凝膠色譜課件

凝膠色譜發(fā)展歷史凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。

基本理論1.分子篩效益

分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時(shí)，按照分子量大小“排隊(duì)，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。

2.色譜柱的重要參數(shù)（1）柱體積：常用Vt

表示。（2）外水體積：常用Vo表示。（3）內(nèi)水體積：常用Vi表示。

不包括固體支持物的體積（Vg）。（4）峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve

表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，（與洗脫體積比較可以忽略不計(jì)），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。

凝膠色譜法凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機(jī)溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時(shí)根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的目的凝膠的種類及性質(zhì)（一）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）

⑴Sephadex

G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。

⑵Sephadex

LH-20，是─Sephadex

G-25的羧丙基衍生物，

能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)（二）瓊脂糖凝膠：

商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia

），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。

（三）聚丙烯酰胺凝膠：

是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，

由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P

（Bio-Gel

P），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P

后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。

（四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel

，

具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，

可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。

（二）凝膠的選擇

根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。

一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex

G-20的吸水量為20，1

克Sephadex

G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex

G-200效果好，

脫鹽用Sephadex

G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

（四）樣品溶液的處理

樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex

G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4