生物制藥工藝學親和純化技術080416課件

1技術要點（1）找與底物專一可逆結合的配基；（2）將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質；（3）配基與底物吸附；（4）洗脫目標物。

1技術要點（1）找與底物專一可逆結合的配基；2親和純化技術親和層析(Affinitychromatography)親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團萃?。ǚ茨z團萃取）親和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）2親和純化技術親和層析(Affinitychromatog3第一節(jié)親和層析

(AffinityChromatography)利用生物大分子物質具有與某些相應的分子專一性可逆結合的特性而建立的層析技術。

適用于從成份復雜且雜質含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。3第一節(jié)親和層析

(AffinityChromatogr4特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質；特異性強、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。4特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質；5親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱為配基（Ligand）。與配基結合的層析介質稱為載體（Matrix）。5親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱6一、親和層析的原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結合成具有特異親和性的分離介質。（2）吸附樣品：親和層析介質選擇性吸附生物活性物質.

（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質解吸。

動畫6一、親和層析的原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結合成7二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：（1）充分功能化，與配基進行共價連接。（2）有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性。（3）具有高度的水不溶性和親水性。（4）具有多孔的立體網(wǎng)狀結構。（5）應為大小均勻的剛性小球。7二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：8（二）、常用載體

纖維素

(cellulose)瓊脂糖凝膠

葡聚糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

多孔玻璃珠（Bio-Glass）

其它載體——殼聚糖

(Chitosan)8（二）、常用載體纖維素(cellulose)91、纖維素纖維素結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強，空間位阻。主要用于分離與核酸有關的物質。

91、纖維素纖維素結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。102、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結構疏松孔徑大，流速快。SepharoseCL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH3~14中應用。

102、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sep11

3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應用受到限制。

4、聚丙烯酰胺凝膠：Bio-gelP

有供化學反應的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。

pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。113、葡聚糖凝膠：12

5、多孔玻璃珠：化學與物理穩(wěn)定性較好，機械強度高。缺點：親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特異性吸附，化學活性基團少。6、其它載體——殼聚糖125、多孔玻璃珠：13殼聚糖(甲殼素和殼聚糖)13殼聚糖(甲殼素和殼聚糖)14三、親和配基

配基的選擇配基的濃度配基偶聯(lián)的位置配基分子的大小配基的類型14三、親和配基配基的選擇15（一）、配基的選擇

親和層析配基的選用主要取決于分離對象。

1、配基與配體有足夠大的親和力（親和勢），KL

在10-4～10-8之間。

2、配基與配體的結合應是專一的。3、配基應具有化學活性。15（一）、配基的選擇親和層析配基的選用主要取決于分離對象16親和勢—KL（EL復合物的解離常數(shù)）

分配比:結合酶/游離酶阻留值:Ve/V016親和勢—KL（EL復合物的解離常數(shù)）分配比:17（二）、配基的濃度

對親和勢比較低的系統(tǒng)（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。增加親和柱的長度來提高吸附率。配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難。理想的配基濃度為1-10μmol/L。17（二）、配基的濃度對親和勢比較低的系統(tǒng)（KL≥10-418（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結合的部位與載體進行偶聯(lián)。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。18（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結合的部19第一節(jié)親和層析一、親和層析的原理二、親和層析載體三、親和配基配基的選擇配基的濃度配基偶聯(lián)的位置配基分子的大小配基的類型19第一節(jié)親和層析一、親和層析的原理20（四）、配基分子的大小

選用大分子配基。小分子物質作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。20（四）、配基分子的大小選用大分子配基。21（五）、配基的類型

較小的有機分子或天然生物活性物質。根據(jù)配基應用和性質:特殊配基和通用配基。特殊配基（specialligand）

21（五）、配基的類型較小的有機分子或天然生物活性物質。22通用配基（generalligand）用于一類物質的分離提純。用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基；用ATP作激酶類親和層析的通用配基；用外源性凝集素作糖蛋白類親和層析時的通用配基等。

22通用配基（generalligand）用于一類物質的分23四、

載體的活化與偶聯(lián)

糖類載體的活化與偶聯(lián)

聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)用于固定化配基的凝膠衍生物

23四、載體的活化與偶聯(lián)糖類載體的活化與偶聯(lián)24（一）、糖類載體活化與偶聯(lián)

溴化氰活化法高碘酸氧化法環(huán)氧化法甲苯磺酰氯法雙功能試劑法24（一）、糖類載體活化與偶聯(lián)溴化氰活化法25溴化氰活化法

載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下用溴化氰處理，可引入活潑的“亞氨基碳酸”中間體。在弱堿的條件下直接與含有游離脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶聯(lián)。25溴化氰活化法載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下用溴化26方法26方法27高碘酸氧化法

多糖載體與0.1mol/L的高碘酸鈉氧化反應24小時會產(chǎn)生醛；在溫和條件下，醛與賴氨酸上的ε-NH2生成西夫堿，接著用硼氫化鈉還原，生成穩(wěn)定的烷基胺。27高碘酸氧化法多糖載體與0.1mol/L的高碘酸鈉氧化反28

環(huán)氧化法堿性條件下，多糖載體與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；環(huán)氧化合物又與氨基酸或蛋白質上氨基偶聯(lián)。28環(huán)氧化法堿性條件下，多糖載體與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化29

甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法在無水丙酮中進行。優(yōu)點：①活化反應迅速；②偶聯(lián)條件溫和；③偶聯(lián)效率高。

29

甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法30雙功能試劑法雙功能試劑是同一分子中具有兩個反應活性基團的化學試劑，常作為連接兩個分子的“橋梁”。

二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐優(yōu)點：反應速度快、條件溫和，能與氨基、糖類、酚、醇類等偶聯(lián)。

30雙功能試劑法雙功能試劑是同一分子中具有兩個反應活性基團的31（二）、聚丙烯酰胺凝膠及

其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)疊氮化法重氮化法(含氨基載體)碳二亞胺縮合法（含羧基載體）31（二）、聚丙烯酰胺凝膠及

其它凝膠衍生物活32聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法有大量可修飾的酰胺基。酰胺基能被含氮化合物置換制備多種衍生物。

32聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法有大量可修飾的酰胺基。33疊氮化法聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亞硝酸，反應液攪90s；加入脂肪胺類配基，制得親和吸附劑。

33疊氮化法聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亞硝酸，34重氮化法ω-氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應，制得對硝基苯甲酰胺烷基瓊脂糖衍生物。用連二亞硫酸鈉還原，亞硝酸鈉處理，得重氮鹽衍生物。配基與重氮鹽衍生物偶聯(lián)，制得親和層析柱。34重氮化法ω-氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應，制35碳二亞胺縮合法碳二亞胺為羧基活化劑。反應中的脲衍生物可用有機溶劑洗滌除去。35碳二亞胺縮合法碳二亞胺為羧基活化劑。36（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物

1、CNBr活化的Sepharose4BSepharose4B經(jīng)CNBr活化，可偶聯(lián)蛋白和核酸類配基。2、AH-Sepharose4B和CH-Sepharose4B含有6個碳原子的”手臂”的瓊脂糖衍生物

AH-Sepharose4B用于含有羧基的一類配基。CH-Sepharose4B能與含有一級氨基的配基偶聯(lián)。36（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物1、CNBr活化的S37

37383、環(huán)氧活化型Sepharose6B由親水“手臂”與Sepharose6B載體通過醚鏈形成的衍生物。用于小分子配基的固定化。用于偶聯(lián)脂多糖、蛋白等大分子配基。383、環(huán)氧活化型Sepharose6B由親水“手臂”與S394、活化型親和膠10和15由N-羥琥珀酰亞胺與瓊脂糖衍生物形成的活化酯。Affi-Gel10的“手臂”長為10個碳原子，產(chǎn)生一些負電荷，有利于堿性或中性蛋白偶聯(lián)；Affi-Gel15為15個碳原子的“手臂”，產(chǎn)生一些正電荷，故有利于酸性蛋白的偶聯(lián)。

394、活化型親和膠10和15由N-羥琥珀酰亞胺與瓊脂糖衍生405、CM-生物膠A、親和膠202和親和膠102CMBio-GelA，無“手臂”的羧基衍生物；Affi-Gel102具有6個原子“手臂”，未端為氨基。Affi-Gel202具有10個原子的“手臂”，未端具有羧基；405、CM-生物膠A、親和膠202和親和膠102CMBi41五、

影響吸附親和力的幾個因素

KL配基濃度對親和力的影響空間障礙的影響配基與載體的結合位點的影響載體孔徑的影響微環(huán)境的影響41五、影響吸附親和力的幾個因素KL42（一）、配基濃度對親和力的影響為將親和配體與其它物質分開，需要阻留值≥10。配基濃度與親和對解離常數(shù)相關。對于低親和力系統(tǒng)，配基濃度。

42（一）、配基濃度對親和力的影響43（二）、空間障礙的影響空間位阻。對于分子大的配體以及小分子配基更明顯?！笆直邸?，增加與載體相連配基的活動度，減輕載體的立體障礙。常用的“手臂”多為烴鏈。

43（二）、空間障礙的影響空間位阻。44（三）、配基與載體的結合位點的影響多肽或蛋白質等大分子配基須控制偶聯(lián)反應條件，使它以最少的功能基團與載體連接。保持蛋白質原有的高級結構，使親和吸附劑具有較大的親和力。

44（三）、配基與載體的結合位點的影響多肽或蛋白質等大分子配45（四）、載體孔徑的影響載體孔隙是配體向配基接近的通道?？讖酱笮ξ絼┯H和能力有影響。（五）、微環(huán)境的影響載體及“手臂”的電性、極性對親和力的影響。避免引入離子鍵的基團。疏水作用的存在，會引起非特異性吸附作用。45（四）、載體孔徑的影響46六、

配基與間隔臂的連接

（一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接46六、配基與間隔臂的連接（一）、含氮配基的連接47七、

親和層析的吸附和洗脫

影響吸附的條件親和層析的洗脫親和吸附劑的再生47七、親和層析的吸附和洗脫影響吸附的條件48（一）、影響吸附的條件

親和吸附劑及配體的性質緩沖液的種類、離子強度、pH、溫度和層析流速有關。溫度升高會使吸附作用減弱。流速每小時低于10ml/cm2。上樣體積為柱床體積的5%。48（一）、影響吸附的條件親和吸附劑及配體的性質49非專一性吸附

親和層析中的非專一性吸附。離子效應疏水基團復合親和力49非專一性吸附親和層析中的非專一性吸附。50離子效應

配基與載體-間隔臂的不完全結合，將無關離子基團引入吸附劑。具有離子基團的親和吸附劑會影響蛋白質的洗脫行為。50離子效應配基與載體-間隔臂的不完全結合，將無關離子基團51疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質結構中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團：（1）長的烴鏈結構的“手臂”：（2）疏水性配基：51疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質結構中的疏水區(qū)相互吸引，52復合親和力離子效應作用，又有疏水作用。配體與配基有較強生物特異性。用高濃度的鹽和有機溶劑，以提高選擇性。52復合親和力離子效應作用，又有疏水作用。53（二）、親和層析的洗脫洗脫：洗脫方法主要有三種：非專一性洗脫特殊洗脫專一性洗脫53（二）、親和層析的洗脫洗脫：54非專一性洗脫

改變洗脫劑的pH。離子強度的分步和梯度變化.親和勢很高，促溶離子，其洗脫能力的強弱順序Cl－<I－<CF3COO－<SCN－

<CCl3COO－。用蛋白質變性劑（如脲或鹽酸胍）。54非專一性洗脫改變洗脫劑的pH。55特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。55特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。56專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）（1）競爭性效應，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會使E洗脫下來（正洗脫）。（2）當ESI穩(wěn)定性與EI相同時，I的存在并不影響E對S的結合，非競爭性效應。（3）反競爭性效應，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結合更緊密（負洗脫）

。56專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）57反競爭性效應57反競爭性效應58親和層析中常用作分離酶的配基有：

酶抑制劑輔酶底物底物結構類似物

58親和層析中常用作分離酶的配基有：59配基的選擇和洗脫條件

59配基的選擇和洗脫條件60（三）、親和吸附劑的再生用緩沖液充分平衡后即可重復使用。親和力下降，非特異吸附增加，大多由變性蛋白沉積造成，用6mol/L脲洗柱。60（三）、親和吸附劑的再生用緩沖液充分平衡后即可重復使用。61八、其他親和層析

金屬離子親和層析有機染料親和層析擬生物親和層析（BiomimeticAFC）

61八、其他親和層析62

（一）、金屬螯合親和層析將環(huán)氧活化型Sepharose6B與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。金屬螯合劑:亞氨二醋酸、氨基水楊酸、8-羥基喹啉、羧甲基氨基酸等

.62

（一）、金屬螯合親和層析將環(huán)氧活化型Sepharose63蛋白質上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，利于蛋白質與固定化金屬離子結合。金屬離子如鋅和銅。63蛋白質上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和64吸附：pH在6~8。洗脫：降低pH值、增加離子強度、或在緩沖液中加5mmol/LEDTA等方法。特點：蛋白質吸附容量大；價格便宜；具有普遍適用性。64吸附：pH在6~8。65（二）、有機染料親和層析需NAD+為輔酶的酶，對染料具有一定親和力。染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱。染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。65（二）、有機染料親和層析需NAD+為輔酶的酶，對染料具有66親和層析一、原理二、親和層析載體三、親和配基

四、載體的活化與偶聯(lián)五、影響吸附親和力的因素六、配基與間隔臂的連接七、親和層析的吸附和洗脫八、其他親和層析66親和層析一、原理67

第二節(jié)其他親和純化技術一、親和過濾（膜分離）二、親和分配（雙水相萃?。┤?、親和反膠團萃取（反膠團萃?。┧摹⒂H和沉淀（沉淀分級）五、親和電泳（電泳）67

第二節(jié)其他親和純化技術68一、親和過濾（AffinityFiltration）將親和層析和膜過濾技術結合運用，包括親和錯流過濾和親和膜分離。親和錯流過濾（affinityCrossFlowFiltration,ACFF）:親和層析與超濾技術結合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。68一、親和過濾（AffinityFiltration）69親和錯流過濾

（affinityCrossFlowFiltration）

基質及大分子親和配基基質是聚合物組成的內核，親和配基連接在內核表面。配基對提取的目標物進行專一可逆的吸附，形成復合體；用膜對混合液進行錯流過濾，復合體因分子巨大可被保留，雜質隨液體透過膜，目標物與其它成分分離。

69親和錯流過濾

（affinityCrossFlo70基質

聚丙烯酰胺

菌類的完整細胞

（酵母、芽胞桿菌、鏈球菌等細胞）

瓊脂糖、脂質體等

酵母細胞純化伴刀豆球蛋白A70基質聚丙烯酰胺酵母細胞純化伴刀豆球蛋白A71親和膜

（affinitymembrane）親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。

將一張微濾膜比喻為一個固定床，膜厚為床層高度。

71親和膜（affinitymembrane）親和膜利用72親和膜優(yōu)點

傳質阻力小，達到吸附平衡的時間短；配基利用率高，配基用量低；壓降小，流速快；設備體積小。72親和膜優(yōu)點傳質阻力小，達到吸附平衡的時間短；73二、親和萃取

（Affinityextraction）定義：利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行的雙水相萃取，在親和配基的親和結合作用下促進目標產(chǎn)物在PEG相（上相）的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。

PEG/Dextran,PEG/無機鹽73二、親和萃取

（Affinityextracti74mA目標分子的親和分配系數(shù)

T和B分別表示上相和下相；mA和mO為有、無配基時目標分子的分配系數(shù)；mL為配基的分配系數(shù)；CL為配基濃度；Kd為配基與目標分子反應的解離常數(shù)。

上相配基濃度CLT越高，mA越大

74mA目標分子的親和分配系數(shù)75親和萃取純化過程

親和分配（進料），雜蛋白反萃取（清洗）目標產(chǎn)物反萃?。ㄏ疵摚?/p>

75親和萃取純化過程親和分配（進料），76三、親和反膠團萃取

（Affinity-basedreversedmicellarextraction）

定義：指在反膠團相中除通常的表面活性劑以外，添加另一種親水頭部為親和配基的助表面活性劑（cosurfactant）；通過親和配基與目標分子的親和結合作用，促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配。76三、親和反膠團萃取

（Affinity-basedr77親和反膠團萃取過程77親和反膠團萃取過程78反萃取78反萃取79四、親和沉淀

（Affinityprecipitation）親和沉淀:是生物親和相互作用與沉淀分離相結合的生物大分子的分離純化技術。

一次作用親和沉淀二次作用親和沉淀79四、親和沉淀

（Affinityprecipitat80一次作用親和沉淀水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個或兩個以上的親和配基雙配基（bis-ligand）；多配基（polyligand）。雙配基或多配基與含有兩個以上親和結合部位的多價蛋白質產(chǎn)生親和交聯(lián)，增大為較大的交聯(lián)網(wǎng)絡而沉淀。80一次作用親和沉淀水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個或兩個以上的81二次作用親和沉淀

制備親和沉淀介質:利用在物理場改變時溶解度下降、發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基。親和介質結合目標分子后，通過改變物理場使介質與目標分子共同沉淀的方法稱為二次作用親和沉淀。

離心或過濾回收沉淀。沉淀清洗后加入洗脫劑純化目標產(chǎn)物。81二次作用親和沉淀制備親和沉淀介質:利用在物理場改變時溶82可逆沉淀性聚合物

—聚丙烯酰胺82可逆沉淀性聚合物—聚丙烯酰胺83可逆沉淀性聚合物——

聚合脂質體（polymerizedliposome,PLS）

83可逆沉淀性聚合物——

聚合脂質體（polymerized84親和沉淀純化技術優(yōu)點

（1）溶液中進行，無擴散傳質阻力，親和結合速度快；（2）親和配基裸露在溶液中，配基利用率高；（3）離心或過濾技術回收沉淀，規(guī)模放大；（4）可用于高粘度或含微粒料液中目標產(chǎn)物純化。84親和沉淀純化技術優(yōu)點（1）溶液中進行，無擴散傳質阻力，85五、親和電泳（AffinityElectrophoresis）

親和電泳是將親和層析與電泳技術結合起來，將親和層析的吸附劑包埋到瓊脂凝膠板上制成AEP載體。

（1）、外源凝集素親和電泳（LectinAffinityElectrophoresis，LAE）

（2）、毛細管親和電泳（CapillaryAffinityElectrophoresis，CAE）85五、親和電泳（AffinityElectrophore86外源凝集素親和電泳利用外源凝集素對目標蛋白質的特異性作用進行親和電泳。適用于分析血清糖蛋白。86外源凝集素親和電泳利用外源凝集素對目標蛋白質的特異性作用87毛細管親和電泳

將親和技術應用于毛細管電泳——毛細管親和電泳。

原理：根據(jù)底物、配基、與底物-配基復合物的遷移時間不同，采用毛細管區(qū)帶電泳測定Kd或Kb。用于手性藥物及DNA片段的特異性分離。

87毛細管親和電泳將親和技術應用于毛細管電泳——毛細管親和888889思考題1、親和層析洗脫方法有

，

，

。2、親和力大小除由親和對本身的

決定外，還受許多因素的影響，其中包括親和吸附劑

、

、

、

、

等。3、親和層析中常用作分離酶的配基有

，

，

和

。4、親和層析中非專一性吸附有

、

、

。5、親和過濾指的是將

和

結合運用，它包括

和

兩大方法。6、制備親和柱時，應首先選用的配基是

（

）A.大分子的

B.小分子的

C.中等大小的

D.不確定7、親和層析的洗脫過程中，在流動相中加入配基的洗脫方法稱作（）

A.陰性洗脫B.劇烈洗脫C.競爭洗脫D.非競爭洗脫

89思考題1、親和層析洗脫方法有，90技術要點（1）找與底物專一可逆結合的配基；（2）將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質；（3）配基與底物吸附；（4）洗脫目標物。

1技術要點（1）找與底物專一可逆結合的配基；91親和純化技術親和層析(Affinitychromatography)親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃取）親和反膠團萃取（反膠團萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）2親和純化技術親和層析(Affinitychromatog92第一節(jié)親和層析

(AffinityChromatography)利用生物大分子物質具有與某些相應的分子專一性可逆結合的特性而建立的層析技術。

適用于從成份復雜且雜質含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。3第一節(jié)親和層析

(AffinityChromatogr93特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質；特異性強、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。4特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質；94親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱為配基（Ligand）。與配基結合的層析介質稱為載體（Matrix）。5親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱95一、親和層析的原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結合成具有特異親和性的分離介質。（2）吸附樣品：親和層析介質選擇性吸附生物活性物質.

（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質解吸。

動畫6一、親和層析的原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結合成96二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：（1）充分功能化，與配基進行共價連接。（2）有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性。（3）具有高度的水不溶性和親水性。（4）具有多孔的立體網(wǎng)狀結構。（5）應為大小均勻的剛性小球。7二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：97（二）、常用載體

纖維素

(cellulose)瓊脂糖凝膠

葡聚糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

多孔玻璃珠（Bio-Glass）

其它載體——殼聚糖

(Chitosan)8（二）、常用載體纖維素(cellulose)981、纖維素纖維素結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強，空間位阻。主要用于分離與核酸有關的物質。

91、纖維素纖維素結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。992、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結構疏松孔徑大，流速快。SepharoseCL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH3~14中應用。

102、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sep100

3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應用受到限制。

4、聚丙烯酰胺凝膠：Bio-gelP

有供化學反應的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。

pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。113、葡聚糖凝膠：101

5、多孔玻璃珠：化學與物理穩(wěn)定性較好，機械強度高。缺點：親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特異性吸附，化學活性基團少。6、其它載體——殼聚糖125、多孔玻璃珠：102殼聚糖(甲殼素和殼聚糖)13殼聚糖(甲殼素和殼聚糖)103三、親和配基

配基的選擇配基的濃度配基偶聯(lián)的位置配基分子的大小配基的類型14三、親和配基配基的選擇104（一）、配基的選擇

親和層析配基的選用主要取決于分離對象。

1、配基與配體有足夠大的親和力（親和勢），KL

在10-4～10-8之間。

2、配基與配體的結合應是專一的。3、配基應具有化學活性。15（一）、配基的選擇親和層析配基的選用主要取決于分離對象105親和勢—KL（EL復合物的解離常數(shù)）

分配比:結合酶/游離酶阻留值:Ve/V016親和勢—KL（EL復合物的解離常數(shù)）分配比:106（二）、配基的濃度

對親和勢比較低的系統(tǒng)（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。增加親和柱的長度來提高吸附率。配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難。理想的配基濃度為1-10μmol/L。17（二）、配基的濃度對親和勢比較低的系統(tǒng)（KL≥10-4107（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結合的部位與載體進行偶聯(lián)。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。18（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結合的部108第一節(jié)親和層析一、親和層析的原理二、親和層析載體三、親和配基配基的選擇配基的濃度配基偶聯(lián)的位置配基分子的大小配基的類型19第一節(jié)親和層析一、親和層析的原理109（四）、配基分子的大小

選用大分子配基。小分子物質作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。20（四）、配基分子的大小選用大分子配基。110（五）、配基的類型

較小的有機分子或天然生物活性物質。根據(jù)配基應用和性質:特殊配基和通用配基。特殊配基（specialligand）

21（五）、配基的類型較小的有機分子或天然生物活性物質。111通用配基（generalligand）用于一類物質的分離提純。用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基；用ATP作激酶類親和層析的通用配基；用外源性凝集素作糖蛋白類親和層析時的通用配基等。

22通用配基（generalligand）用于一類物質的分112四、

載體的活化與偶聯(lián)

糖類載體的活化與偶聯(lián)

聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)用于固定化配基的凝膠衍生物

23四、載體的活化與偶聯(lián)糖類載體的活化與偶聯(lián)113（一）、糖類載體活化與偶聯(lián)

溴化氰活化法高碘酸氧化法環(huán)氧化法甲苯磺酰氯法雙功能試劑法24（一）、糖類載體活化與偶聯(lián)溴化氰活化法114溴化氰活化法

載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下用溴化氰處理，可引入活潑的“亞氨基碳酸”中間體。在弱堿的條件下直接與含有游離脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶聯(lián)。25溴化氰活化法載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下用溴化115方法26方法116高碘酸氧化法

多糖載體與0.1mol/L的高碘酸鈉氧化反應24小時會產(chǎn)生醛；在溫和條件下，醛與賴氨酸上的ε-NH2生成西夫堿，接著用硼氫化鈉還原，生成穩(wěn)定的烷基胺。27高碘酸氧化法多糖載體與0.1mol/L的高碘酸鈉氧化反117

環(huán)氧化法堿性條件下，多糖載體與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；環(huán)氧化合物又與氨基酸或蛋白質上氨基偶聯(lián)。28環(huán)氧化法堿性條件下，多糖載體與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化118

甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法在無水丙酮中進行。優(yōu)點：①活化反應迅速；②偶聯(lián)條件溫和；③偶聯(lián)效率高。

29

甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法119雙功能試劑法雙功能試劑是同一分子中具有兩個反應活性基團的化學試劑，常作為連接兩個分子的“橋梁”。

二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐優(yōu)點：反應速度快、條件溫和，能與氨基、糖類、酚、醇類等偶聯(lián)。

30雙功能試劑法雙功能試劑是同一分子中具有兩個反應活性基團的120（二）、聚丙烯酰胺凝膠及

其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)疊氮化法重氮化法(含氨基載體)碳二亞胺縮合法（含羧基載體）31（二）、聚丙烯酰胺凝膠及

其它凝膠衍生物活121聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法有大量可修飾的酰胺基。酰胺基能被含氮化合物置換制備多種衍生物。

32聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法有大量可修飾的酰胺基。122疊氮化法聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亞硝酸，反應液攪90s；加入脂肪胺類配基，制得親和吸附劑。

33疊氮化法聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亞硝酸，123重氮化法ω-氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應，制得對硝基苯甲酰胺烷基瓊脂糖衍生物。用連二亞硫酸鈉還原，亞硝酸鈉處理，得重氮鹽衍生物。配基與重氮鹽衍生物偶聯(lián)，制得親和層析柱。34重氮化法ω-氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應，制124碳二亞胺縮合法碳二亞胺為羧基活化劑。反應中的脲衍生物可用有機溶劑洗滌除去。35碳二亞胺縮合法碳二亞胺為羧基活化劑。125（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物

1、CNBr活化的Sepharose4BSepharose4B經(jīng)CNBr活化，可偶聯(lián)蛋白和核酸類配基。2、AH-Sepharose4B和CH-Sepharose4B含有6個碳原子的”手臂”的瓊脂糖衍生物

AH-Sepharose4B用于含有羧基的一類配基。CH-Sepharose4B能與含有一級氨基的配基偶聯(lián)。36（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物1、CNBr活化的S126

371273、環(huán)氧活化型Sepharose6B由親水“手臂”與Sepharose6B載體通過醚鏈形成的衍生物。用于小分子配基的固定化。用于偶聯(lián)脂多糖、蛋白等大分子配基。383、環(huán)氧活化型Sepharose6B由親水“手臂”與S1284、活化型親和膠10和15由N-羥琥珀酰亞胺與瓊脂糖衍生物形成的活化酯。Affi-Gel10的“手臂”長為10個碳原子，產(chǎn)生一些負電荷，有利于堿性或中性蛋白偶聯(lián)；Affi-Gel15為15個碳原子的“手臂”，產(chǎn)生一些正電荷，故有利于酸性蛋白的偶聯(lián)。

394、活化型親和膠10和15由N-羥琥珀酰亞胺與瓊脂糖衍生1295、CM-生物膠A、親和膠202和親和膠102CMBio-GelA，無“手臂”的羧基衍生物；Affi-Gel102具有6個原子“手臂”，未端為氨基。Affi-Gel202具有10個原子的“手臂”，未端具有羧基；405、CM-生物膠A、親和膠202和親和膠102CMBi130五、

影響吸附親和力的幾個因素

KL配基濃度對親和力的影響空間障礙的影響配基與載體的結合位點的影響載體孔徑的影響微環(huán)境的影響41五、影響吸附親和力的幾個因素KL131（一）、配基濃度對親和力的影響為將親和配體與其它物質分開，需要阻留值≥10。配基濃度與親和對解離常數(shù)相關。對于低親和力系統(tǒng)，配基濃度。

42（一）、配基濃度對親和力的影響132（二）、空間障礙的影響空間位阻。對于分子大的配體以及小分子配基更明顯?！笆直邸保黾优c載體相連配基的活動度，減輕載體的立體障礙。常用的“手臂”多為烴鏈。

43（二）、空間障礙的影響空間位阻。133（三）、配基與載體的結合位點的影響多肽或蛋白質等大分子配基須控制偶聯(lián)反應條件，使它以最少的功能基團與載體連接。保持蛋白質原有的高級結構，使親和吸附劑具有較大的親和力。

44（三）、配基與載體的結合位點的影響多肽或蛋白質等大分子配134（四）、載體孔徑的影響載體孔隙是配體向配基接近的通道?？讖酱笮ξ絼┯H和能力有影響。（五）、微環(huán)境的影響載體及“手臂”的電性、極性對親和力的影響。避免引入離子鍵的基團。疏水作用的存在，會引起非特異性吸附作用。45（四）、載體孔徑的影響135六、

配基與間隔臂的連接

（一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接46六、配基與間隔臂的連接（一）、含氮配基的連接136七、

親和層析的吸附和洗脫

影響吸附的條件親和層析的洗脫親和吸附劑的再生47七、親和層析的吸附和洗脫影響吸附的條件137（一）、影響吸附的條件

親和吸附劑及配體的性質緩沖液的種類、離子強度、pH、溫度和層析流速有關。溫度升高會使吸附作用減弱。流速每小時低于10ml/cm2。上樣體積為柱床體積的5%。48（一）、影響吸附的條件親和吸附劑及配體的性質138非專一性吸附

親和層析中的非專一性吸附。離子效應疏水基團復合親和力49非專一性吸附親和層析中的非專一性吸附。139離子效應

配基與載體-間隔臂的不完全結合，將無關離子基團引入吸附劑。具有離子基團的親和吸附劑會影響蛋白質的洗脫行為。50離子效應配基與載體-間隔臂的不完全結合，將無關離子基團140疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質結構中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團：（1）長的烴鏈結構的“手臂”：（2）疏水性配基：51疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質結構中的疏水區(qū)相互吸引，141復合親和力離子效應作用，又有疏水作用。配體與配基有較強生物特異性。用高濃度的鹽和有機溶劑，以提高選擇性。52復合親和力離子效應作用，又有疏水作用。142（二）、親和層析的洗脫洗脫：洗脫方法主要有三種：非專一性洗脫特殊洗脫專一性洗脫53（二）、親和層析的洗脫洗脫：143非專一性洗脫

改變洗脫劑的pH。離子強度的分步和梯度變化.親和勢很高，促溶離子，其洗脫能力的強弱順序Cl－<I－<CF3COO－<SCN－

<CCl3COO－。用蛋白質變性劑（如脲或鹽酸胍）。54非專一性洗脫改變洗脫劑的pH。144特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。55特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。145專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）（1）競爭性效應，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會使E洗脫下來（正洗脫）。（2）當ESI穩(wěn)定性與EI相同時，I的存在并不影響E對S的結合，非競爭性效應。（3）反競爭性效應，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結合更緊密（負洗脫）

。56專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）146反競爭性效應57反競爭性效應147親和層析中常用作分離酶的配基有：

酶抑制劑輔酶底物底物結構類似物

58親和層析中常用作分離酶的配基有：148配基的選擇和洗脫條件

59配基的選擇和洗脫條件149（三）、親和吸附劑的再生用緩沖液充分平衡后即可重復使用。親和力下降，非特異吸附增加，大多由變性蛋白沉積造成，用6mol/L脲洗柱。60（三）、親和吸附劑的再生用緩沖液充分平衡后即可重復使用。150八、其他親和層析

金屬離子親和層析有機染料親和層析擬生物親和層析（BiomimeticAFC）

61八、其他親和層析151

（一）、金屬螯合親和層析將環(huán)氧活化型Sepharose6B與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。金屬螯合劑:亞氨二醋酸、氨基水楊酸、8-羥基喹啉、羧甲基氨基酸等

.62

（一）、金屬螯合親和層析將環(huán)氧活化型Sepharose152蛋白質上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，利于蛋白質與固定化金屬離子結合。金屬離子如鋅和銅。63蛋白質上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和153吸附：pH在6~8。洗脫：降低pH值、增加離子強度、或在緩沖液中加5mmol/LEDTA等方法。特點：蛋白質吸附容量大；價格便宜；具有普遍適用性。64吸附：pH在6~8。154（二）、有機染料親和層析需NAD+為輔酶的酶，對染料具有一定親和力。染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱。染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。65（二）、有機染料親和層析需NAD+為輔酶的酶，對染料具有155親和層析一、原理二、親和層析載體三、親和配基

四、載體的活化與偶聯(lián)五、影響吸附親和力的因素六、配基與間隔臂的連接七、親和層析的吸附和洗脫八、其他親和層析66親和層析一、原理156

第二節(jié)其他親和純化技術一、親和過濾（膜分離）二、親和分配（雙水相萃?。┤?、親和反膠團萃?。ǚ茨z團萃取）四、親和沉淀（沉淀分級）五、親和電泳（電泳）67

第二節(jié)其他親和純化技術157一、親和過濾（AffinityFiltration）將親和層析和膜過濾技術結合運用，包括親和錯流過濾和親和膜分離。親和錯流過濾（affinityCrossFlowFiltration,ACFF）:親和層析與超濾技術結合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。68一、親和過濾（AffinityFiltration）158親和錯流過濾

（affinityCrossFlowFiltration）

基質及大分子親和配基基質是聚合物組成的內核，親和配基連接在內核表面。配基對提取的目標物進行專一可逆的吸附，形成復合體；用膜對混合液進行錯流過濾，復合體因分子巨大可被保留，雜質隨液體透過膜，目標物與其它成分分離。

69親和錯流過濾

（affinityCrossFlo159基質

聚丙烯酰胺

菌類的完整細胞

（酵母、芽胞桿菌、鏈球菌等細胞）

瓊脂糖、脂質體等

酵母細胞純化伴刀豆球蛋白A70基質聚丙烯酰胺酵母細胞純化伴刀豆球蛋白A160親和膜

（affinitymembrane）親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。

將一張微濾膜比喻為一個固定床，膜厚為床層高度。

71親和膜（affinitymembrane）親和膜利用161親和膜優(yōu)點

傳質阻力小，達到吸附平衡的時間短；配基利用率高，配基用量低；壓降小，流速快；設備體積小。72親和膜優(yōu)點傳質阻力小，達到吸附平衡的時間短；162二、親和萃取

（Affinityextraction）定義：利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行的雙水相萃取，在親和配基的親和結合作用下促進目標產(chǎn)物在PEG相（上相）的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。

PEG/Dextran,PEG/無機鹽73二、親和萃取

（Affinityextracti163mA目標分子的親和分配系數(shù)

T和B分別表示上相和下相；mA和mO為有、無配基時目標分子的分配系數(shù)；mL為配基的分配系數(shù)；CL為配基濃度；Kd為配基與目標分子反應的解離常數(shù)。

上相配基濃度CLT越高，mA越大

74mA目標分子的親和分配系數(shù)164親和萃取純化過