蛋白質(zhì)的研究方法與原理

關(guān)于蛋白質(zhì)的研究方法與原理第1頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第一節(jié)概述第2頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來；2.將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀下來;

（鹽析法或有機(jī)溶劑法）3.應(yīng)用層析法或電泳法使它們各自分開；4.蛋白質(zhì)結(jié)晶；5.蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測(cè)定。直接從生物組織中提純蛋白——第3頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

制備過程中注意事項(xiàng)：要求自始至終保持在天然狀態(tài)避免一切過激因素--如過酸或過堿，高溫，重金屬等的影響。2.通常都在低溫條件下操作。3.盡可能使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高水平。第4頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第二節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)第5頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六一、蛋白質(zhì)沉淀與結(jié)晶第6頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

（一）鹽析法

概念：將中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。各種蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度及PH不同，加入不同濃度的中性鹽可使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便對(duì)易變性的蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，適用范圍十分廣泛。缺點(diǎn)：分辨能力差，純化倍數(shù)低第7頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（1）鹽的種類對(duì)同一種Pr而言，價(jià)數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力也愈強(qiáng):

PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞

AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CNS-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+常用的中性鹽有如硫酸鹽、磷酸鹽等。第8頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六硫酸銨（常用鹽析劑）

優(yōu)點(diǎn)：鹽析能力較強(qiáng)具有較高的溶解度較低的溶解度溫度系數(shù)價(jià)格低廉不產(chǎn)生副作用。

缺點(diǎn)：緩沖能力較差

PH難控制第9頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（2）PH和溫度S。代表蛋白質(zhì)在無機(jī)鹽溶液中的溶解度

除取決于Pr的種類，還受PH及溫度影響:PH=PI時(shí)，S。的數(shù)值極小

S。隨溫度增加而減低。鹽析過程中，若增高溫度，有助于Pr的析出。第10頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（3）蛋白質(zhì)濃度

[Pr]較高，在較低無機(jī)鹽濃度時(shí),蛋白質(zhì)便開始析出，鹽析界限比較寬。

[Pr]較低，需要無機(jī)鹽的濃度也高，即鹽析界限變窄。第11頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六1.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性離子形式存在。此時(shí)若添加有機(jī)溶劑，由于有機(jī)溶劑可使溶液電離常數(shù)減小，增強(qiáng)了中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。（2）有機(jī)溶劑本身的水合作用會(huì)破壞Pr表面的水合層，也促使Pr變得不穩(wěn)定而聚集析出.常用的有機(jī)溶劑：乙醇和丙酮

（二）有機(jī)溶劑沉淀法

分辨力比鹽析方法高，提純效果好

第12頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（三）選擇性沉淀法

選擇一定的條件使其它蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離方法。例如，將提取液加熱至一定溫度并維持一段時(shí)間，是某些不耐熱的蛋白質(zhì)變性沉淀等。應(yīng)用選擇星辰殿，徐實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)中需除去的及欲提純的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)均有較全面的了解。第13頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（四）蛋白質(zhì)結(jié)晶

蛋白質(zhì)結(jié)晶即是溶液中的蛋白質(zhì)由隨機(jī)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸?guī)則排列狀態(tài)的固體，常用語分析研究其結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)晶是一個(gè)有序化過程，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)，能夠形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由運(yùn)動(dòng)的能量，不斷地結(jié)合到形成的晶核上，長成適合于X線衍射分析的晶體。第14頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六二、離心技術(shù)分離蛋白質(zhì)

離心技術(shù)是利用物體告訴旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其它顆粒分離之目的。第15頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六三、層析技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)最基本的特征：固定相流動(dòng)相層析技術(shù)（chromatography）又稱色譜技術(shù)，是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。

各種物質(zhì)得以分離的最基本原因：就在于它們?cè)谶@兩個(gè)相之間具有不同的分配系數(shù).兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次的分配，即使它們的分配系數(shù)只有微小的差異，通過這個(gè)過程也能得到最大的分離效果。第16頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

氣相層析按兩相狀態(tài)來分液相層析

吸附層析

分配層析離子交換層析按層析機(jī)理來分

凝膠排阻層析

親和層析

柱層析按操作方式來分薄層層析

紙層析層析技術(shù)的種類第17頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

（一）凝膠過濾層析又稱分子篩或凝膠過濾（gelfiltration）原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時(shí)，直徑大于孔徑的分子將不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的分子進(jìn)入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱內(nèi)保留時(shí)間就比較長。這樣，較大的分子被先洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達(dá)到相互分離的目的。第18頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第19頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

離子交換層析法*原理：陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相）填充在層析柱內(nèi)，由于陰（陽）離子交換樹脂顆粒上帶正（負(fù)）電荷，能吸引溶液中的陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，增加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。第20頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第21頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

親和層析法原理：利用生物高分子具有能和某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性。

如，酶的活性部位能和底物\抑制劑\輔助因子專一性地結(jié)合,改變條件又能使這種結(jié)合解除.[酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子（或稱效應(yīng)物）之間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié)合蛋白與結(jié)合物之間]。這些被作用的對(duì)象物質(zhì)稱之為配基（ligand)。第22頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

高效液相層析法（HighPerformanceLiquidChromatography

，HPLC）

又稱“高壓液相色譜，是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

第23頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六四、電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)電泳（electrophoresis）是指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷相反方向電極移動(dòng)的現(xiàn)象。第24頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS–(十二烷基硫酸鈉)是陰離子型去污劑(Sodiumdodecylsulfate,SDS)Qu=

（遷移率）6πrηu與Q、r有關(guān)

若蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在SDS中進(jìn)行電泳，由于分子篩效應(yīng)，

u僅取決于分子的大小。因此SDS一凝膠電泳可以按蛋白質(zhì)分子大小的不同將其分開。這時(shí)，若以分子量的對(duì)數(shù)（logM）對(duì)相對(duì)于染料前沿的遷移率（Rf）作圖，呈現(xiàn)線性關(guān)系。

第25頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第26頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

這種關(guān)系，對(duì)一種膠濃度時(shí)，只適用于一定的分子量范圍：

5％膠濃度時(shí)，適用于分子量6～200萬的區(qū)間；

10％膠濃度時(shí)，適用于分子量1.6～7萬的區(qū)間；

15％膠濃度時(shí)，適用于分子量1.2～4.5萬的區(qū)間。

第27頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜第28頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

等電聚焦電泳——（isoelectricfocusing,IEF）

是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)趐H梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)。利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)pH梯度。

pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場(chǎng)作用下，自然形成pH梯度。

凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等

第29頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

Pr分子有一定的PI，它處在一個(gè)由陽極到陰極梯度逐漸增加的介質(zhì)中，并通過以直流電時(shí)，它便“聚焦”在與其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白質(zhì)泳動(dòng)后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。第30頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六優(yōu)點(diǎn)：1.有很高的分辨率；2.可以區(qū)分等電點(diǎn)只有0.01pH單位差異的蛋白質(zhì)；3.根據(jù)其所在位置還能夠測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量；4.對(duì)很稀的樣品，最后達(dá)到高度的濃縮。第31頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳--PI第二向采用SDS一凝膠電泳--分子量由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量?jī)煞N完全不同的特一性來進(jìn)行分離，因此具有非常高的分辨率可同時(shí)分析幾千上萬個(gè)蛋白，分辨率高，分離度好。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。第32頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六雙向PAGE第33頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維電泳中還很難被檢測(cè)到：①等電點(diǎn)（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白質(zhì)；②分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于l00kDa的蛋白質(zhì)就比實(shí)際的少了，而大于150kDa的蛋白質(zhì)就幾乎完全探測(cè)不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質(zhì)都能清楚地被觀察到；③疏水性蛋白質(zhì)。

雙向電泳技術(shù)缺點(diǎn)第34頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六高效毛細(xì)管電泳第35頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）

毛細(xì)管區(qū)帶電泳也稱為自由溶液溶液區(qū)帶電泳,這種電泳模式的特征是整個(gè)系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿，帶電粒子的遷移速度依賴物質(zhì)的荷/質(zhì)比差異。荷/質(zhì)比越大，泳動(dòng)越快。第36頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六2.毛細(xì)管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）

將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。第37頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六3.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC）

緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長；可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。

在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。第38頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六4.毛細(xì)管等電聚焦電泳（Capillaryisoelectricfocusing，CIEF）

是根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；CIEF是在毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)，當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；此法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、純度鑒定、不同變異體的分析等。第39頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六5.毛細(xì)管等速電泳（Capillaryisotachophoresis，CITP）

將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。負(fù)離子分析時(shí)，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽極檢測(cè)。第40頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六6.親和毛細(xì)管電泳（affinitycapillaryelectrophoresis,ACE）

是毛細(xì)管內(nèi)壁涂布或在凝膠中加入親和配基，以親和力的不同達(dá)到分離目的。第41頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六7.毛細(xì)管電動(dòng)色譜（Capillaryelectrokineticchromatography，CEC）

在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機(jī)械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動(dòng)色譜過程。第42頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第三節(jié)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法第43頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法較多基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性建立起來的。第44頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法:定氮法,雙縮脲法(Biuret法)，F(xiàn)olin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法.另外還有一種近十年才普遍使用起來的新測(cè)定方法,考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法靈敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凱氏定氮法比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。第45頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六一、凱氏定氮法

凱氏定氮法的原理基于蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，通過測(cè)定樣品中氮元素的量來計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量?；静僮鬟^程：①用硫酸對(duì)樣品加熱消化，蛋白質(zhì)被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被還原成NH3

，并形成(NH4)2SO4

；②加入強(qiáng)堿，使硫酸銨釋放出NH3，并將NH3收集在無機(jī)酸液中；③用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定，確定NH3量；④根據(jù)量確定樣品含氮量，進(jìn)而求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。第46頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六(1)H2NCH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(2)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(3)(NH4)SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3此法靈敏度低,適用于μg氮,誤差為2%,最大缺點(diǎn)是受樣品中非蛋白質(zhì)含氮化合物的影響。測(cè)定前需用蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。第47頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六優(yōu)點(diǎn)凱氏定氮法由于具有測(cè)定準(zhǔn)確度高，可測(cè)定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點(diǎn)，因而被公認(rèn)為是測(cè)定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。

1、酒精燈2、蒸汽發(fā)生器3、長玻璃管4、橡皮管5、小玻杯6、棒狀玻璃塞7、反應(yīng)室8、反應(yīng)室外殼9、夾子10、反應(yīng)室中插管11、冷凝管12、錐形瓶13、石棉網(wǎng)第48頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六二、紫外吸收法

蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系符合朗伯-比耳定律，因此，可用比色法直接測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。第49頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

在測(cè)定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白質(zhì)的濃度：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45×A280nm―0.74×A260nm

上式中的OD280nm是蛋白質(zhì)溶液在280nm下測(cè)得的光密度，OD260nm是蛋白質(zhì)溶液在260nm下測(cè)得的光密度。第50頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六優(yōu)點(diǎn)：1.快速；2.對(duì)蛋白質(zhì)無破壞性。缺點(diǎn)：1.不是嚴(yán)格的定量方法。因?yàn)榇朔ㄊ歉鶕?jù)酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）殘基的強(qiáng)吸收值來測(cè)定的，不同的蛋白質(zhì)具有不同的消光系數(shù)。另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中不含Tyr、Phe或Trp殘基時(shí)，該方法就不能檢出蛋白。（此法用于測(cè)粗提總蛋白濃度較為適宜）2.核酸可引起強(qiáng)烈干擾。

第51頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（一）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

考馬斯亮藍(lán)G-250法是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈棕紅色，在465nm下有最大吸收峰；當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈青藍(lán)色。在一定范圍內(nèi)，也就是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量在0~1000μg范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，所以可用比色法測(cè)定。第52頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

優(yōu)點(diǎn)是：

（1）靈敏度高：蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度較高，最低檢出量為1ug蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便：染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。第53頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（二）lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的Tyr和Phe殘基還原，產(chǎn)生深蘭色的鉬蘭和鎢蘭的混合物。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在680nm處測(cè)定樣品吸光值，確定其蛋白質(zhì)含量。第54頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，靈敏度比較高。缺點(diǎn)：Folin-酚試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中的酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法受蛋白質(zhì)特異性影響，蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得顯色強(qiáng)度也不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線。此方法的初步顯色是雙縮脲反應(yīng)，因此，凡是干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)（因素）都會(huì)干擾Folin-酚反應(yīng)。第55頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第四節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法第56頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析步驟：①分離蛋白質(zhì)樣品必需純（>97%以上）。②測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。

③巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，產(chǎn)生單一多肽鏈。

④分離純化單一多肽鏈。⑤測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。⑥多肽鏈斷裂可采用特異的酶或化學(xué)試劑將多肽樣品斷裂成肽碎片，并將其分離開來。⑦對(duì)每一肽段進(jìn)行測(cè)序。⑧確定肽段在多肽鏈中的次序。⑨確定蛋白質(zhì)分子中二硫鍵及酰胺基的位置以及磷酸化、糖基化位點(diǎn)。第57頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（一）測(cè)序前的準(zhǔn)備工作1.多肽鏈氨基端和羧基端分析2.多肽鏈氨基酸組成分析3.多肽鏈有限水解為若干個(gè)肽段N-端：丹酰氯—丹酰肽層析分離鑒定C-端：肼解法，羧肽酶法高效液相色譜測(cè)定氨基酸的種類和含量采用特異性的酶或化學(xué)試劑將單一多肽鏈有限水解為具有部分重疊的若干個(gè)肽段。第58頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（二）多肽鏈氨基酸序列測(cè)定1.Edman降解法Edman降解法：是肽鏈或蛋白質(zhì)中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲爾·埃德曼（PehrEdman）首先創(chuàng)立。第59頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

原理：用異硫氰酸苯酯（PITC）與待分析多肽的N-端氨基在堿性條件下反應(yīng)，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸處理，關(guān)環(huán)，肽鏈N-端被選擇性地切斷，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機(jī)溶劑將該衍生物萃取出來，酸作用下，該衍生物不穩(wěn)定，會(huì)繼續(xù)反應(yīng)，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鑒定出是哪一個(gè)氨基酸。每反應(yīng)一次，結(jié)果是得到一個(gè)去掉N-端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，繼續(xù)發(fā)生降解。第60頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

優(yōu)點(diǎn)：

能夠可靠地測(cè)定肽鏈的30個(gè)左右氨基酸殘基序列，最多可以分析50-60個(gè)氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，缺點(diǎn)：由于Edman降解是以化學(xué)試劑對(duì)N-端氨基的修飾為基礎(chǔ)的，因此當(dāng)N-端被其他化學(xué)基團(tuán)所封閉時(shí)，就需要先去除這些基團(tuán)，然后才能進(jìn)行測(cè)序。此外，蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸殘基時(shí)，有時(shí)兩個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)發(fā)生二硫鍵交聯(lián)。這種情況下，需要先用過酸將二硫鍵氧化為–SO3H，然后才能用Edman降解測(cè)定序列。第61頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六2.質(zhì)譜法質(zhì)譜技術(shù)－－基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的氨基酸測(cè)序方法是根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定多肽分子質(zhì)量的極高準(zhǔn)確性這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。①先測(cè)定某一肽段（如：A-B-C-D-E-F-G--）以及從C-末端或N-末端去除一個(gè)殘基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子質(zhì)量，二者之差值即為末端殘基（A）的分子質(zhì)量。②然后與20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的分子量進(jìn)行比較就可以確定末端氨基酸的本質(zhì)了。測(cè)定時(shí)：第62頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

實(shí)際操作時(shí)：從質(zhì)譜上得到的是一系列的多肽片段，每對(duì)大小相近的片段之間僅僅相差一個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)這一分子量差值的大小，較大肽段的末端殘基即可準(zhǔn)確判斷。換句話說，從獲得的一系列依次相差一個(gè)殘基的肽段的分子質(zhì)量中我們很快就可以確定最初樣品多肽的末端序列（從N一末端或C一末端開始）。第63頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析（一）X射線衍射晶體分析法（二）核磁共振法（三）圓二色譜法（四）傅里葉變換紅外光譜法（五）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)第64頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（一）X射線衍射晶體分析法第65頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六X射線本質(zhì)

X射線是一種短波長(0.005～10nm)、高能量(2.5×105

～1.2×102eV)的電磁波。它是原子內(nèi)層電子在高速運(yùn)動(dòng)電子流沖擊下，產(chǎn)生躍遷而發(fā)射的電磁輻射。第66頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析基本原理

X射線衍射分析所依賴的基本原理是X射線衍射現(xiàn)象

X射線衍射現(xiàn)象利用X射線的波長和晶體中原子的大小及原子間距同數(shù)量級(jí)的特性來分析晶體結(jié)構(gòu)。當(dāng)X射線入射到樣品晶體分子上時(shí)，分子上的每個(gè)原子使X射線發(fā)生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的許多資料，如原子間的距離、鍵角，分子的立體結(jié)構(gòu)、絕對(duì)構(gòu)型、原子和分子的堆積、有序或無序的排列等。

第67頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（二）核磁共振法1946年美國斯坦福大學(xué)的F.Bloch和哈佛大學(xué)的兩個(gè)研究小組首次獨(dú)立觀察到核磁共振現(xiàn)象，為此他們兩人獲1952年諾貝爾物理獎(jiǎng)。1983年，瑞士科學(xué)家KurtWüthrich教授實(shí)驗(yàn)室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液構(gòu)象.發(fā)明了利用核磁共振(NMR)技術(shù)測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法獲得了2002年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

第68頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

NMR基本原理核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是處于某個(gè)靜磁場(chǎng)中的自旋核系統(tǒng)受到相應(yīng)頻率的射頻磁場(chǎng)作用時(shí),共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。核磁共振波譜是測(cè)量原子核對(duì)射頻輻射(約4600MHz)的吸收，這種吸收只有在高磁場(chǎng)中才能產(chǎn)生。

核磁共振波譜儀第69頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六核磁共振法中幾個(gè)常用的參數(shù)化學(xué)位移耦合常數(shù)NOE（核歐沃豪斯效應(yīng)）信號(hào)強(qiáng)度譜峰面積弛豫時(shí)間第70頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（1）化學(xué)位移

δ值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出現(xiàn)在低場(chǎng)；δ值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出現(xiàn)在高場(chǎng)。第71頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（2）耦合常數(shù)核與核之間以價(jià)電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現(xiàn)象稱為自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為自旋－自旋耦合常數(shù),用J表示。耦合常數(shù)用來表征兩核之間耦合作用的大小。J耦合常數(shù)大小主要與連接兩個(gè)核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān)，與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分布的因素有關(guān)。第72頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

（3）NOE信號(hào)強(qiáng)度

當(dāng)分子內(nèi)有兩個(gè)空間距離小于0.5nm的原子核時(shí)，如果用雙共振法照射其中一個(gè)核，使干擾場(chǎng)的強(qiáng)度增加到剛使被干擾的譜線達(dá)到飽和，則另一個(gè)靠近的原子核的共振信號(hào)就會(huì)增加，這種現(xiàn)象稱核歐沃豪斯效應(yīng)（NOE）。第73頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（4）譜峰面積譜峰面積和分子中同一化學(xué)環(huán)境的原子核數(shù)目的多少成正比，因此峰面積的積分值可用來做定量分析的基礎(chǔ)。第74頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（5）弛豫時(shí)間原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過程叫弛豫過程。它所需的時(shí)間叫弛豫時(shí)間。自旋晶格弛豫：處于高能態(tài)的氫核，把能量轉(zhuǎn)給周圍的分子，回到低能態(tài)。

自旋-自旋弛豫：兩個(gè)進(jìn)動(dòng)頻率相同，進(jìn)動(dòng)取向不同的磁性核，在一定距離內(nèi)時(shí)，它們相互交換能量，改變進(jìn)動(dòng)方向。

第75頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

二維核磁共振(2DNMR）NMR可獲得分子內(nèi)各核的化學(xué)環(huán)境、核間的耦合關(guān)系、空間構(gòu)象等信息，但是當(dāng)分子較大的時(shí)候，由于裂分譜線間的重疊，因此在測(cè)定了同一種核的一維譜之后，需要了解兩種或三種不同核之間的聯(lián)系關(guān)系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2個(gè)頻率變量的函數(shù)，吸收峰對(duì)2個(gè)頻率變量作圖。1H-1HCOSY、

1H-15NHSQC第76頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六核磁共振技術(shù)的應(yīng)用早期核磁共振主要用于對(duì)核結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究，如測(cè)量核磁矩、電四極距、及核自旋等。后來廣泛應(yīng)用于分子組成和結(jié)構(gòu)分析，生物組織與活體組織分析，病理分析、醫(yī)療診斷、產(chǎn)品無損監(jiān)測(cè)等方面第77頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（三）圓二色譜法圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種簡(jiǎn)單、快速而又較準(zhǔn)確的方法。圓二色譜是利用不對(duì)稱分子對(duì)左、右圓偏振光吸光率的不同來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。1969年，Greenfield用圓二色光譜數(shù)據(jù)估計(jì)了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。此后，關(guān)于利用圓二色譜研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的報(bào)道逐漸增多。第78頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六平面偏振光：指振動(dòng)方向在同一平面內(nèi)的電磁波。圓偏振光：當(dāng)兩束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差1/4波長(90°)時(shí)，其合成矢量繞光傳播方向旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，朝著光源方向觀察時(shí)，電場(chǎng)矢量E末端軌跡為圓形，所以稱之為圓偏振光。電場(chǎng)矢量方向順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右圓偏振光，逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的則稱左圓偏振光。橢圓偏振光：振幅不等的左、右圓偏振光合成第79頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六圓二色性和圓二色譜圓二色性：當(dāng)左、右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時(shí)，光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)它們的吸收不一樣，它們的差值就是圓二色性光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)左、右圓偏振光的吸收不一樣，這種吸收差造成矢量振幅差，從介質(zhì)出來的光成為橢圓偏振光，用橢圓度或吸收差表示圓二色譜：指橢圓度(或比橢圓度等)與波長的關(guān)系，它在本質(zhì)上與旋光色散譜是一樣的。第80頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六圓二色譜的應(yīng)用在分子生物學(xué)中，圓二色儀主要應(yīng)用于測(cè)定生物大分子的空間結(jié)構(gòu)。生物大分子很多是不對(duì)稱的，即光學(xué)活性分子，通過圓二色譜測(cè)定和計(jì)算能夠了解生物大分子在溶液狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第81頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)或多肽是由氨基酸通過肽鍵連接而成的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，主要的光學(xué)活性生色基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵，另外，有的蛋白質(zhì)輔基對(duì)蛋白質(zhì)的圓二色性有影響。肽鍵的不對(duì)稱性使得它總有光活性第82頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)的圓二色性主要由活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和。根據(jù)電子躍遷能級(jí)能量的大小，蛋白質(zhì)的CD光譜分為三個(gè)波長范圍:1）250nm以下的遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)，圓二色性主要由肽鍵的n→π*電子躍遷引起；遠(yuǎn)紫外CD主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的解析

2）250～300nm的近紫外光譜區(qū)，主要由側(cè)鏈芳香基團(tuán)的π→π*電子躍遷引起；近紫外CD主要揭示蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)信息

3）300～700nm的紫外-可見光光譜區(qū)，主要由蛋白質(zhì)輔基等外在生色基團(tuán)引起。紫外-可見光CD主要用于輔基的偶合分析。

第83頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六肽鍵是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況。具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。因此，根據(jù)所測(cè)得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第84頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

α-螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶，在222和208nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶；β-折疊的CD光譜在216nm有一負(fù)譜帶，在185～200nm有一正譜帶；β-轉(zhuǎn)角在206nm附近有一正CD譜帶，而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的CD譜帶，如上圖和表所示。

-band(nm)+band(nm)α-螺旋222，208192β-折疊216195β-轉(zhuǎn)角220-230(弱)，180-190（強(qiáng)）205左手螺旋P2結(jié)構(gòu)190210-230（弱）無規(guī)則卷曲200212第85頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第86頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

CD數(shù)據(jù)擬合計(jì)算蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法基本原理是假設(shè)蛋白質(zhì)在波長λ處的CD信號(hào)θ(λ)是蛋白質(zhì)中或多肽各種二級(jí)結(jié)構(gòu)組分及由芳香基團(tuán)引起的噪音的線性加，θ(λ)=Σfiθ(λ)i+noise。θ(λ)i是第i個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的CD信號(hào)值，fi為第i個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的含量分?jǐn)?shù)，Σfi規(guī)定值為1；通過已知蛋白（或稱參考蛋白）二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色數(shù)據(jù)庫，曲線擬合未知蛋白或多肽的圓二色數(shù)據(jù)，估算未知蛋白或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第87頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)擬合計(jì)算方法中，主要采用多聚氨基酸為參考多肽。Greenfield等采用多聚L-lys作參考多肽，建立α-螺旋、β-折疊及無規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)參考CD光譜曲線，采用單一波長法（208nm）計(jì)算出α-螺旋含量后，然后假設(shè)不同的β-折疊含量（Xβ）值，并假設(shè)CD值是α-螺旋含量(XH)、β-折疊含量(Xβ)無規(guī)卷曲(XR)三者貢獻(xiàn)值的加和，即：

XH+Xβ+XR=1

第88頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

通過計(jì)算得到不同波長的θ(λ)，得出計(jì)算曲線。假設(shè)一些不同的Xβ值，分別求出它們相應(yīng)的計(jì)算曲線，找出與實(shí)驗(yàn)曲線最接近的曲線，相應(yīng)于該最接近曲線的Xβ及XR即認(rèn)為是該蛋白質(zhì)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)含量。第89頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六Examplefit:myoglobin(肌紅蛋白)Inthiscase:qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith xa=80%, xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coil第90頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（四）傅里葉變換紅外光譜法傅里葉變換紅外光譜法(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIS)主要是對(duì)其紅外光譜中酰胺I譜帶進(jìn)行分析。酰胺I譜帶為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等不同結(jié)構(gòu)振動(dòng)峰的加和帶，彼此重疊，在1260~1700cm-1范圍內(nèi)通常為一個(gè)不易分辨的寬譜帶。目前常應(yīng)用去卷積、微分等數(shù)學(xué)方法，使加合帶中處于不同波數(shù)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等各個(gè)吸收峰得以分辨。最后經(jīng)譜帶擬合，獲得各個(gè)吸收峰的信息。第91頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（五）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)1.同源模建法是預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要方法，通過對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析可以得到結(jié)論：任何兩種蛋白質(zhì)，如果兩者的序列同源部分超過30%，則它們具有相似的三維結(jié)構(gòu)，及他們的基本折疊相同，只是在非螺旋和非折疊區(qū)域的一些細(xì)節(jié)部分有所不同。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的序列更保守，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列有50%相同，那么約有90%的α碳原子的位置偏差不超過3%。第92頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六主要步驟：①識(shí)別模擬的模板；②目標(biāo)序列和模板序列的排列；③構(gòu)建模型；④構(gòu)建非保守的loop區(qū)；⑤安裝側(cè)鏈；⑥模型修飾；⑦結(jié)構(gòu)合理性評(píng)估第93頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六2.折疊識(shí)別法也稱穿線法（threading）。通過對(duì)已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，大量序列同源性較差的蛋白質(zhì)存在相同的折疊結(jié)構(gòu)。折疊識(shí)別法就是利用已知蛋白質(zhì)的折疊子為模板，尋找給定氨基酸序列可能采取的折疊類型，進(jìn)而進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。第94頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六主要步驟：①建立模板數(shù)據(jù)庫；②構(gòu)造打分函數(shù)；③比對(duì)；④預(yù)測(cè)第95頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六3.從頭預(yù)測(cè)法

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從頭預(yù)測(cè)是不依賴模板僅從氨基酸序列信息得到天然結(jié)構(gòu)。它的關(guān)鍵是正確定義能量函數(shù)、精確選用計(jì)算機(jī)搜索算法來尋找能量最低值。第96頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第五節(jié)蛋白質(zhì)功能分析方法第97頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六一、酵母雙雜交技術(shù)利用雜交基因通過激活報(bào)告基因的表達(dá)，探測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。

第98頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第99頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)告基因的表達(dá)探測(cè)蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含Transcription-activatingdomain的載體。1）兩種蛋白之間是否有相互作用2）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白應(yīng)用

第100頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六二、噬菌體展示技術(shù)第101頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第102頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六三、表面等離子共振技術(shù)第103頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)第104頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六生物芯片基因芯片蛋白質(zhì)芯片微流控芯片蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。

第105頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六第106頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六（一）蛋白質(zhì)芯片的分類1.根據(jù)應(yīng)用分類:

①蛋白檢測(cè)芯片

將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用于識(shí)別復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)蛋白/多肽。根據(jù)檢測(cè)方法,不同蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片又可進(jìn)一步分為正相蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片和反相蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片。②蛋白功能芯片天然蛋白點(diǎn)加在基片上，了解體系中哪種蛋白能與已知的某種蛋白結(jié)合，用于天然蛋白活性及分子親和性研究。第107頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六2.根據(jù)載體分類：普通玻璃載體芯片、微孔型芯片、多孔凝膠覆蓋芯片3.由CiphergenBiosystems提出的化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片和生物型蛋白質(zhì)芯片。第108頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用臨床檢驗(yàn)及環(huán)境毒物檢測(cè)所需的免疫檢測(cè)和酶活性分析高通量抗體篩選蛋白質(zhì)組學(xué)研究生物大分子間的相互作用蛋白質(zhì)和小分子間的相互作用藥物靶標(biāo)及其作用機(jī)理的研究疾病診斷食品中有毒有害物質(zhì)的分析、在毒理學(xué)及衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用第109頁，共121頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)48分，星期六五、免疫印跡技術(shù)免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting），是檢測(cè)蛋白質(zhì)混合物中某種特定蛋白質(zhì)的定性方法，也可以用于確定同一種蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或同一種細(xì)胞不同條件下相對(duì)含量的半定量方法。免疫印跡也是利用抗原抗體特異反應(yīng)的原理。免疫印跡技術(shù)（Westernblotting)分三個(gè)階段進(jìn)