SDSPAGE電泳注意事項(xiàng)

SDSPAGE電泳注意事項(xiàng)SDSPAGE電泳注意事項(xiàng)3/3SDSPAGE電泳注意事項(xiàng)SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大高出了蛋白原有的電荷量，這樣就除掉了不同樣分子間的電荷差別和結(jié)構(gòu)差別。濃縮膠的作用是有積聚作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法?；瘜W(xué)聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。不連續(xù)系統(tǒng)由電極緩沖液、濃縮膠及分別膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為的Tris-HCl。分別膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為Tris-HCl。電極緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖系統(tǒng)、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測(cè)，純化的蛋白質(zhì)平時(shí)在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但若是蛋白質(zhì)是由不同樣的亞基組成的，它在電泳中可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶。注意問題1.樣品辦理上樣緩沖液的作用：形成SDS-蛋白復(fù)合物，使其帶負(fù)電；SDS和巰基乙醇使蛋白質(zhì)解離，綜上兩點(diǎn)為了在電泳中，只依照分子量來分別。SDS作用：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊，還有助溶劑的作用。SDS電泳凝膠中各主要成分的作用（1）濃縮與分別膠凝固的利害直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境親近相關(guān)。提高SDS電泳分辨率的路子待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易以致凝固不充分，后者可以致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。4..“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因主若是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。辦理方法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！鞍櫭肌保▋蛇呄蛳轮虚g鼓起）形帶原因主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部縫隙氣泡未消除干凈。辦理方法：可在兩板間加入合適緩沖液，以消除氣泡。帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象主若是樣品融解收效不好或分別膠濃度過大引起的。辦理方法：加樣前離心；選擇合適的樣品緩沖液，加合適樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長，重新配制；降低凝膠濃度。帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象主若是樣品不溶性顆粒引起的。辦理方法：加樣前離心；加合適樣品促溶劑。溴酚藍(lán)不能夠起到指示作用實(shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分別膠的濃度相關(guān)。辦理方法：更換正確pH值的Buffer；降低分別膠的濃度。電泳的條帶很粗電泳中條帶很粗是常有的事，主若是未濃縮好的原因。辦理方法：合適增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（）；合適降低電壓；電泳電壓很高而電流卻很低呢比方電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主若是由于電泳槽沒有正確裝置，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比方倒膠用的橡膠皮）。濃縮膠與分別膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳影響一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在清除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。12.凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快平時(shí)膠在

30MIN-1H

內(nèi)凝。若是凝的太慢，可能是

TEMED，APS劑量不夠也許無效。

APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，

TEMED不牢固，易被氧化成黃色。

若是凝的太快，可能是

APS和

TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。13.電泳時(shí)間比正常要長可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分別物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。分別膠加上后為什么要馬上加水加入分別膠后，馬上覆一層雙蒸水，一是為了使分別膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線上；二是阻攔空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的控制作用。注意：SDS電泳要點(diǎn)在于膠可否制得均勻平展，自然這跟灌膠用的模具和方法有必然關(guān)系。加入TEMED和過硫酸銨后丙烯酰胺開始聚合，但是過硫酸銨易被氧化，所以操作要迅速，而且最后要液封，保證模具內(nèi)不漏氣才能使膠聚合的很好。同時(shí)不要把制膠用的玻璃板中間壓太緊，這樣