best從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，1923年Banting&Macleod獲Nobel醫(yī)學獎；1943－53年，Sanger確定了牛胰島素的一級結構，1958年獲得Nobel化學獎；1981年，Berg（因DNA重組技術得獎）在大腸桿菌中表達了人胰島素.第39頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六一級結構測定對樣品的要求均一，純度97%以上相對分子量已知第40頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質一級結構測定的步驟1、蛋白質的分離純化

2、測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目3、亞基分離4、二硫鍵的拆分與保護5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成6、鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基7、多種方法的部分水解8、測序9、重疊10、二硫鍵位置的確定一級結構測定策略蛋白質一級結構測定步驟第41頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六1.蛋白質的分離純化（1）根據(jù)溶解度不同的方法鹽析、等電點沉淀法、低溫有機溶劑沉淀法（2）根據(jù)蛋白質分子大小不同的方法透析與超濾、凝膠過濾法（3）根據(jù)蛋白質帶電性質進行分離的方法電泳、離子交換層析（4）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法

第42頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六透析——只用于除鹽類和小分子雜質第43頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第44頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六超過濾——除小分子雜質，分離、濃縮蛋白質加壓蛋白質溶液半透膜支持膜的柵板超濾液第45頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六凝膠層析第46頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第47頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六親和層析法（afinitychromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。根據(jù)某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。第48頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。第49頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六2、測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目

通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。第50頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六多肽鏈的拆分

由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).第51頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六4、二硫鍵的拆分與保護

幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第52頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六

★巰基的保護④測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽鏈的N-末端和C-末端

★末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定的主要方法有：第53頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成第54頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六N端的測定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法第55頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應

（sanger反應）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸第56頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六Sanger試劑(FDNB)標記N末端Sanger試劑標記反應第57頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB測定蛋白質N端氨基酸，靈敏度高?；磻?8頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應

（Edman反應）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+第59頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六Edman降解法(I)DABITC:有色Edman試劑在Edman試劑上加發(fā)色基團Edman降解法1第60頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六Edman降解法(II)Edman降解法2第61頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六無冕英雄PehrVictorEdman

1946-47年在美國留學時想到改進1930年Abderhalden&Brockmann發(fā)明的

PITC試劑的反應,50年發(fā)明Edmandegradation反應.ActaChemScand4:283(1950)1957年移居墨爾本,遠離國際學術中心開始過隱居生活,1967年研制的自動化儀器可以達到每小時一個氨基酸的速度;他堅持不申請專利,給了美國公司得以隨便開發(fā)儀器的方便.1972年到德國,77年因腦瘤過世.第62頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六由于Edman降解產(chǎn)物需要在紫外域進行檢測,只有HPLC和相應的紫外檢測手段進步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用該反應測定了RNase的一級結構,遺憾的是Edman沒有和他們分享Nobel化學獎.第63頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六1、肼法2、還原法3、酶降解法C端的測定方法第64頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質與無水肼加熱

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

|

|

Rx

Ry

--+--+NH-CH-CONH-NH2

+

NH2-CH-COOH

|

|

Rx

Ry肼(hydrazine)法測定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有機溶劑而被除去多種方法確定肼法C端測定第65頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六還原法碳末端氨基酸通過硼氫化鋰還原為氨基醇，水解后氨基醇可以進行鑒別第66頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六羧肽酶法：

羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質的C-末端殘基順序。第67頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六常用的羧肽酶羧肽酶A：釋放除了Pro、Arg、Lys之外的所有C-末端殘基羧肽酶B：僅能水解Arg、Lys為C-末端的氨基酸殘基二者混用羧肽酶Y：作用于任何一個C-末端殘基第68頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六二硫橋的斷裂過甲酸氧化法巰基化合物還原法注意

1暴露二硫鍵

2保護巰基第69頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六使用的還原劑有巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇（DTT）

-巰基乙醇H0－CH2CH2－SH巰基保護劑：碘乙酰胺、碘乙酸、3－溴丙胺等。第70頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六氨基酸組成的分析方法：酸水解，輔以堿水解表達方法每摩爾蛋白質中含有的氨基酸殘基的摩爾數(shù)

100克蛋白質中含有的氨基酸的克數(shù)。第71頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)將肽鏈的氨基酸從N端

(aminopeptidase)或C端

(carboxypeptidase)一個接一個游離出來，

在不同時間取樣進行分析，根據(jù)所游離的氨基酸判斷氨基酸的排列順序。酶解法末端測序酶解法末端測序第72頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六常

用

的

酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶第73頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六胰蛋白酶肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷，是特異性最強的蛋白酶，在測定蛋白質的氨基酸排列中，是不可缺少的工具。牛的胰蛋白酶氨基酸殘基223個，分子量為23300，活性部位的絲氨酸殘基是不可缺少的絲氨酸蛋白酶。第74頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）屬于肽鏈內切酶，主要切斷多肽鏈中的芳香族氨基酸殘基的羧基一側斷裂點鄰近的基團為堿性，斷裂能力增強；酸性斷裂能力減弱第75頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六胃蛋白酶胃蛋白酶在對蛋白或多肽進行剪切時，具有一定的氨基酸序列特異性。斷裂點兩側的殘基都是疏水性氨基酸胃蛋白酶在酸性環(huán)境中具有較高活性，其最適pH值約為3。在中性或堿性pH值的溶液中，胃蛋白酶會發(fā)生解鏈而喪失活性。常用來確定二硫鍵的位置

第76頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六肽鍵的專一性水解(化學法)化學法:CNBr,H+,NH2OH,etc化學法專一性水解第77頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六溴化氰水解法(CNBr):切割Met

的羧基所形成的肽鍵。用羥胺斷裂:它斷裂－Asn-Gly-,但專一性不高。蛋白質中出現(xiàn)機率低，適于分子量大的蛋白質序列的測定。第78頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六消化道內幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）第79頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六氨基酸的鑒定、分離純化PTH-AA氨基酸的確定第80頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六肽段在多肽鏈中次序的決定資料：N-末端殘基H,C-末端殘基S;第一套肽段第二套肽段OUS

SEOPS

WTOUEOVE

VERLRLA

APSHOWT

HO第81頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六借助重疊肽確定肽段次序：末端殘基HS末端肽段HOWT

APS

或

OUS第一套肽段：HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段：HO

WTOU

SEO

VERL

APS推斷全序列:

HOWTOUSEOVERLAPS第82頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第83頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第84頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂第85頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：

一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。第86頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六1、為防止Cys跟Cys-Cys發(fā)生交換反應，先將自由SH基封閉;2、進行專一性部分水解;3、紙層析分離水解產(chǎn)物;4、氣相過甲酸法切斷S-S鍵，作第二相紙層析;5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進行測序經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法二硫鍵位置確定第87頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六點樣。水解后的混合肽段點在濾紙中央，PH6.5，進行一向電泳，肽段分離開濾紙在甲酸蒸氣中暴露斷裂二硫鍵。含二硫鍵的肽段被氧化成一對含磺基丙氨酸的肽。濾紙轉90度在與第一向相同的條件下，進行二向電泳肽斑用茚三酮顯色確定第88頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六對角線電泳示意圖第89頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六現(xiàn)用蛋白質一級

結構分析方法第90頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六分離純化蛋白質酶切部分水解后分離短肽對短肽進行測序構建cDNA文庫根據(jù)序列設計探針篩選cDNA文庫根據(jù)cDNA序列推測蛋白質的一級結構第91頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六

N末端和C末端的測序除了用于未知蛋白質的一級結構的研究以外，最常用于基因工程表達產(chǎn)物的末端分析。末端測序的用途第92頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六常利用蛋白質數(shù)據(jù)庫//第93頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質氨基酸順序與生物功能

研究蛋白質一級結構與功能的關系主要：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關系。進行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學修飾及切割實驗等。第94頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六例1鐮刀形貧血病

患者血紅細胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基使血紅蛋白細胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血這說明了蛋白質分子結構與功能關系的高度統(tǒng)一性第95頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六蛋白質一級結構的個體差異第96頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第97頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六例2一級結構的局部斷裂與蛋白質的激活

體內的某些蛋白質分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質原.蛋白質原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原第98頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽.信號肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.第99頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六例3同源蛋白

同源蛋白：是指在不同有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質.同源蛋白中的一級結構中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關系的遠近.第100頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六例：細胞色素C60個物種中，有27個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關系相關。親緣關系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）.第101頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六第102頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六黃色：不變殘基（invariableresidues）藍色：保守氨基酸（conservativeresidues）未標記：可變殘基（variableresidues）第103頁，共109頁，2022年，5月20日，7點48分，星期六不同生物來源的細胞色素c中不變的AA殘基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTr