細胞工程nn課件

細胞工程

CELLENGINEERING——改造和培養(yǎng)細胞、組織、器官、個體的工程劉廣發(fā)1《細胞工程》主要內容（1）細胞工程的基礎知識與基本技術；植物組織培養(yǎng)；懸浮細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產；花藥及單倍體植株培養(yǎng)；原生質體制備與細胞融合；人工種子制備；植物脫病毒技術；2《細胞工程》主要內容（2）動物細胞與組織培養(yǎng)動物細胞融合細胞重構與動物克隆淋巴細胞雜交瘤與單克隆抗體染色體轉移與基因轉移人類干細胞研究原核細胞的原生質體融合真菌細胞的原生質體融合3參考文獻自編.細胞工程講義羅立新等.細胞工程.華南理工大學出版社，2003李志勇編著.細胞工程.科學出版社，20034探究式自主學習計劃自愿組成學習小組，3人左右，選出組長；每組選一個主題，時間約10min；各組需準備PowerPoint;各組最高可得8分；其他同學可提問、補充或更正；教師講評和討論；5探究式自主學習安排（2）順序課題學習小組8動物細胞與組織培養(yǎng)9動物細胞融合10細胞重構與動物克隆11染色體轉移與基因轉移12人工種子制備13原生質體制備與細胞融合（植物）14原核細胞的原生質體融合15真菌細胞的原生質體融合7細胞工程的三個層次細胞水平：細胞培養(yǎng),細胞融合，整株培養(yǎng)；細胞器水平：細胞核，染色體，各細胞器；基因水平：基因轉化；8第一章細胞工程發(fā)展簡史

一.植物細胞工程1902德國植物學家Harberlandt預言植物細胞具全能性；1904德國胚胎學家Hanning成功培養(yǎng)蘿卜胚并長成植株；1922Robbins以豌豆等的莖尖在培養(yǎng)基上形成缺綠的葉和根；1930-34李繼侗發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳提取物能促進銀杏胚正常生長；1934美國White成功培養(yǎng)番茄離體根，發(fā)現(xiàn)愈靠根尖病毒愈少；10植物細胞工程1935-36中國羅宗洛父子發(fā)現(xiàn)嫩桑葉可促進玉米離體根生長；1937美國White發(fā)現(xiàn)VitB促進離體根生長，指出IAA能調控生長；1937美國Michel首創(chuàng)用0.5MNaNO3融合兩個植物細胞原生質體；1941Overbeek以椰子乳加入培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)曼佗羅幼胚；？Skoog和崔澄發(fā)現(xiàn)腺嘌呤等能誘導芽生成，指出腺嘌呤與生長素之比，比例高則生芽，比例低則生根；11植物細胞工程1956Miller發(fā)現(xiàn)激動素，證明其促芽能力是腺嘌呤的三萬倍；1958Steward進行胡蘿卜細胞懸浮培養(yǎng)，還長成胚狀體和植株；1953Muir成功對煙草細胞進行懸浮液體培養(yǎng)；1960英國Cocking用纖維素酶制備番茄根細胞原生質體；1964印度Maheshwari以花藥培養(yǎng)出單倍體組織；1968Reinhard用植物細胞懸浮培養(yǎng)生產出哈爾堿；12二.動物細胞工程1885Wilhelm取出雞胚髓板，在鹽水中存活數(shù)天；1903Jolly將蠑螈的白細胞在懸滴中保存1個月；1907美國Harrison培養(yǎng)的蛙神經存活數(shù)周，且長出軸突；1914Tomson創(chuàng)立能在培養(yǎng)基中維持器官小塊的方法；？Carrel發(fā)現(xiàn)雞胚浸出液明顯促進細胞生長，使雞胚心臟細胞傳代3400次，生存34年，可無限生長；14動物細胞工程1940Earle建立可無限傳代的小鼠結締組織L系；1951Gay建立第一個永生人宮頸癌Hela細胞系；1958岡田善雄用滅活仙臺病毒誘發(fā)腹水瘤細胞融合；1960s童第周和牛滿江進行魚和蛙的核移植，獲核質雜種魚；15第二章細胞工程的基礎知識與基本技術基礎知識

1.原核細胞：DNA裸露，生長迅速，易于操作；但具細胞壁，表達真核基因受一定限制。

2.真核細胞：接近人類需要，但具細胞周期，要同步化培養(yǎng)；生長慢，植物細胞和真菌細胞具細胞壁。17二.基本操作無菌操作概念與技術無菌室布局、衛(wèi)生、消毒、超凈臺18基本操作2.細胞培養(yǎng)取樣滅菌培養(yǎng)傳代收獲除菌取樣3.細胞融合原生質體融合篩選4.轉基因細胞（個體）19第三章植物細胞工程植物組織培養(yǎng)；懸浮細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產；花藥及單倍體植株培養(yǎng)；原生質體制備與細胞融合；人工種子制備；植物脫病毒技術；主要內容：20第一節(jié)植物組織培養(yǎng)

在無菌和人工控制營養(yǎng)及環(huán)境條件下研究植物的細胞、組織和器官以及控制其生長、發(fā)育的技術。

全世界通過植物細胞培養(yǎng)再生成植株已超過600種，已使許多具有重要經濟價值的果樹、藥材、蔬菜和花卉等實現(xiàn)商品化生產。21植物組織培養(yǎng)過程離體的植物器官、組織、細胞脫分化愈傷組織再分化芽根植物體培養(yǎng)22配MS培養(yǎng)基1.基本組分：mg/L

蔗糖3%,KNO31900,NH4NO31650,CaCl2440,MgSO4370,KH2PO4170,2.微量無機物：Na2?EDTA37.3,FeSO427.8,MnSO422.3,ZnSO48.6,H3BO36.2,KI0.83,Na2MoO40.25,CoCl20.025,CuSO40.0253.微量有機物：mg/L

肌醇100，腺嘌呤5，甘氨酸2，煙酸0.5,吡咯醇0.5，硫胺素0.1，生物素0.01，

激動素(KT)0.04—10吲哚乙酸（IAA）1—304.Agar10g/L預備階段（1）246-芐基腺嘌呤（6-BA）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸餾水稍加熱使其溶解；萘乙酸（NAA）：先用少量95%乙醇和少量0.1mol/L的NaOH溶解；25預備階段（2）選擇合適的外植體外植體大小要適宜；外植體的部位影響其分化能力和器官分化的類型；外植體的年齡影響其分化率；同一植物不同部位的分化需不同的生長素/激動素比例；不同物種的相同部位外植體分化能力不一樣；27預備階段（3）除菌

自來水多次漂洗消毒劑處理無菌水反復沖洗外植體

無菌濾紙吸干切割

無菌外植體若干塊無菌外植體置培養(yǎng)基上28常用消毒劑的使用和效果

消毒劑使用濃度/%清除消毒時間/min滅菌效果次氯酸鈉2容易5~30很好次氯酸鈣9~10容易5~30很好漂白粉飽和溶液容易5~30很好升汞0.1~1較難2~10最好酒精70~75容易0.2~2好過氧化氫10~12最容易5~15好溴水1~2容易2~10很好硝酸銀1較難5~30好抗生素4~50mg/L中等30~60較好29植物不同器官的消毒和處理種子

純酒精浸10min，無菌水洗凈，次氯酸鈣（10％）浸20～30min，無菌水洗3～5次，無菌濾紙吸干；；果實

純酒精迅速漂洗，次氯酸鈉（2％）浸10min，無菌水反復沖洗，剝除種子和內部組織；莖切段

自來水洗凈，純酒精漂洗，次氯酸鈉（2％）浸15～20min，無菌水洗3次，無菌濾紙吸干；葉片

自來水洗凈，純酒精漂洗，升汞（0.1％）浸1min，或次氯酸鈉（2％）浸15～20min，無菌水反復沖洗，無菌濾紙吸干；

30誘導去分化形成愈傷組織添加較高濃度的生長素；固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)；光照培養(yǎng)；黑暗培養(yǎng)；31形成愈傷組織所需的激素只需生長素類激素，如菊芋的塊莖；只需細胞分裂素激素，如蕪菁根；需上述兩類激素，但有不同比例，多數(shù)植物；還需復雜的天然提取物（椰子乳）等；32生長素類激素吲哚乙酸（IAA）,常用1～10mg/L;吲哚丁酸（IBA）,常用1～5mg/L；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-5～10-7mol/L;萘乙酸（NAA），常用1.0mg/L；33細胞分裂素類激素激動素（KT）6-芐氨基嘌呤（6-BA）玉米素先加少量堿液預溶34繼代增殖階段移植擴增；分割繼代；35光照培養(yǎng)室36生根長芽階段生長素與細胞分裂素對于細胞生長與分化具有協(xié)同作用，它們的量以及比例的不同配合，對細胞分化起著重要的作用；外植體本身內源激素水平的差異，導致它們分化時對培養(yǎng)基中所添加的這兩種激素量及其比例反應不盡相同；37長芽生根階段38移栽成活階段保濕是關鍵；避免強光直射；溫度適宜；39植物組培的優(yōu)缺點優(yōu)點：ABCD缺點：ABC40手指玫瑰41第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產本方法的歷史、現(xiàn)狀1956年，Routier&Nickell首先提出把植物細胞當作工業(yè)合成天然產物的途徑；1968年，Reinhard,Corduan&Volks經培養(yǎng)生產出“哈爾堿”（harmine);1972年，F(xiàn)uruya&Ishii經培養(yǎng)生產出“維斯納精”（Visnagin);1981年，F(xiàn)ujita等經培養(yǎng)生產出“紫草素”；1991年，我國培養(yǎng)紅豆杉細胞生產“紫杉醇”，達到60mg/L；目前世界最大的細胞培養(yǎng)罐達20t；42紅豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌藥物43細胞培養(yǎng)和原植物的天然產物量的比較

產量

物種

天然產物細胞培養(yǎng)原植物橘葉雞眼藤

蒽醌900微克/克干重

110微克/克干重決明蒽醌鮮重的0.334%

種子干重的0.21%長春花

蛇根堿干重的1.3%

干重的0.26%三角葉薯蕷

薯蕷皂苷26mg/克干重

20mg/克干塊根人參

人參皂角苷鮮重的0.38%

鮮重的0.3~3.3%煙草

煙堿干重的3.4%

干重的2~5%煙草

泛醌0.5mg/克干重

16mg/克干葉大紅罌粟

蒂巴因130mg/克干重

140mg/克干葉44從植物培養(yǎng)細胞中獲得的各類物質氨基酸核酸蛋白質碳水化合物脂類維生素有機酸抗白血病藥抗腫瘤藥抗病毒藥抗微生物藥酶抑制劑色素香料甜味劑鴉片殺蟲劑激素強心苷核苷酸橡膠阿司匹林奎寧可卡因第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產45培養(yǎng)植物細胞制造疫苗2006年2月，美國Dow

AgroSciences公司完成了世界上第一個注冊的植物制造疫苗；將病原菌抗原決定基因轉入植物基因組中，利用植物細胞而不是整株植物在一個安全的室內環(huán)境中生產疫苗，以激活人體的免疫能力。在制造過程中完全不含有任何動物成份。

46第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產懸浮培養(yǎng)

1.成批培養(yǎng)（封閉式培養(yǎng)）優(yōu)點：易于操作；次生代謝物含量高；缺點：效率低；2.半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)47第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產固定化細胞培養(yǎng)

次生代謝物的積累和細胞分化具有正相關性；細胞固定化有利于組織化的形成；細胞固定化有利于在細胞團間和細胞團內形成化學物質和各種物理因素的梯度，這是高產次生代謝物的關鍵；細胞固定化有利于對外環(huán)境參數(shù)進行調控；細胞固定化有利于回收次生代謝物；48第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產平床培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點：制作簡單；能生產較多次生代謝物；缺點：占地面積大；分化區(qū)比例較??；02供應受限；49包埋法固定細胞

將細胞包埋在凝膠載體的微小空格內或包埋于半透性聚合物的超濾膜內，它又分為凝膠包埋法和微膠囊法。⑴凝膠包埋法固定化（gelimmobilization)

①海藻酸鹽（alginate)β-角叉膠（β-carrageenan)瓊脂糖（agarose)瓊脂（agar)聚丙烯酰胺（polyacrylamide)殼聚糖（chitosan)白明膠（gelatin)50微膠囊法

微膠囊法是利用天然的或合成的高分子材料作為微囊壁材，包裹成微小球囊，培養(yǎng)基成分和代謝產物等小分子物質可以通過，細胞不能通過，使囊內成為一個微小環(huán)境。51第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產立柱培養(yǎng)系統(tǒng)

1.細胞固定化瓊脂固定細胞52褐藻酸鈣固定細胞無菌大量培養(yǎng)植物細胞

等量混合→注入尼龍網→配制4%褐藻酸鈉，滅菌氯化鈣溶液（2%）浸浴褐藻酸鈣固定的細胞團

第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產53第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產立柱培養(yǎng)系統(tǒng)

優(yōu)點：占地面積小次生代謝物產量高缺點：制作較復雜O2供應受限54立柱培養(yǎng)系統(tǒng)操作要素：取靜止期細胞，并使細胞達到一定密度；控制營養(yǎng)液的成分（包括激素）、濃度及O2供應；某些種的細胞培養(yǎng)需光照；盡可能選擇次生代謝物能自然或誘導后從細胞內釋出的植物（品種）；第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產55提高次生代謝物產量的途徑生物種性：

1.選擇高產的品系或細胞系；目測法，化學分析法，外因選擇法；2.誘變篩選高產細胞系：化學法，物理法；3.通過細胞融合或基因工程創(chuàng)造高產細胞系；第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產56提高次生代謝物產量的途徑培養(yǎng)條件:1.培養(yǎng)基：

A碳源：常用蔗糖，但應因種摸索；

B氮源：常用NO3-和NH4+，（或單用或兼用）；

C生長調節(jié)劑：生長素及細胞分類素。兩者的比例對細胞生長、分化及次生代謝物生產具極大影響；

D供給目的產物的直接或近直接前體物質；

第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產57提高次生代謝物產量的途徑培養(yǎng)條件:2.物理因子：

A光質和光量（適量光照）；

B溫度：25~30℃；

C通氣：底部通氣好；

DpH值：5~6第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物生產58第三節(jié)植物原生質體制備與融合原生質體（protoplast):去除全部細胞壁的細胞；亞原生質體（subprotoplast):只含有部分原生質的原生質體（有核或無核）；微原生質體（miniprotoplast):經細胞松弛素B處理得到的僅含少量胞質及核或染色體的小原生質體；原生質球（球狀體，spheroplast):殘存少量細胞壁的原生質體；幾個名詞：59植物原生質體研究的意義有利于進行遠緣雜交；有利于引入生物大分子、細胞器等；有利于進行細胞操作（核、葉綠體等）；60植物原生質體的制備(1)機械法：高滲處理植物（外植體，愈傷組織，液培細胞）質壁分離機械切割原生質體（亞原生質體）缺點：難，少，分生組織不宜；61酶解法1.酶的購置與純化

市售的纖維素酶一般都是復合酶，含：纖維素酶C1；纖維素酶Cx；纖維二糖酶；果膠酶；

磷脂酶；

核酸酶；

過氧化物酶；酚類；此外，還有蝸牛酶；植物原生質體的制備(2)最好應純化62酶解法2.取材：干凈，高活性A幼嫩的根、莖、葉；B懸浮培養(yǎng)的細胞和體細胞胚；

無需滅菌，最好同步化；

C花粉母細胞和四分體；

分生能力強，應使用蝸牛酶；植物原生質體的制備(3)63外植體除菌：外植體肥皂水洗清水洗酒精（75%，10s）次氯酸鈉（3%，15min）無菌水洗3~4次無菌濾紙吸干

植物原生質體的制備(4)64外植體酶解

除菌后葉片撕去下表皮切塊放入反應液25～30℃不時輕搖反應液轉綠2～4h

植物原生質體的制備(5)65外植體酶解緩沖液：pH值5.5~5.8滲透壓穩(wěn)定劑：糖、甘露醇、山梨醇等膜保護劑：鈣鹽、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸鉀（0.3%）表面活性劑：Tween80適當時間適當溫度植物原生質體的制備(6)66原生質體分離

過濾法離心法（低速）漂浮法（不同比重）植物原生質體的制備(7)67原生質體洗滌

以新的滲透壓穩(wěn)定劑或培養(yǎng)液輕輕洗滌2~4次;植物原生質體的制備(8)68原生質體鑒定1.直接鏡檢：球形，低滲破裂，熒光增白劑(UV下細胞壁顯綠色熒光）2.活力測定：雙醋酸熒光素（FDA）染色法：FDA進入細胞，被脂酶分解產生有熒光的極性熒光素;FDA不能進入死細胞；臺盼藍染色：臺盼藍不能進入活細胞；胞質環(huán)流觀察；植物原生質體的制備(9)69植物原生質體的培養(yǎng)基無機成分:KNO3725;CaCl2·2H2O685;MgSO4560;NH4NO3288;K2HPO468;Na2·EDTA37.3;Fe2SO4·7H2O27.8;H3BO43.0;MnSO4·4H2O10.0;ZnSO4·7H2O2.0;KI0.75;Na2MoO4·2H2O0.25;CoCl2·6H2O0.025;CuSO4·5H2O0.025糖類：(mg/L)

葡萄糖68000；蔗糖250；果糖250；核糖250；木糖250；甘露糖250；甘露醇250；鼠李糖250；山梨醇250；纖維二糖250；維生素：

(mg/L)

維生素C2.0；維生素B11.0；維生素B61.0；氫化膽堿1.0；對氨基苯甲酸0.02；葉酸0.4；生物素0.01；維生素A0.01；維生素D30.01；維生素B120.01；生長調節(jié)物：

酪蛋白250；肌醇100；椰子汁20ml；NAA1.0；6BA0.5；2,4-D0.2；有機酸：

檸檬酸40；蘋果酸40；反丁烯二酸20；丙酮酸鈉20；V-KM培養(yǎng)基(mg/L)70植物原生質體再生培養(yǎng)方法（1）固體平皿培養(yǎng)法原生質體懸液2ml小培養(yǎng)皿MS培養(yǎng)基配制的1.2%agar2ml

（25~28℃，置大皿內（預加濕濾紙）臘帶封口培養(yǎng)100~300lux，12h?d-1)分化培養(yǎng)基

愈傷組織成苗搖勻冷卻71固體平皿培養(yǎng)法

優(yōu)點：便于定點觀察原生質體不易破裂

缺點：通氣較差原生質體與瓊脂混合不易掌握原生質體過于分散植物原生質體再生培養(yǎng)方法（1）72液體培養(yǎng)法原生質體置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不時輕搖，能較快生長。細胞團形成后應移到固體培養(yǎng)基中才能繼續(xù)生長或誘導分化成苗。缺點：原生質體易受損通氣較差操作較麻煩植物原生質體再生培養(yǎng)方法（2）73液體淺層培養(yǎng)法（液-固法）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（0.6%）小皿凝固放置無菌濾紙注入3mL原生質體懸浮液放大皿內（墊濕濾紙）封口保溫，光照

（或不光照）輕搖愈傷組織分化培養(yǎng)基成苗植物原生質體再生培養(yǎng)方法（3）74液體淺層培養(yǎng)法（液-固法）

優(yōu)點：通氣好營養(yǎng)均勻生長較快

缺點：需定期添加培養(yǎng)基不易更換培養(yǎng)基植物原生質體再生培養(yǎng)方法（3）75小塊液培法

原生質體懸浮液瓊脂糖（0.8%）

切小塊置液體培養(yǎng)基中80~100rpm，25~28℃愈傷組織移放分化培養(yǎng)基成苗植物原生質體再生培養(yǎng)方法（4）混勻倒平皿凝固

76小塊液培法

優(yōu)點：缺點：植物原生質體再生培養(yǎng)方法（4）77固體活性炭培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基+1%活性炭原生質體懸浮液

平皿培養(yǎng)成苗植物原生質體再生培養(yǎng)方法（5）混勻凝固優(yōu)點：缺點：78混合培養(yǎng)（液體或固體培養(yǎng)基）

將兩種原生質體混合培養(yǎng)

有何意義？植物原生質體再生培養(yǎng)方法（6）79植物原生質體融合回顧1909Kuster把洋蔥根放在濃硝酸鈣溶液中，見質壁分離的亞原生質體，復原時觀察到亞原生質體的融合；1931Plower用針插入原生質體，使質膜和液泡膜融合；1937Michels觀察到同種和不同種原生質體的融合；1960Cocking用真菌纖維素酶獲得大量番茄根的原生質體；1970Power用NaNO3使燕麥和玉米的原生質體融合；1971Takete首次將煙草原生質體再生成完整的植株；1972Carlson首次經原生質體融合獲得種間雜種煙草；1973Keller提出高pH高鈣法誘導原生質體融合；1974

Kao提出聚乙二醇法誘導原生質體融合；1977Kao把高pH高鈣法與聚乙二醇法相結合；1978Melchers獲得屬間雜種（番茄╳馬鈴薯）；1979Senda提出電激法融合原生質體；1987斯維格將電融合與微培養(yǎng)結合；80化學法誘導融合

（無菌操作）按一定比例混合雙親原生質體懸液；吸一份混合液于表面皿上，靜置10min；滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，輕輕搖勻；

PEG溶液組成：PEG50%（MW=1560~6000)glucose0.1mol/LCaCl210.5mmol/LKH2PO40.7mmol/L

pH5.5

植物原生質體融合（1）81植物原生質體融合（2）化學法誘導融合(續(xù)前）25℃保溫15~45min，不時輕搖；滴加1份高鈣高pH溶液稀釋，搖勻；

高鈣高pH溶液組成：

glycine50mmol/LCaCl2

50mmol/Lglucose300

mmol/LpH10.510~15min后，再滴加1份高鈣高pH溶液稀釋，搖勻；10~15min后，再加1~2mL原生質體培養(yǎng)液，搖勻；用20mL原生質體培養(yǎng)液洗5次，間隔5min；加0.5mL原生質體培養(yǎng)液，微滴培養(yǎng)；82物理法誘導融合微電極法兩個微電極尖端分別與兩個靠近的原生質體表面接觸，用5~12μA的電流刺激1~5毫秒，促成融合。平行電極法相距200μm的微電極插入原生質體溶液中，先通入交變電場，使其緊密接觸成串珠狀；再施以適當電脈沖，原生質體接觸區(qū)發(fā)生可逆擊穿而融合；植物原生質體融合（3）83不對等細胞融合（滅活一方原生質體）植物原生質體融合（4）84原生質體融合后的產物親和雜種細胞（難）部分親和的雜種細胞

含雙方胞質及一方核含雙方胞質及一方核和少量它方染色體

（細胞周期短或繼代次數(shù)少的一方，染色體易保留）3.異核質雜種（少）4.嵌合植株85融和體的鑒別細胞鑒別

細胞大小色素有無細胞核大小熒光鑒別植株鑒別

形態(tài)特征染色體顯帶同功酶法、過氧化物酶法分子雜交法RFLP法RAPD法86雜種細胞篩選顯微操作法要有：可識別標志顯微操作儀能培養(yǎng)單個原生質體的培養(yǎng)基遺傳互補法要有具突變標記的品種1.白化互補法2.生長互補法3.抗性互補法4.代謝互補法

87西紅柿與馬鈴薯雜交研究進展1971年，Power提出設想1978年，Melchers用原生質體融合法獲得9株雜種株1983年，Shepard亦融合成功亟待解決的問題：

1.哪些基因和條件決定果實與塊莖的形成2.光合作用產物的運輸方向與分配3.光合作用產物是否足以供應地上和地下部分的生長、發(fā)育需要1994年,Schoenmakers繼續(xù)本研究1995年，Wolters還在研究88第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用

一.單倍體植物的特點：株矮，葉、花、果小，生活力弱；高度不育；？89二.單倍體植物的利用：可加快培育新品種；有利于突變體的選擇與利用；？第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（2）90三.誘導產生單倍體植株的途徑：

(一）自然發(fā)生1.孤雌生殖2.孤雄生殖3.無融合生殖第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（3）91三.誘導產生單倍體植株的途徑：

(二）人工誘導：1.花藥培養(yǎng)：1.1選取成熟度適中的花蕾或幼穗；1.2花藥預處理；

1.3選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基與培養(yǎng)條件：

1.3.1只需簡單培養(yǎng)基；1.3.2培養(yǎng)基尚需添加激素；1.3.3培養(yǎng)基添加脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酰胺；第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（4）921.4培養(yǎng)條件：

降低氣壓；純N2密閉處理30~60min，或摻入O22.5~5.0%；0.5mol/L甘露醇處理2天；花藥平放；適當密植；第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（5）931.5花藥單倍體植株的形成途徑：

1.5.1生殖細胞退化，由營養(yǎng)細胞分裂產生；（常見）1.5.2小孢子細胞不分化成營養(yǎng)細胞和生殖細胞，直接分裂、分化長成；（常見）

1.5.3營養(yǎng)細胞和生殖細胞都參與愈傷組織和胚的形成；1.5.4僅由生殖細胞分裂形成；第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（6）942.離體花粉培養(yǎng)擠壓法分離花粉；自然散開法分離花粉；3.未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)4.雜交法獲單倍體植株第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（7）955.單倍體植物的加倍用秋水仙素（0.2~0.4%）處理24~48h；

加倍方式？第四節(jié)單倍體植物的誘發(fā)與利用（8）96Section5.ResearchesonArtificialSeeds

人工種子的研制（1）人工種子：含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素以及其它成分的人工膠囊；人工種子的構成：胚狀體：由組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)產生；人工胚乳：營養(yǎng)物質+激素+農藥+抗生素

+除草劑等；人工種皮：抗壓，保水，透氣；97Charactersofartificialseeds：不受環(huán)境因素制約,一年四季進行工廠化生產；有利于保存該種系的優(yōu)良性狀；成本低，適合于機械化播種；可添加營養(yǎng)物、激素、農藥、抗生素、除草劑等，以利胚狀體的健康生長。

Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（2）98Thesynchronousgrowthofembryoid

胚狀體的同步化生長：低溫法抑制劑法分離法：分離胚性細胞團；通氣法：通入N2或乙烯；滲透壓法？Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（3）99Preparationforartificialendosperm人工胚乳的制備：

MS培養(yǎng)基+淀粉水解物+激素+抗生素+農藥+除草劑等；Anyoneelse？Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（4）100Embedmentofartificialseeds人工種子的包埋（滴注法）胚狀體褐藻酸鈉（終濃4%）

混勻合成胚乳

Section5.ResearchesonArtificialSeeds（5）還有其他方法？10~15minCaCl2（2.0～2.5%）圓形膠囊無菌水漂洗撈起Elvax4260處理干燥圓形人工種子101人工種子的直徑由

決定；人工種子內含胚狀體數(shù)目取決于

；人工種皮的厚度因

而定；

Section5.ResearchesonArtificialSeeds（6）102人工種子的干燥：

自然干燥人工干燥：22±2℃,相對濕度70±5%4~6d;胚狀體由玻璃狀轉為不透明表示發(fā)育成熟。Section5.ResearchesonArtificialSeeds（7）干燥的目的？103病毒對植物的危害植物哪些部位可能沒病毒或較少病毒？

植物哪些器官或部位無維管束（或維管束不發(fā)達）？切割外植體時是大些還是小些比較可能獲得無毒組織塊？組織塊大些還是小些比較容易獲得愈傷組織？第六節(jié)植物脫病毒技術（1）104脫除不同病毒時所取的莖尖大小一樣嗎？莖尖很小，實驗時應注意哪些問題？為什么有人喜歡用花瓣來脫病毒？哪些外因能被用于脫除病毒？通過培養(yǎng)愈傷組織能脫毒嗎？Why？哪些途徑可使脫毒植株不再染毒？第六節(jié)植物脫病毒技術（2）105第六節(jié)植物脫病毒技術（3）莖尖脫毒

1.莖尖培養(yǎng)：莖尖越小越沒病毒，但越小越難成活,一般要超過2萬個細胞，或至少3~10mg莖尖。2.花瓣培養(yǎng)3.花藥培養(yǎng)

106植物脫毒檢測（4）電鏡法免疫血清法

離心去渣植物組織勻漿上清液純化病毒

待檢植物勻漿上清液動物免疫抗血清（抗體）免疫檢測107植物脫病毒進展（5）脫毒馬鈴薯（青海）染有病毒的普通馬鈴薯畝產約1噸，脫病毒的馬鈴薯畝產達4噸；全國年種馬鈴薯3400萬公頃；脫毒草莓

紅寶石色，酸甜適口，果汁豐潤，果香四溢；脫毒唐菖蒲長勢旺盛，花色艷麗，品質提高1~2個等級；脫毒水仙108Chapter3.AnimalCellEngineering

第三章動物細胞工程Themaincontent：動物細胞與組織培養(yǎng);動物細胞融合;動物細胞核移植與胚胎克隆;淋巴細胞雜交瘤與單克隆抗體;染色體轉移與基因轉移;109Section1.CultivationofAnimalCellsandTissues

第一節(jié)動物細胞與組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)：細胞在體外條件下的保存和生長，在培養(yǎng)過程中不形成組織；組織培養(yǎng)：組織在體外條件下的保存和生長，繼續(xù)保持組織的結構和功能；器官培養(yǎng)：器官的胚芽、整個器官或器官的一部分在體外條件下的保存和生長，可有器官的分化，并保持器官的立體結構和功能；110細胞系

（Cellline)原代培養(yǎng)物經首次傳代成功后的細胞培養(yǎng)物，包括：有限細胞系和連續(xù)細胞系；

細胞株

（Cellstrain)通過選擇或克隆從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特定性質或標志的培養(yǎng)物；111一.細胞培養(yǎng)Section1.Cultivationofanimalcellsandtissues第一節(jié)動物細胞組織培養(yǎng)制備動物細胞：

培養(yǎng)液漂洗切割解離液無菌取出目的組織無菌組織小組織塊

細胞移放培養(yǎng)瓶抗生素漂洗離心洗滌112動物細胞培養(yǎng)113Quantitativecultivationofmammalcells二.大量培養(yǎng)哺乳動物細胞微導管法以醋酸纖維素或硝酸纖維素構成空心纖維管，搭成多層培養(yǎng)床。管內通空氣，管外為培養(yǎng)液；微載體法葡萄糖等聚合物形成直徑50~500μm的微球懸浮培養(yǎng)液中細胞貼附生長微膠囊法

細胞與褐藻酸鈉混合液滴入CaCl2中褐藻酸鈣膠囊懸浮培養(yǎng)114動物細胞培養(yǎng)器115Tissuescultivation三.組織培養(yǎng)

動物表面消毒獲組織小組織塊

雞胚心肌組織如何培養(yǎng)？無菌刀切加培養(yǎng)液

吸放培養(yǎng)瓶

靜置培養(yǎng)（37℃）

組織塊長大傳代眾多組織塊培養(yǎng)液、抗生素漂洗解剖116Generationofthecultivatedcell四.培養(yǎng)細胞的傳代

胰酶·EDTA離心培養(yǎng)細胞貼壁細胞游離

棄上清加新培養(yǎng)液

分瓶

細胞沉淀懸浮細胞培養(yǎng)117Non-serumcultivation

五.無血清培養(yǎng)血清培養(yǎng)的缺點：成分不確定，批次有差異，容易受污染，價格較昂貴；無血清培養(yǎng)基的組成：基礎培養(yǎng)基：常用DME與F12培養(yǎng)基等量混合；基質：纖粘素，血清鋪展因子，胎球蛋白，多聚賴氨酸，膠原；生長因子、維生素和激素等約30余種微量有機和無機物；118六.無血清培養(yǎng)基常用生長因子與激素胰高血糖素神經生長因子胰島素甲狀腺釋放激素前列腺素E2a表皮生長因子成纖維細胞生長因子前列腺素E1生長激素黃體化激素釋放激素黃體化激素甲狀旁腺激素轉鐵蛋白母羊因子氫化考的松SometomedinC無脂肪酸牛血清白蛋白雌二醇孕酮促卵泡刺激因子睪酮三碘甲狀腺氨酸亞油酸維生素A醇-生育酚維生素C腐胺CdSO4H2SeO3119Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(1)微生物污染：細菌污染；真菌污染；支原體污染；病毒污染其它細胞污染；120Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(2)污染來源：不潔動物標本；空氣：操作室與超凈臺的過濾設備老化；器械滅菌不徹底；人員操作；血清；121Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(3)污染物鑒別：肉眼觀察；光學顯微鏡觀察；電子顯微鏡觀察；特殊培養(yǎng)觀察：支原體122Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染污染源治理

細菌青霉素（200u·mL-1),鏈霉素（200μg·mL-1)真菌制霉菌素（100u·mL-1)

支原體卡那霉素（100μg·mL-1，不能根除)

病毒？

其它細胞1.同一工作面不能有其它細胞系存在；2.兩種細胞系不能共用培養(yǎng)器具；123Long-termconservationofcellculture八.細胞培養(yǎng)物的長期保存?zhèn)鞔ǎ篊arrel使雞胚心細胞傳3400次，34年;液氮法：

培養(yǎng)細胞甘油/二甲亞砜（5~10%）混勻安瓿封裝細胞/安瓿降溫至-30℃（1~3℃/min）降溫至-150℃（15~30℃/min）置液氮（-196℃）中低溫保存細胞124AnabiosisofCell

細胞復蘇

取出安瓿，投入37℃水浴，輕搖，重新形成細胞懸液

（注意防護）125Section2FusionofAnimalCells第二節(jié)動物細胞融合1958年，日本岡田善雄意外發(fā)現(xiàn)經UV滅活的仙臺病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細胞相互融合；1960年，法國Barski發(fā)現(xiàn)兩種不同類型細胞混合培養(yǎng)會自發(fā)形成融合細胞；1965年，岡田善雄等采用滅活的仙臺病毒融合產生第一個動物種間異核體；1966年，Yerganian用相同的方法獲得能增殖的雜種細胞；126AnimalCellFusionInducedbyVirus病毒誘導融合雙親本細胞

滅活仙臺病毒（皰疹病毒，副黏液病毒）細胞沉淀細胞凝集

各種融合子

混勻，冰浴20min，稍搖37℃30min洗滌選擇培養(yǎng)基所需的融合子分別制懸液混合離心127CellFusionInducedbyChemicals化學誘導融合1974年，高國南發(fā)現(xiàn)PEG能誘導植物細胞原生質體融合；1975年，Pontecorvo用PEG法融合動物細胞成功；懸浮法

PEG400040~50%，處理1~2min;

離心法

PEG100030~40%，離心5~8min;

(可加5~15%二甲亞砜）128電激誘導融合

與植物原生質體相同129ScreeningHybridCells

雜種細胞篩選抗藥篩選營養(yǎng)缺陷篩選130ApplicationofCellFusion

細胞融合的應用基因定位;體細胞雜種致瘤性分析;遺傳缺陷的基因互補研究;分化功能表達調控;131Section3Monoclonalantibodyproducedbylymphocytehybridoma

第三節(jié)淋巴細胞雜交瘤產生單克隆抗體

抗原

記憶細胞B淋巴細胞（脾）漿細胞特異抗體

融和小鼠骨髓瘤細胞雜交瘤細胞2002年12月神舟4號飛船搭載B淋巴細胞和骨髓瘤細胞升空進行細胞融合實驗特異抗體產生產生篩選132淋巴細胞雜交瘤產生單克隆抗體技術示意圖133Screenofhybridoma

雜交瘤細胞的篩選(1)HGPRT基因缺陷的腫瘤細胞不能在含HAT的選擇培養(yǎng)基上生長；B淋巴細胞具有HGPRT基因但不能在體外生長。利用這兩種細胞各自的特點，篩選能在體外含HAT的培養(yǎng)基中生長的融合子。HGPRT:次黃嘌呤核糖磷酸轉移酶HAT：次黃嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶134Screenofhybridoma

雜交瘤細胞的篩選(2)如何獲得融和細胞？如何得到單個融和細胞？鑒別是否分泌所需抗體；融和細胞的遺傳穩(wěn)定性；135Section4CellReconstruction&AnimalClone

第四節(jié)細胞重構與動物克隆

將細胞的各部件進行重新組合裝配，主要有核移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等技術。136TechniqueforAnimalClone動物克隆技術一.細胞核移植細胞核的制備：顯微操作法細胞松弛素B處理法

細胞培養(yǎng)獲得核質體和胞質體

離心細胞松弛素B處理如何分離？1372.童第周、牛滿江等的魚類移核研究鯉魚囊胚期胚胎的細胞核鯽魚去核受精卵雜合細胞

成魚（口須和咽區(qū)象鯉魚，脊椎骨數(shù)象鯽魚，側線鱗片數(shù)為中間類型，血清與血紅蛋白電泳證明確為雜種魚。）部分細胞分裂

發(fā)育核移植138金魚與鰟鲏魚(亞種間）

獲中間性狀雜種魚草魚與團頭魴(亞種間）

子代像草魚，雄性不育139牛滿江教授在海南大學作學術演講

2005年10月31日，美籍華人牛滿江教授來海南大學為該校師生們作了精彩的學術演講。

當天還是牛滿江教授93歲大壽。牛滿江教授祖籍河北博野，1936年畢業(yè)于北京大學生物系。1953年起，發(fā)表有關核酸（RNA）誘導功能論文，引起生物學界的重視，成功地創(chuàng)立了“外基因學說”。140科學家發(fā)現(xiàn)細胞質影響克隆魚發(fā)育新證據(jù)

中科院水生所朱作言院士發(fā)表在2005年3月美國《繁殖生物學》上的文章“細胞質對來源于轉基因鯉魚的細胞核與金魚去核卵配合的屬間克隆魚發(fā)育的影響”報道：以轉生長激素基因鯉魚的胚胎細胞核為供體，以金魚去核未受精卵為受體，進行屬間克隆，在總共501枚操作卵中，得到7尾正常發(fā)育為成體魚的屬間克隆魚?？寺◆~的外形特征酷似細胞核供體鯉魚而不同于受體金魚，PCR檢測和總DNA的RAPD比較分析均證實克隆魚的核基因組DNA來源于供體鯉魚；在血液循環(huán)期以前的克隆胚胎中共存著來源于供體和受體兩種類型的線粒體DNA，在其后續(xù)發(fā)育階段的克隆胚胎直至克隆魚個體中，僅存在受體細胞質的線粒體DNA；在7尾克隆魚中，6尾個體的脊椎骨數(shù)量是26-28個，1尾個體的脊椎骨數(shù)量是31個，而通常鯉的脊椎骨數(shù)量是33～36個，金魚的脊椎骨數(shù)量是26～28個。

141Cloneofmammalian

3.哺乳動物克隆1952年，Briggs取出蛙中胚層細胞的細胞核植入去核受精卵中，未發(fā)育；但改用囊胚期細胞核獲得部分成功；1964年，Gurdon將非洲爪蟾小腸上皮細胞的細胞核取出，重復上述實驗，部分發(fā)育成蝌蚪；1984年，維拉特森以未成熟胚胎細胞克隆出一只活產羊；1421994年，菲爾斯特用120個細胞的胚胎克隆出牛；1996年，維爾穆特用羊胚細胞克隆了羊；1997年，維爾穆特用羊乳腺細胞克隆了“多莉”羊；

143Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammalian

I.Wilmutetal.

Nature,1997,27,Feb.385(6619):810-813CelltypeNo.offusedcoupletsNo.ofrecoveredfromoviductNo.ofmorulaorblastocyststransferredNo.ofpregnancies/No.ofrecipientsNo.oflivelambMammaryepithelium277/434(63.8%)247(89.2%)29(11.7%)1/13(7.7%)1(3.4%)144Birthof“Dolly”1997年，維爾穆特用羊乳腺細胞克隆了多莉羊；

取434個綿羊乳腺細胞的細胞核與同等數(shù)量的去核卵電激融合277個融合細胞（63.8%）移入母羊輸卵管發(fā)育，成功247個（89.2%）發(fā)育到桑葚胚29個（11.7%）分別植入13只母羊子宮僅生一只“多莉”（0.23%）145“多莉（Dolly）”的身世1.從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細胞逐漸停止了分裂，此細胞稱之為供體細胞；2.

從一頭蘇格蘭黑面母綿羊的卵巢中取出未受精的卵細胞，并立即將其細胞核除去，留下一個無核的卵細胞，此細胞稱之為受體細胞；3.

利用電脈沖的方法，使供體細胞和受體細胞發(fā)生融合，最后形成了融合細胞，由于電脈沖還可以產生類似于自然受精過程中的一系列反應，使融合細胞也能象受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成胚胎細胞；進行早期胚胎發(fā)育；

4.將早期胚胎轉移到蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內，胚胎細胞進一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。1461471997年2月27日，《Nature》封面，“多莉”(Dolly)克隆羊

148Basicpathwayforcloningmammalian

克隆哺乳動物基本途徑取出體細胞核體外發(fā)育未受精卵去核易核卵早期胚胎

化學或電激誘導融合

產下幼畜假孕狀態(tài)植入代孕母畜子宮中

1493.哺乳動物克隆1998年后，日、美、新西蘭和中國等用體細胞核克隆出鼠、牛、豬、猴、羊等哺乳動物。2003年5月4日，美國克隆出一只騾。2003年8月6日意大利科學家宣布以自體克隆的方式克隆出一只小母馬；小母馬的“媽媽”也是其“姐姐”，也是“自己”。2003年9月，巴西科學家用意外死亡奶牛的卵泡中的顆粒細胞克隆出正常奶牛；2003年10月我國山東萊陽農學院克隆?！半p雙”經人工授精，產下“健健”，證明克隆牛具正常生殖能力；

150自體克隆的小母馬Prometea151

美國馬薩諸塞州的生物技術公司AdvancedCellTechnology2001.11.25成功克隆出人類胚胎，在克隆人的技術上邁出了重要一步，不過該公司表示其目的不是為了克隆人，而是為了獲得能夠用于治療帕金森綜合癥和青少年糖尿病等各種疾病的干細胞。1522002年內蒙古大學郭繼彤等用成年耳細胞克隆山羊153我國首例異種克隆北山羊誕生2004年1月21日在新疆烏魯木齊縣六十戶鄉(xiāng)降生中國首例異種克隆動物———克隆北山羊。將北山羊的體細胞與山羊的卵母細胞結合組成新的胚胎，待胚胎發(fā)育到一定階段移植到發(fā)情的母山羊體內?？寺”鄙窖?，雌性，出生重為2.32公斤，體長42厘米，體高35厘米。在異種克隆研究領域，目前國際上僅有印度野牛和歐洲盤羊取得成功。154

2004年2月15日，美國愛達荷大學的研究人員在西雅圖的美國科學年會上展示三頭克隆騾子?？茖W家們從騾子胚胎細胞核內提取細胞核，然后用移植手段將其與去核的馬卵細胞結合形成卵母細胞?？茖W家們共進行了305次嘗試，結果只有3個克隆騾子胚胎存活。

155Heterogeneitycloningofpanda

異種克隆大熊貓中科院陳大元研究員提出如何實施？目前進展156世界首例成年體細胞克隆水牛2005年3月17日在廣西大學“８６３計劃”良種牛南方繁殖中心誕生

這頭克隆水牛的順利出生，是國家“863計劃”、“生物反應器”重大研究專項的一項標志性成果，中國的水牛體細胞克隆技術已經初步成熟。

1572005年4月24日韓國科學家培育出首只克隆狗“史納比（snuppy）”漢城大學教授黃禹錫(中)

158這次研究制造的1095個胚胎只有三個成功受孕，其中一個流產，另一只小狗出生22天后因肺炎死亡，只有史納比（snuppy

）仍然生存，成功率只有0.09%

159我國第一頭體細胞克隆豬誕生

經中國農業(yè)大學李寧教授領導的課題組一年多的科技攻關，2005年8月5日，我國第一頭體細胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生。

160意大利克隆成功14頭仔豬2005年10月29日，意大利克雷莫納繁殖技術研究中心一次性成功地克隆出了14只小豬仔161國際首例體細胞克隆亞洲黃羊臨沂降生

2005年12月8日中國科學院動物研究所用山羊克隆的一只亞洲黃羊(左)與普通山羊一起在山東臨沂亮相。

162克隆猛犸象？猛犸象已經消失3000多年；沒有被破壞的猛犸象細胞；猛犸象精液；163

流產率高；難產率高；畸形率高；圍產期死亡率高；幼年死亡率高；Worryaboutmammaliancloning哺乳動物克隆的憂慮164PersonalClone克隆人克隆人做得到嗎？人的年齡會被克隆嗎？人的智力能被克隆嗎？克隆人的社會倫理問題;世界各國普遍反對克隆人;165克隆技術應該應用于哪些領域

——新浪網調查1克隆瀕臨滅絕的動物66.32%;2克隆人類部分器官用于醫(yī)療62.11%;3克隆國家保護的動物27.37%;4創(chuàng)造新的物種17.89%;5克隆可食用的動物11.58%;6克隆人類用于生活7.37%;7其它5.26%

166堅持克隆人的3位科學家意大利醫(yī)生安蒂諾里Antinori美國醫(yī)生扎沃斯Zavos邪教組織“雷利安運動”的法國科學家布瓦瑟利耶BrigitteBoisselier167Cloneofhumanembryo

克隆人類胚胎英國政府2004年8月向紐卡斯爾大學頒發(fā)了世界上第一份克隆人類胚胎的合法執(zhí)照，批準這所大學進行以醫(yī)療為目的的克隆人類胚胎研究。168Section5ChromosomeTransfer

第五節(jié)染色體轉移微細胞（微核體）介導

微細胞(minicell)：只含有一至幾條染色體、少量細胞質和完整質膜的核質體。

優(yōu)點：簡化供體；受體細胞受影響小；染色體很少損壞或不損壞；

169Preparationforminicells

微細胞制備

秋水仙素0.1μg/mL，8~16h細胞松弛素B1μg/mL，4~6h供體細胞培養(yǎng)中期細胞大小細胞懸液12000g，10min細胞松弛素B10μg/mL，0.5~1h39000g,20min含微細胞上清液微細胞

無血清培養(yǎng)基懸浮濾膜過濾微細胞微細胞沉淀

線性梯度BSA懸浮分別離心微細胞170Fusionbetweenminicellsandacceptedcells

微細胞與受體細胞融合

微細胞（百萬個）含植物凝集素P的無血清培養(yǎng)基懸浮液受體細胞10~15min，37℃凝集吸去植物凝集素P加PEG1540（30~50%）1min

吸去PEG液無血清培養(yǎng)基洗滌3次

16~24h，37℃加完全培養(yǎng)基胰酶消化，收獲離散細胞分裝培養(yǎng)瓶選擇培養(yǎng)基篩選171DirectlyChromosomeTransfer直接轉移染色體細胞同步化與染色體分離

秋水仙素處理胰酶處理離心供體細胞

4℃，20min細胞沉淀緩沖液洗滌破壞有絲分裂器37℃，10min4℃，3000rpm,10min

針筒噴射細胞破碎液密度梯度離心染色體分離大小染色體流式細胞儀172ChromosomeTransfer

染色體轉移顯微注射法細胞直接吞噬法染色體-磷酸鈣共沉淀法染色體懸液與CaCl2（2mol/L）按16：1混勻滴入受體細胞

20min37℃,4h,CO2培育箱

加入完全培養(yǎng)基（20mL)加二甲亞砜（30%）10mL30s

加10mL新培養(yǎng)液吸去培養(yǎng)液胰酶消化收獲細胞選擇培養(yǎng)基

173Lipidsomepacking脂質體包裝法乙醚-氯仿-染色體懸液2mL

37℃旋轉蒸發(fā)卵磷脂-膽固醇混合液

100000g,30min棄上清染色體懸液，培養(yǎng)液脂質體懸液脂質體沉淀混懸液

滴加2h

受體細胞加PEG吸去各液體

24h加新鮮培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)基混合174乙醚：氯仿=1：1107條染色體?mL-1乙醚-氯仿染色體懸液配方：175Prescriptionforchromosomesuspension

染色體懸液配方NaCl8.0gKCl0.2gK2HPO41.15gKH2PO4

0.2g無菌水定容1000mL176Section6ResearchonHumanStemCell

第六節(jié)人干細胞研究

干細胞是動物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞，是重建、修復病損或衰老組織、器官功能的理想種子細胞。

177EngineeringofStemCell

干細胞工程上世紀五十年代，科學家在畸形胎瘤中首次發(fā)現(xiàn)了胚胎干細胞（EmbryonicStemCell,ESC），從此開創(chuàng)了干細胞生物學研究的歷程。1970年，MartinEvans分離出小鼠胚胎干細胞并在體外進行培養(yǎng)。接著，科學家直接從病人的身上提取某種特殊的細胞使之長成皮膚、骨胳和軟骨，甚至是重要器官的一部分，這類細胞就是干細胞。1997年人的胚胎干細胞被首次培養(yǎng)成功，從而科學家開始了嘗試“定制”器官救助生命的干細胞工程，即非繁殖性克隆或治療性克隆研究。178全能性干細胞（胚胎干細胞）；多能性干細胞；專一性干細胞；

TypesofStemCells

干細胞的