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實(shí)驗(yàn)專題模塊五
RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)總RNA的提取反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)專題模塊五
RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)總RNA的RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物,存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的,如cDNA合成、定量PCR、Northern雜交及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗,在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。RNA中rRNA的數(shù)量最多,占總量的80%~85%;tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%~20%;mRNA僅占1%~5%。從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā),目前對(duì)RNA的分離與純化,主要集中在總RNA與mRNA上。RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物,存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)RNA進(jìn)在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響后續(xù)RNA分析的結(jié)果,所以RNA的制備與分析操作難度相對(duì)較大。在實(shí)驗(yàn)中,一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶;另一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染。在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,最關(guān)鍵的因素是分離得到全注意與要求:①RNA操作應(yīng)在專門的區(qū)域進(jìn)行,離心機(jī)、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。②操作過程中應(yīng)自始至終佩戴一次性橡膠或乳膠手套,以避免將手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。③實(shí)驗(yàn)使用槍頭、離心管等塑料制品需均經(jīng)由0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡過夜,然后滅菌,烘干。所有玻璃制品都必須在180℃烘烤2小時(shí)。盡量避免與其它實(shí)驗(yàn)共享器具,以防止交叉污染。④配制溶液用的酒精,異丙醇等應(yīng)使用RNA實(shí)驗(yàn)專用的試劑。注意與要求:提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物,即可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而獲得目的基因或檢測(cè)目的基因的表達(dá)。鑒于基因表達(dá)差異分析在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用,本模塊主要以食管癌細(xì)胞中目標(biāo)基因如LCN2(lipocalin2)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的定量檢測(cè)為例,旨在使學(xué)生能夠系統(tǒng)地理解RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過程,熟練使用有關(guān)儀器和軟件,掌握基本操作和分析過程,并學(xué)會(huì)運(yùn)用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法,利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源,獨(dú)立設(shè)計(jì)出相關(guān)解決方案,并能夠評(píng)價(jià)與實(shí)施這一方案。提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的m實(shí)驗(yàn)一總RNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解并掌握總RNA提取的基本原理。2.熟悉TRIzol法提取細(xì)胞總RNA的具體操作過程。實(shí)驗(yàn)一總RNA的提取二、實(shí)驗(yàn)原理總RNA的提取圍繞著一條主線,即保護(hù)RNA的完整性,使RNA免受RNase的酶解。圍繞這條主線,要關(guān)注RNase-Free工作環(huán)境的建立、反應(yīng)中RNase-Free條件的保持、RNA的保存等一系列細(xì)節(jié)問題。所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),即1)樣品細(xì)胞或組織的有效破碎;2)有效地使核蛋白復(fù)合體變性;3)對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制;4)有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離;5)對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。二、實(shí)驗(yàn)原理總RNA的提取圍繞著一條主線,即TRIzol試劑提取總RNA該法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法,其產(chǎn)率與(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相當(dāng)。它是以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞。異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑,可溶解蛋白質(zhì),其主要作用是裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚而得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì),但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后,溶液分為水相和有機(jī)相,變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面,保留于上層水相的RNA在RNA沉淀溶液中通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌進(jìn)行制備。Trizol試劑可用于小量樣品(50~100mg組織、5×106細(xì)胞)也適用于大量樣品(≥1g組織、>107細(xì)胞)。對(duì)人,動(dòng)物,植物組織,細(xì)菌均適用,整個(gè)提取過程在一小時(shí)內(nèi)即可完成。TRIzol試劑提取總RNA三、實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:a單層培養(yǎng)細(xì)胞:細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞滿度達(dá)90%以上或成融合狀態(tài)時(shí),棄去培養(yǎng)基,用1ml槍頭將剩余培養(yǎng)基吸干,每個(gè)孔直接加入500μl的TRIzol試劑裂解細(xì)胞(每10cm2面積加1ml試劑).將培養(yǎng)板放在三維迷你搖床上,室溫(15-30℃)下充分裂解,至少需5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。(注:加TRIzol之前勿需洗滌細(xì)胞。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有基因組DNA污染。)1.樣品處理:2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。3.4℃下,11000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機(jī)相,上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。4.把水相轉(zhuǎn)移到新管中,加入0.5ml異丙醇(1mlTRIzol的用量),充分混勻后,室溫放置10分鐘,以沉淀水相中的RNA。5.4℃下,11000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。棄去上清。6.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。4℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清,將離心管倒置在吸水紙上,讓殘留乙醇揮發(fā),時(shí)間約為5分鐘。(注意不要完全晾干,否則會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性降低)2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩7.加入10μlDEPC水,蓋緊蓋子,輕彈管底,使RNA沉淀充分溶解,冰上放置10分鐘。8.RNA含量測(cè)定:紫外分光光度法測(cè)量所提RNA的濃度與純度,并登記在實(shí)驗(yàn)記錄本上。剩余RNA保存于-80?C冰箱中,備用。注:RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度,OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑,用DEPC水稀釋DNA樣品n倍并以DEPC水為空白對(duì)照,根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度:RNA(mg/ml)=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000(RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0,故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低,說明有殘余蛋白質(zhì)和基因組DNA污染;比值太高,則提示RNA有降解)7.加入10μlDEPC水,蓋緊蓋子,輕彈管底,使RNA實(shí)驗(yàn)二反轉(zhuǎn)錄一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠⒄莆誧DNA合成的基本原理及其具體操作過程。實(shí)驗(yàn)二反轉(zhuǎn)錄二、實(shí)驗(yàn)原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中,人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之為模板人工合成DNA的過程。反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化,該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA(cDNA)。反轉(zhuǎn)錄酶存在于一些RNA病毒中,可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。人類免疫缺陷病毒(HIV)也是一種RNA病毒,含有反轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶,推測(cè)可能與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。二、實(shí)驗(yàn)原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中,人為大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性:以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。②RNaseH活性:由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性:以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、Oligo(dT)或基因特異性的引物起始。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種引物都可采用。①隨機(jī)引物適用于任何類型的RNA模板,但由于特異性低,主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。用此種方法時(shí),體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板,通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。②Oligo(dT)只適用于具有PolyA尾巴的RNA,對(duì)無PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。由于PolyARNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。③基因特異性引物是根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的互補(bǔ)引物,特異性好,但僅適用于目的序列已知的情況。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、OligcDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物,無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無基因組DNA的污染。目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。本實(shí)驗(yàn)將以TaKaRa公司提供的PrimeScriptRTreagentKit試劑盒(CodeNo.RR037A)為例進(jìn)行介紹。cDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或?qū)n}模塊五RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)課件專題模塊五RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)課件三、實(shí)驗(yàn)操作*1:OligodTPrimer和Random6mers同時(shí)使用,可有效將全長(zhǎng)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.*2:10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系可最大使用500ng的TotalRNA。1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制:按如下成分于冰上配制反應(yīng)混合液,為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性,進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí),應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制MasterMix,然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中,最后加入RNA樣品。輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。*1:OligodTPrimer和Random6me2.反應(yīng)條件(注:上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第一步,37℃,15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))
第二步,85℃,5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))第三步,4℃注:1.將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中,其加入量不要超過PCR反應(yīng)體積的1/10(V/V)量。2.合成的cDNA需要長(zhǎng)期保存時(shí),請(qǐng)于-20℃或更低溫度保存。2.反應(yīng)條件(注:上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第實(shí)驗(yàn)三實(shí)時(shí)熒光定量PCR一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解并掌握實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理2.熟悉使用有關(guān)儀器和軟件,掌握基本操作和分析過程,并學(xué)會(huì)運(yùn)用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法,利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源,獨(dú)立設(shè)計(jì)出相關(guān)解決方案。實(shí)驗(yàn)三實(shí)時(shí)熒光定量PCR二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction,Real-TimePCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”,最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中cDNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,實(shí)時(shí)熒光定量試劑,通用電腦,自動(dòng)分析軟件等構(gòu)成。設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成(見圖3-2),用來監(jiān)測(cè)循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?;幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?;罂梢栽O(shè)定域值水平,這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值(限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù))。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大,這樣可以獲得最準(zhǔn)確,可重復(fù)性的數(shù)據(jù)(見圖3-3)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,實(shí)時(shí)圖3-27500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-27500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-3擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜
線性圖譜qPCR
的擴(kuò)增曲線有兩種視圖方式:線性圖譜和對(duì)數(shù)圖譜。圖3-3擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜1.基線的定義(見圖3-4)是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里,熒光信號(hào)變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線。圖3-4基線對(duì)數(shù)圖譜
線性圖譜1.基線的定義(見圖3-4)圖3-4基線對(duì)數(shù)圖譜2.熒光域值(threshold)的設(shè)定(見圖3-5)一般將PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,熒光閾值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。對(duì)數(shù)圖譜
線性圖譜圖3-5閾值2.熒光域值(threshold)的設(shè)定(見圖3-5)對(duì)數(shù)圖3.Ct值的定義(見圖3-6)在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個(gè)很重要的概念--Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。圖3-6Ct值的定義3.Ct值的定義(見圖3-6)圖3-6Ct值的定義4.Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代Ct值(見圖3-7)。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖3-7如何使用Ct值計(jì)算結(jié)果4.Ct值與起始模板的關(guān)系圖3-7如何使用Ct值計(jì)算結(jié)果5.熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。不同的儀器可選用的熒光標(biāo)記組合不一(見圖3-8)。圖3-87500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可使用的熒光標(biāo)記5.熒光化學(xué)圖3-87500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可使1)TaqMan熒光探針(見圖3-9):PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5′→3′核酸外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。1)TaqMan熒光探針(見圖3-9):PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一圖3-9TaqMan熒光探針圖3-9TaqMan熒光探針2)SYBR熒光染料(見圖3-10):在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。圖3-10SYBR熒光染料2)SYBR熒光染料(見圖3-10):在PCR反應(yīng)體系中,加本實(shí)驗(yàn)將以TaKaRa公司提供的TBGreen?FastqPCRMix試劑盒(CodeNo.RR430B)為例進(jìn)行介紹。本實(shí)驗(yàn)將以TaKaRa公司提供的TBGreen?Fast●使用注意以下為使用本試劑盒時(shí)的注意事項(xiàng),使用前一定認(rèn)真閱讀。1.使用前,請(qǐng)上下輕輕顛倒混勻,避免產(chǎn)生氣泡,試劑混勻后再使用。試劑混合不均勻會(huì)造成反應(yīng)效果不佳。(1)請(qǐng)勿渦旋振蕩混勻。(2)TBGreenFastqPCRMix(2×)在-20℃保存時(shí),可能會(huì)產(chǎn)生白色或淡黃色的沉淀。可用手握緩慢溶解,或于室溫短時(shí)間避光放置后,上下顛倒混勻直至沉淀全部消失。(3)沉淀會(huì)導(dǎo)致試劑組份不均勻,必須混勻后再使用。2.配制反應(yīng)液時(shí),試劑請(qǐng)于冰上放置。3.本制品中含有熒光染料TBGreen,配制PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。4.反應(yīng)液的配制、分裝請(qǐng)一定使用新的一次性槍頭、盡量避免樣品間的污染?!袷褂米⒁馊?、實(shí)驗(yàn)操作1.建立Real-timePCR反應(yīng)體系:于冰上溶解TBGreen?FastqPCRMix,cDNA模板,引物(LCN2和β-actin)和RNase-freedH2O,混勻。依次在8聯(lián)管內(nèi)加入下列試劑(10μl反應(yīng)體系):*2:ROXReferenceDyeII(50×)比ROXReferenceDye(50×)濃度低,使用AppliedBiosystems7500Real-TimePCR時(shí),使用ROXReferenceDyeII(50×)。注:反應(yīng)體系可隨需要調(diào)整,反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行,多個(gè)樣品同時(shí)操作時(shí),可以先配制一個(gè)MasterMix,再分裝到各管。1.建立Real-timePCR反應(yīng)體系:于冰上溶解TB2.進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件第一步,預(yù)變性:95℃,30sec第二步,PCR反應(yīng):95℃,5sec,60℃,34sec,40個(gè)循環(huán)。第三步,溶解曲線分析注:1.選擇所使用的熒光通道(FAM、ROX);2.采用兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng),當(dāng)出現(xiàn)模板濃度過低引起非特異性擴(kuò)增,引物Tm值較低導(dǎo)致的擴(kuò)增效率低下或擴(kuò)增曲線重現(xiàn)性不佳等現(xiàn)象時(shí),可嘗試進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2.進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)注:1.選擇所使用3.將反應(yīng)體系(8聯(lián)管)置于熒光定量PCR儀中,設(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)條件(注意設(shè)置熒光收集),開始反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)是在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR-LifeTech(appliedbiosystems)系統(tǒng)上進(jìn)行的。4.反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RealTimePCR的擴(kuò)增曲線(是否具有特征性的三個(gè)增長(zhǎng)階段,見圖3-11)和融解曲線;通過分析溶解曲線來判斷反應(yīng)的特異性(見圖3-12),理想的溶解曲線是單峰型,如果出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的峰,說明有引物二聚體或其它非特異擴(kuò)增的存在。3.將反應(yīng)體系(8聯(lián)管)置于熒光定量PCR儀中,設(shè)置相應(yīng)的圖3-11
正常擴(kuò)增圖3-12單一PCR產(chǎn)物的熔解曲線圖3-11正常擴(kuò)增圖3-12單一PCR產(chǎn)物的熔解曲線5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理:ComparativeDelta-deltaCt法
ComparativeDelta-deltaCt法是常用的一種相對(duì)定量方法,是基于熒光定量的數(shù)學(xué)計(jì)算模型的簡(jiǎn)化形式,用于比較不同樣品之間的差別或變化比率。其最大特點(diǎn)是,當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后,在每次實(shí)驗(yàn)中無需再對(duì)看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線,而只需對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。其缺點(diǎn)是,每次實(shí)驗(yàn)都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致,而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映,這里勢(shì)必存在一定的誤差。注:在使用該法展開實(shí)驗(yàn)前,必需對(duì)目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,即M值的差小于0.1,那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。反之,如果M差值大于0.1,則需換用其它的相對(duì)定量方法。5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理:ComparativeDelta-d數(shù)據(jù)分析步驟:1)同一樣品分別進(jìn)行看家基因和目的基因的擴(kuò)增2)在Excel軟件計(jì)算(2-△△Ct):其中△Ct=目的基因Ct值-看家基因Ct值;△△Ct值=實(shí)驗(yàn)樣品△Ct-對(duì)照樣品△Ct。最終結(jié)果以柱形圖進(jìn)行呈現(xiàn)(對(duì)照樣品數(shù)值為1,實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)值為2-△△Ct)。例:2-△△Ct=POWER(2,-△△Ct)數(shù)據(jù)分析步驟:例:2-△△Ct=POWER(2,-△四、預(yù)期結(jié)果
擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線1.到目前為止,人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療,只能通過產(chǎn)前監(jiān)測(cè),減少病嬰出生,以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生,如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生,從孕婦的外周血中分離胎兒DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法,易為孕婦所接受。請(qǐng)嘗試用你學(xué)到的相關(guān)知識(shí),設(shè)計(jì)一個(gè)可能的實(shí)驗(yàn)方案。2.熒光定量PCR被廣泛用于H7N9人感染禽流感檢測(cè),請(qǐng)談?wù)勥€有哪些常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段可應(yīng)用于禽流感的檢測(cè)。課堂分組討論1.到目前為止,人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法實(shí)驗(yàn)專題模塊五
RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)總RNA的提取反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)專題模塊五
RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)總RNA的RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物,存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的,如cDNA合成、定量PCR、Northern雜交及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗,在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。RNA中rRNA的數(shù)量最多,占總量的80%~85%;tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%~20%;mRNA僅占1%~5%。從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā),目前對(duì)RNA的分離與純化,主要集中在總RNA與mRNA上。RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物,存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)RNA進(jìn)在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響后續(xù)RNA分析的結(jié)果,所以RNA的制備與分析操作難度相對(duì)較大。在實(shí)驗(yàn)中,一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶;另一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染。在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,最關(guān)鍵的因素是分離得到全注意與要求:①RNA操作應(yīng)在專門的區(qū)域進(jìn)行,離心機(jī)、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。②操作過程中應(yīng)自始至終佩戴一次性橡膠或乳膠手套,以避免將手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。③實(shí)驗(yàn)使用槍頭、離心管等塑料制品需均經(jīng)由0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡過夜,然后滅菌,烘干。所有玻璃制品都必須在180℃烘烤2小時(shí)。盡量避免與其它實(shí)驗(yàn)共享器具,以防止交叉污染。④配制溶液用的酒精,異丙醇等應(yīng)使用RNA實(shí)驗(yàn)專用的試劑。注意與要求:提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物,即可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而獲得目的基因或檢測(cè)目的基因的表達(dá)。鑒于基因表達(dá)差異分析在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用,本模塊主要以食管癌細(xì)胞中目標(biāo)基因如LCN2(lipocalin2)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的定量檢測(cè)為例,旨在使學(xué)生能夠系統(tǒng)地理解RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過程,熟練使用有關(guān)儀器和軟件,掌握基本操作和分析過程,并學(xué)會(huì)運(yùn)用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法,利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源,獨(dú)立設(shè)計(jì)出相關(guān)解決方案,并能夠評(píng)價(jià)與實(shí)施這一方案。提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的m實(shí)驗(yàn)一總RNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解并掌握總RNA提取的基本原理。2.熟悉TRIzol法提取細(xì)胞總RNA的具體操作過程。實(shí)驗(yàn)一總RNA的提取二、實(shí)驗(yàn)原理總RNA的提取圍繞著一條主線,即保護(hù)RNA的完整性,使RNA免受RNase的酶解。圍繞這條主線,要關(guān)注RNase-Free工作環(huán)境的建立、反應(yīng)中RNase-Free條件的保持、RNA的保存等一系列細(xì)節(jié)問題。所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),即1)樣品細(xì)胞或組織的有效破碎;2)有效地使核蛋白復(fù)合體變性;3)對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制;4)有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離;5)對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。二、實(shí)驗(yàn)原理總RNA的提取圍繞著一條主線,即TRIzol試劑提取總RNA該法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法,其產(chǎn)率與(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相當(dāng)。它是以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞。異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑,可溶解蛋白質(zhì),其主要作用是裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚而得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì),但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后,溶液分為水相和有機(jī)相,變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面,保留于上層水相的RNA在RNA沉淀溶液中通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌進(jìn)行制備。Trizol試劑可用于小量樣品(50~100mg組織、5×106細(xì)胞)也適用于大量樣品(≥1g組織、>107細(xì)胞)。對(duì)人,動(dòng)物,植物組織,細(xì)菌均適用,整個(gè)提取過程在一小時(shí)內(nèi)即可完成。TRIzol試劑提取總RNA三、實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:a單層培養(yǎng)細(xì)胞:細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞滿度達(dá)90%以上或成融合狀態(tài)時(shí),棄去培養(yǎng)基,用1ml槍頭將剩余培養(yǎng)基吸干,每個(gè)孔直接加入500μl的TRIzol試劑裂解細(xì)胞(每10cm2面積加1ml試劑).將培養(yǎng)板放在三維迷你搖床上,室溫(15-30℃)下充分裂解,至少需5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。(注:加TRIzol之前勿需洗滌細(xì)胞。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有基因組DNA污染。)1.樣品處理:2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。3.4℃下,11000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機(jī)相,上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。4.把水相轉(zhuǎn)移到新管中,加入0.5ml異丙醇(1mlTRIzol的用量),充分混勻后,室溫放置10分鐘,以沉淀水相中的RNA。5.4℃下,11000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。棄去上清。6.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。4℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清,將離心管倒置在吸水紙上,讓殘留乙醇揮發(fā),時(shí)間約為5分鐘。(注意不要完全晾干,否則會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性降低)2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩7.加入10μlDEPC水,蓋緊蓋子,輕彈管底,使RNA沉淀充分溶解,冰上放置10分鐘。8.RNA含量測(cè)定:紫外分光光度法測(cè)量所提RNA的濃度與純度,并登記在實(shí)驗(yàn)記錄本上。剩余RNA保存于-80?C冰箱中,備用。注:RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度,OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑,用DEPC水稀釋DNA樣品n倍并以DEPC水為空白對(duì)照,根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度:RNA(mg/ml)=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000(RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0,故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低,說明有殘余蛋白質(zhì)和基因組DNA污染;比值太高,則提示RNA有降解)7.加入10μlDEPC水,蓋緊蓋子,輕彈管底,使RNA實(shí)驗(yàn)二反轉(zhuǎn)錄一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠⒄莆誧DNA合成的基本原理及其具體操作過程。實(shí)驗(yàn)二反轉(zhuǎn)錄二、實(shí)驗(yàn)原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中,人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之為模板人工合成DNA的過程。反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化,該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA(cDNA)。反轉(zhuǎn)錄酶存在于一些RNA病毒中,可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。人類免疫缺陷病毒(HIV)也是一種RNA病毒,含有反轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶,推測(cè)可能與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。二、實(shí)驗(yàn)原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中,人為大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性:以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。②RNaseH活性:由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性:以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、Oligo(dT)或基因特異性的引物起始。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種引物都可采用。①隨機(jī)引物適用于任何類型的RNA模板,但由于特異性低,主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。用此種方法時(shí),體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板,通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。②Oligo(dT)只適用于具有PolyA尾巴的RNA,對(duì)無PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。由于PolyARNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。③基因特異性引物是根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的互補(bǔ)引物,特異性好,但僅適用于目的序列已知的情況。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、OligcDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物,無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無基因組DNA的污染。目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。本實(shí)驗(yàn)將以TaKaRa公司提供的PrimeScriptRTreagentKit試劑盒(CodeNo.RR037A)為例進(jìn)行介紹。cDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或?qū)n}模塊五RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)課件專題模塊五RNA的提取及定量PCR檢測(cè)技術(shù)課件三、實(shí)驗(yàn)操作*1:OligodTPrimer和Random6mers同時(shí)使用,可有效將全長(zhǎng)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.*2:10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系可最大使用500ng的TotalRNA。1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制:按如下成分于冰上配制反應(yīng)混合液,為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性,進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí),應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制MasterMix,然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中,最后加入RNA樣品。輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。*1:OligodTPrimer和Random6me2.反應(yīng)條件(注:上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第一步,37℃,15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))
第二步,85℃,5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))第三步,4℃注:1.將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中,其加入量不要超過PCR反應(yīng)體積的1/10(V/V)量。2.合成的cDNA需要長(zhǎng)期保存時(shí),請(qǐng)于-20℃或更低溫度保存。2.反應(yīng)條件(注:上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第實(shí)驗(yàn)三實(shí)時(shí)熒光定量PCR一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解并掌握實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理2.熟悉使用有關(guān)儀器和軟件,掌握基本操作和分析過程,并學(xué)會(huì)運(yùn)用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法,利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源,獨(dú)立設(shè)計(jì)出相關(guān)解決方案。實(shí)驗(yàn)三實(shí)時(shí)熒光定量PCR二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction,Real-TimePCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”,最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中cDNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,實(shí)時(shí)熒光定量試劑,通用電腦,自動(dòng)分析軟件等構(gòu)成。設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成(見圖3-2),用來監(jiān)測(cè)循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來彌補(bǔ)背景熒光的差異。正?;罂梢栽O(shè)定域值水平,這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值(限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù))。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大,這樣可以獲得最準(zhǔn)確,可重復(fù)性的數(shù)據(jù)(見圖3-3)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,實(shí)時(shí)圖3-27500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-27500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-3擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜
線性圖譜qPCR
的擴(kuò)增曲線有兩種視圖方式:線性圖譜和對(duì)數(shù)圖譜。圖3-3擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜1.基線的定義(見圖3-4)是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里,熒光信號(hào)變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線。圖3-4基線對(duì)數(shù)圖譜
線性圖譜1.基線的定義(見圖3-4)圖3-4基線對(duì)數(shù)圖譜2.熒光域值(threshold)的設(shè)定(見圖3-5)一般將PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,熒光閾值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。對(duì)數(shù)圖譜
線性圖譜圖3-5閾值2.熒光域值(threshold)的設(shè)定(見圖3-5)對(duì)數(shù)圖3.Ct值的定義(見圖3-6)在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個(gè)很重要的概念--Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。圖3-6Ct值的定義3.Ct值的定義(見圖3-6)圖3-6Ct值的定義4.Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代Ct值(見圖3-7)。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖3-7如何使用Ct值計(jì)算結(jié)果4.Ct值與起始模板的關(guān)系圖3-7如何使用Ct值計(jì)算結(jié)果5.熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。不同的儀器可選用的熒光標(biāo)記組合不一(見圖3-8)。圖3-87500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可使用的熒光標(biāo)記5.熒光化學(xué)圖3-87500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可使1)TaqMan熒光探針(見圖3-9):PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5′→3′核酸外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。1)TaqMan熒光探針(見圖3-9):PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一圖3-9TaqMan熒光探針圖3-9TaqMan熒光探針2)SYBR熒光染料(見圖3-10):在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。圖3-10SYBR熒光染料2)SYBR熒光染料(見圖3-10):在PCR反應(yīng)體系中,加本實(shí)驗(yàn)將以TaKaRa公司提供的TBGreen?FastqPCRMix試劑盒(CodeNo.RR430B)為例進(jìn)行介紹。本實(shí)驗(yàn)將以TaKaRa公司提供的TBGreen?Fast●使用注意以下為使用本試劑盒時(shí)的注意事項(xiàng),使用前一定認(rèn)真閱讀。1.使用前,請(qǐng)上下輕輕顛倒混勻,避免產(chǎn)生氣泡,試劑混勻后再使用。試劑混合不均勻會(huì)造成反應(yīng)效果不佳。(1)請(qǐng)勿渦旋振蕩混勻。(2)TBGreenFastqPCRMix(2×)在-20℃保存時(shí),可能會(huì)產(chǎn)生白色或淡黃色的沉淀??捎檬治站徛芙?,或于室溫短時(shí)間避光放置后,上下顛倒混勻直至沉淀全部消失。(3)沉淀會(huì)導(dǎo)致試劑組份不均勻,必須混勻后再使用。2.配制反應(yīng)液時(shí),試劑請(qǐng)于冰上放置。3.本制品中含有熒光染料TBGreen,配制PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免
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