專題模塊五RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)課件

實驗專題模塊五

RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)總RNA的提取反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR實驗專題模塊五

RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)總RNA的RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實驗所必需的，如cDNA合成、定量PCR、Northern雜交及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。RNA中rRNA的數(shù)量最多，占總量的80%～85%；tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%～20%；mRNA僅占1%～5%。從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā)，目前對RNA的分離與純化，主要集中在總RNA與mRNA上。RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對RNA進(jìn)在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響后續(xù)RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度相對較大。在實驗中，一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶；另一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染。在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全注意與要求：①RNA操作應(yīng)在專門的區(qū)域進(jìn)行，離心機(jī)、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。②操作過程中應(yīng)自始至終佩戴一次性橡膠或乳膠手套，以避免將手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。③實驗使用槍頭、離心管等塑料制品需均經(jīng)由0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡過夜，然后滅菌，烘干。所有玻璃制品都必須在180℃烘烤2小時。盡量避免與其它實驗共享器具，以防止交叉污染。④配制溶液用的酒精，異丙醇等應(yīng)使用RNA實驗專用的試劑。注意與要求：提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物，即可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測目的基因的表達(dá)。鑒于基因表達(dá)差異分析在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用，本模塊主要以食管癌細(xì)胞中目標(biāo)基因如LCN2(lipocalin2)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的定量檢測為例，旨在使學(xué)生能夠系統(tǒng)地理解RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR檢測過程，熟練使用有關(guān)儀器和軟件，掌握基本操作和分析過程，并學(xué)會運用相關(guān)的實驗技術(shù)與方法，利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源，獨立設(shè)計出相關(guān)解決方案，并能夠評價與實施這一方案。提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的m實驗一總RNA的提取一、實驗?zāi)康?.了解并掌握總RNA提取的基本原理。2.熟悉TRIzol法提取細(xì)胞總RNA的具體操作過程。實驗一總RNA的提取二、實驗原理總RNA的提取圍繞著一條主線，即保護(hù)RNA的完整性，使RNA免受RNase的酶解。圍繞這條主線，要關(guān)注RNase-Free工作環(huán)境的建立、反應(yīng)中RNase-Free條件的保持、RNA的保存等一系列細(xì)節(jié)問題。所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即1）樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；2）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；3）對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；4）有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；5）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。二、實驗原理總RNA的提取圍繞著一條主線，即TRIzol試劑提取總RNA該法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法，其產(chǎn)率與(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相當(dāng)。它是以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚而得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面，保留于上層水相的RNA在RNA沉淀溶液中通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌進(jìn)行制備。Trizol試劑可用于小量樣品（50~100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）。對人，動物，植物組織，細(xì)菌均適用，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。TRIzol試劑提取總RNA三、實驗操作1.樣品處理：a單層培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞滿度達(dá)90%以上或成融合狀態(tài)時，棄去培養(yǎng)基，用1ml槍頭將剩余培養(yǎng)基吸干，每個孔直接加入500μl的TRIzol試劑裂解細(xì)胞（每10cm2面積加1ml試劑）．將培養(yǎng)板放在三維迷你搖床上，室溫（15-30℃）下充分裂解，至少需5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。（注：加TRIzol之前勿需洗滌細(xì)胞。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有基因組DNA污染。）1.樣品處理：2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。3.4℃下，11000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。4.把水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.5ml異丙醇（1mlTRIzol的用量），充分混勻后，室溫放置10分鐘，以沉淀水相中的RNA。5.4℃下，11000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。棄去上清。6.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。4℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清，將離心管倒置在吸水紙上，讓殘留乙醇揮發(fā)，時間約為5分鐘。（注意不要完全晾干，否則會導(dǎo)致RNA的溶解性降低）2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩7.加入10μlDEPC水，蓋緊蓋子，輕彈管底，使RNA沉淀充分溶解，冰上放置10分鐘。8.RNA含量測定：紫外分光光度法測量所提RNA的濃度與純度，并登記在實驗記錄本上。剩余RNA保存于-80?C冰箱中，備用。注：RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用DEPC水稀釋DNA樣品n倍并以DEPC水為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000（RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)和基因組DNA污染；比值太高，則提示RNA有降解）7.加入10μlDEPC水，蓋緊蓋子，輕彈管底，使RNA實驗二反轉(zhuǎn)錄一、實驗?zāi)康牧私獠⒄莆誧DNA合成的基本原理及其具體操作過程。實驗二反轉(zhuǎn)錄二、實驗原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶存在于一些RNA病毒中，可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。人類免疫缺陷病毒（HIV）也是一種RNA病毒，含有反轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶，推測可能與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。二、實驗原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中，人為大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性：由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、Oligo(dT)或基因特異性的引物起始。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種引物都可采用。①隨機(jī)引物適用于任何類型的RNA模板，但由于特異性低，主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。②Oligo(dT)只適用于具有PolyA尾巴的RNA，對無PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。由于PolyARNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。③基因特異性引物是根據(jù)模板序列設(shè)計的互補(bǔ)引物，特異性好，但僅適用于目的序列已知的情況。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、OligcDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物，無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無基因組DNA的污染。目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。本實驗將以TaKaRa公司提供的PrimeScriptRTreagentKit試劑盒（CodeNo.RR037A）為例進(jìn)行介紹。cDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或?qū)ｎ}模塊五RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)課件專題模塊五RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)課件三、實驗操作*1：OligodTPrimer和Random6mers同時使用，可有效將全長mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.*2：10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系可最大使用500ng的TotalRNA。1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制：按如下成分于冰上配制反應(yīng)混合液，為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項反應(yīng)時，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制MasterMix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中，最后加入RNA樣品。輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。*1：OligodTPrimer和Random6me2.反應(yīng)條件(注：上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第一步，37℃，15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）

第二步，85℃，5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）第三步，4℃注：1.將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中，其加入量不要超過PCR反應(yīng)體積的1/10（V/V）量。2.合成的cDNA需要長期保存時，請于-20℃或更低溫度保存。2.反應(yīng)條件(注：上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第實驗三實時熒光定量PCR一、實驗?zāi)康?.了解并掌握實時熒光定量PCR的基本原理2.熟悉使用有關(guān)儀器和軟件，掌握基本操作和分析過程，并學(xué)會運用相關(guān)的實驗技術(shù)與方法，利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源，獨立設(shè)計出相關(guān)解決方案。實驗三實時熒光定量PCR二、實驗原理實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction，Real-TimePCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中cDNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。二、實驗原理實時熒光定量PCR技術(shù)（Real熒光定量檢測系統(tǒng)由實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量試劑，通用電腦，自動分析軟件等構(gòu)成。設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計算機(jī)組成（見圖3-2），用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?；幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)（見圖3-3）。如果同時擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。熒光定量檢測系統(tǒng)由實時熒光定量PCR儀，實時圖3-27500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-27500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-3擴(kuò)增曲線對數(shù)圖譜

線性圖譜qPCR

的擴(kuò)增曲線有兩種視圖方式：線性圖譜和對數(shù)圖譜。圖3-3擴(kuò)增曲線對數(shù)圖譜1．基線的定義（見圖3-4）是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線。圖3-4基線對數(shù)圖譜

線性圖譜1．基線的定義（見圖3-4）圖3-4基線對數(shù)圖譜2．熒光域值（threshold）的設(shè)定（見圖3-5）一般將PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，熒光閾值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。對數(shù)圖譜

線性圖譜圖3-5閾值2．熒光域值（threshold）的設(shè)定（見圖3-5）對數(shù)圖3．Ct值的定義（見圖3-6）在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。圖3-6Ct值的定義3．Ct值的定義（見圖3-6）圖3-6Ct值的定義4．Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值（見圖3-7）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖3-7如何使用Ct值計算結(jié)果4．Ct值與起始模板的關(guān)系圖3-7如何使用Ct值計算結(jié)果5．熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。不同的儀器可選用的熒光標(biāo)記組合不一（見圖3-8）。圖3-87500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)可使用的熒光標(biāo)記5．熒光化學(xué)圖3-87500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)可使1）TaqMan熒光探針（見圖3-9）：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5′→3′核酸外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。1）TaqMan熒光探針（見圖3-9）：PCR擴(kuò)增時在加入一圖3-9TaqMan熒光探針圖3-9TaqMan熒光探針2）SYBR熒光染料（見圖3-10）：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。圖3-10SYBR熒光染料2）SYBR熒光染料（見圖3-10）：在PCR反應(yīng)體系中，加本實驗將以TaKaRa公司提供的TBGreen?FastqPCRMix試劑盒（CodeNo.RR430B）為例進(jìn)行介紹。本實驗將以TaKaRa公司提供的TBGreen?Fast●使用注意以下為使用本試劑盒時的注意事項，使用前一定認(rèn)真閱讀。1.使用前，請上下輕輕顛倒混勻，避免產(chǎn)生氣泡，試劑混勻后再使用。試劑混合不均勻會造成反應(yīng)效果不佳。(1)請勿渦旋振蕩混勻。(2)TBGreenFastqPCRMix(2×)在-20℃保存時，可能會產(chǎn)生白色或淡黃色的沉淀?？捎檬治站徛芙猓蛴谑覝囟虝r間避光放置后，上下顛倒混勻直至沉淀全部消失。(3)沉淀會導(dǎo)致試劑組份不均勻，必須混勻后再使用。2.配制反應(yīng)液時，試劑請于冰上放置。3.本制品中含有熒光染料TBGreen，配制PCR反應(yīng)液時應(yīng)避免強(qiáng)光照射。4.反應(yīng)液的配制、分裝請一定使用新的一次性槍頭、盡量避免樣品間的污染?！袷褂米⒁馊?、實驗操作1.建立Real-timePCR反應(yīng)體系：于冰上溶解TBGreen?FastqPCRMix，cDNA模板，引物（LCN2和β-actin）和RNase-freedH2O，混勻。依次在8聯(lián)管內(nèi)加入下列試劑（10μl反應(yīng)體系）：*2：ROXReferenceDyeII（50×）比ROXReferenceDye（50×）濃度低，使用AppliedBiosystems7500Real-TimePCR時，使用ROXReferenceDyeII（50×）。注：反應(yīng)體系可隨需要調(diào)整，反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，多個樣品同時操作時，可以先配制一個MasterMix，再分裝到各管。1.建立Real-timePCR反應(yīng)體系：于冰上溶解TB2.進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件第一步，預(yù)變性：95℃，30sec第二步，PCR反應(yīng)：95℃，5sec，60℃，34sec，40個循環(huán)。第三步，溶解曲線分析注：1.選擇所使用的熒光通道（FAM、ROX）;2.采用兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)出現(xiàn)模板濃度過低引起非特異性擴(kuò)增，引物Tm值較低導(dǎo)致的擴(kuò)增效率低下或擴(kuò)增曲線重現(xiàn)性不佳等現(xiàn)象時，可嘗試進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2.進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)注：1.選擇所使用3．將反應(yīng)體系（8聯(lián)管）置于熒光定量PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)條件（注意設(shè)置熒光收集），開始反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)是在7500型實時熒光定量PCR-LifeTech（appliedbiosystems）系統(tǒng)上進(jìn)行的。4．反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RealTimePCR的擴(kuò)增曲線（是否具有特征性的三個增長階段，見圖3-11）和融解曲線；通過分析溶解曲線來判斷反應(yīng)的特異性（見圖3-12），理想的溶解曲線是單峰型，如果出現(xiàn)兩個或兩個以上的峰，說明有引物二聚體或其它非特異擴(kuò)增的存在。3．將反應(yīng)體系（8聯(lián)管）置于熒光定量PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)的圖3-11

正常擴(kuò)增圖3-12單一PCR產(chǎn)物的熔解曲線圖3-11正常擴(kuò)增圖3-12單一PCR產(chǎn)物的熔解曲線5．實驗數(shù)據(jù)的處理：ComparativeDelta-deltaCt法

ComparativeDelta-deltaCt法是常用的一種相對定量方法，是基于熒光定量的數(shù)學(xué)計算模型的簡化形式，用于比較不同樣品之間的差別或變化比率。其最大特點是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。其缺點是，每次實驗都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，而并非真實擴(kuò)增情況的反映，這里勢必存在一定的誤差。注：在使用該法展開實驗前，必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，那么后續(xù)實驗中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，則需換用其它的相對定量方法。5．實驗數(shù)據(jù)的處理：ComparativeDelta-d數(shù)據(jù)分析步驟：1）同一樣品分別進(jìn)行看家基因和目的基因的擴(kuò)增2）在Excel軟件計算（2-△△Ct）：其中△Ct＝目的基因Ct值－看家基因Ct值；△△Ct值＝實驗樣品△Ct－對照樣品△Ct。最終結(jié)果以柱形圖進(jìn)行呈現(xiàn)（對照樣品數(shù)值為1，實驗樣品數(shù)值為2-△△Ct）。例：2-△△Ct=POWER(2,-△△Ct)數(shù)據(jù)分析步驟：例：2-△△Ct=POWER(2,-△四、預(yù)期結(jié)果

擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線1.到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。請嘗試用你學(xué)到的相關(guān)知識，設(shè)計一個可能的實驗方案。2.熒光定量PCR被廣泛用于H7N9人感染禽流感檢測，請談?wù)勥€有哪些常用的實驗技術(shù)手段可應(yīng)用于禽流感的檢測。課堂分組討論1.到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法實驗專題模塊五

RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)總RNA的提取反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR實驗專題模塊五

RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)總RNA的RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實驗所必需的，如cDNA合成、定量PCR、Northern雜交及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。RNA中rRNA的數(shù)量最多，占總量的80%～85%；tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%～20%；mRNA僅占1%～5%。從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā)，目前對RNA的分離與純化，主要集中在總RNA與mRNA上。RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對RNA進(jìn)在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響后續(xù)RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度相對較大。在實驗中，一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶；另一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染。在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全注意與要求：①RNA操作應(yīng)在專門的區(qū)域進(jìn)行，離心機(jī)、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。②操作過程中應(yīng)自始至終佩戴一次性橡膠或乳膠手套，以避免將手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。③實驗使用槍頭、離心管等塑料制品需均經(jīng)由0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡過夜，然后滅菌，烘干。所有玻璃制品都必須在180℃烘烤2小時。盡量避免與其它實驗共享器具，以防止交叉污染。④配制溶液用的酒精，異丙醇等應(yīng)使用RNA實驗專用的試劑。注意與要求：提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物，即可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測目的基因的表達(dá)。鑒于基因表達(dá)差異分析在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用，本模塊主要以食管癌細(xì)胞中目標(biāo)基因如LCN2(lipocalin2)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的定量檢測為例，旨在使學(xué)生能夠系統(tǒng)地理解RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR檢測過程，熟練使用有關(guān)儀器和軟件，掌握基本操作和分析過程，并學(xué)會運用相關(guān)的實驗技術(shù)與方法，利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源，獨立設(shè)計出相關(guān)解決方案，并能夠評價與實施這一方案。提取獲得的組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的m實驗一總RNA的提取一、實驗?zāi)康?.了解并掌握總RNA提取的基本原理。2.熟悉TRIzol法提取細(xì)胞總RNA的具體操作過程。實驗一總RNA的提取二、實驗原理總RNA的提取圍繞著一條主線，即保護(hù)RNA的完整性，使RNA免受RNase的酶解。圍繞這條主線，要關(guān)注RNase-Free工作環(huán)境的建立、反應(yīng)中RNase-Free條件的保持、RNA的保存等一系列細(xì)節(jié)問題。所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即1）樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；2）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；3）對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；4）有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；5）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。二、實驗原理總RNA的提取圍繞著一條主線，即TRIzol試劑提取總RNA該法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法，其產(chǎn)率與(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相當(dāng)。它是以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚而得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面，保留于上層水相的RNA在RNA沉淀溶液中通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌進(jìn)行制備。Trizol試劑可用于小量樣品（50~100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）。對人，動物，植物組織，細(xì)菌均適用，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。TRIzol試劑提取總RNA三、實驗操作1.樣品處理：a單層培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞滿度達(dá)90%以上或成融合狀態(tài)時，棄去培養(yǎng)基，用1ml槍頭將剩余培養(yǎng)基吸干，每個孔直接加入500μl的TRIzol試劑裂解細(xì)胞（每10cm2面積加1ml試劑）．將培養(yǎng)板放在三維迷你搖床上，室溫（15-30℃）下充分裂解，至少需5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。（注：加TRIzol之前勿需洗滌細(xì)胞。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有基因組DNA污染。）1.樣品處理：2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。3.4℃下，11000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。4.把水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.5ml異丙醇（1mlTRIzol的用量），充分混勻后，室溫放置10分鐘，以沉淀水相中的RNA。5.4℃下，11000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。棄去上清。6.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。4℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清，將離心管倒置在吸水紙上，讓殘留乙醇揮發(fā)，時間約為5分鐘。（注意不要完全晾干，否則會導(dǎo)致RNA的溶解性降低）2.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩7.加入10μlDEPC水，蓋緊蓋子，輕彈管底，使RNA沉淀充分溶解，冰上放置10分鐘。8.RNA含量測定：紫外分光光度法測量所提RNA的濃度與純度，并登記在實驗記錄本上。剩余RNA保存于-80?C冰箱中，備用。注：RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用DEPC水稀釋DNA樣品n倍并以DEPC水為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000（RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)和基因組DNA污染；比值太高，則提示RNA有降解）7.加入10μlDEPC水，蓋緊蓋子，輕彈管底，使RNA實驗二反轉(zhuǎn)錄一、實驗?zāi)康牧私獠⒄莆誧DNA合成的基本原理及其具體操作過程。實驗二反轉(zhuǎn)錄二、實驗原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶存在于一些RNA病毒中，可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。人類免疫缺陷病毒（HIV）也是一種RNA病毒，含有反轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶，推測可能與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。二、實驗原理反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中，人為大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性：由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、Oligo(dT)或基因特異性的引物起始。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種引物都可采用。①隨機(jī)引物適用于任何類型的RNA模板，但由于特異性低，主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。②Oligo(dT)只適用于具有PolyA尾巴的RNA，對無PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。由于PolyARNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。③基因特異性引物是根據(jù)模板序列設(shè)計的互補(bǔ)引物，特異性好，但僅適用于目的序列已知的情況。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、OligcDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物，無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無基因組DNA的污染。目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。本實驗將以TaKaRa公司提供的PrimeScriptRTreagentKit試劑盒（CodeNo.RR037A）為例進(jìn)行介紹。cDNA合成的模板可以是總RNA、mRNA或?qū)ｎ}模塊五RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)課件專題模塊五RNA的提取及定量PCR檢測技術(shù)課件三、實驗操作*1：OligodTPrimer和Random6mers同時使用，可有效將全長mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.*2：10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系可最大使用500ng的TotalRNA。1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制：按如下成分于冰上配制反應(yīng)混合液，為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項反應(yīng)時，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制MasterMix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中，最后加入RNA樣品。輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。*1：OligodTPrimer和Random6me2.反應(yīng)條件(注：上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第一步，37℃，15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）

第二步，85℃，5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）第三步，4℃注：1.將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中，其加入量不要超過PCR反應(yīng)體積的1/10（V/V）量。2.合成的cDNA需要長期保存時，請于-20℃或更低溫度保存。2.反應(yīng)條件(注：上述反轉(zhuǎn)錄過程可在PCR儀中操作完成)第實驗三實時熒光定量PCR一、實驗?zāi)康?.了解并掌握實時熒光定量PCR的基本原理2.熟悉使用有關(guān)儀器和軟件，掌握基本操作和分析過程，并學(xué)會運用相關(guān)的實驗技術(shù)與方法，利用網(wǎng)上的分子生物學(xué)信息資源，獨立設(shè)計出相關(guān)解決方案。實驗三實時熒光定量PCR二、實驗原理實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction，Real-TimePCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中cDNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。二、實驗原理實時熒光定量PCR技術(shù)（Real熒光定量檢測系統(tǒng)由實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量試劑，通用電腦，自動分析軟件等構(gòu)成。設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計算機(jī)組成（見圖3-2），用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?；幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)（見圖3-3）。如果同時擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。熒光定量檢測系統(tǒng)由實時熒光定量PCR儀，實時圖3-27500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-27500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)圖3-3擴(kuò)增曲線對數(shù)圖譜

線性圖譜qPCR

的擴(kuò)增曲線有兩種視圖方式：線性圖譜和對數(shù)圖譜。圖3-3擴(kuò)增曲線對數(shù)圖譜1．基線的定義（見圖3-4）是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線。圖3-4基線對數(shù)圖譜

線性圖譜1．基線的定義（見圖3-4）圖3-4基線對數(shù)圖譜2．熒光域值（threshold）的設(shè)定（見圖3-5）一般將PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，熒光閾值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。對數(shù)圖譜

線性圖譜圖3-5閾值2．熒光域值（threshold）的設(shè)定（見圖3-5）對數(shù)圖3．Ct值的定義（見圖3-6）在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。圖3-6Ct值的定義3．Ct值的定義（見圖3-6）圖3-6Ct值的定義4．Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值（見圖3-7）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖3-7如何使用Ct值計算結(jié)果4．Ct值與起始模板的關(guān)系圖3-7如何使用Ct值計算結(jié)果5．熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。不同的儀器可選用的熒光標(biāo)記組合不一（見圖3-8）。圖3-87500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)可使用的熒光標(biāo)記5．熒光化學(xué)圖3-87500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)可使1）TaqMan熒光探針（見圖3-9）：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5′→3′核酸外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。1）TaqMan熒光探針（見圖3-9）：PCR擴(kuò)增時在加入一圖3-9TaqMan熒光探針圖3-9TaqMan熒光探針2）SYBR熒光染料（見圖3-10）：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。圖3-10SYBR熒光染料2）SYBR熒光染料（見圖3-10）：在PCR反應(yīng)體系中，加本實驗將以TaKaRa公司提供的TBGreen?FastqPCRMix試劑盒（CodeNo.RR430B）為例進(jìn)行介紹。本實驗將以TaKaRa公司提供的TBGreen?Fast●使用注意以下為使用本試劑盒時的注意事項，使用前一定認(rèn)真閱讀。1.使用前，請上下輕輕顛倒混勻，避免產(chǎn)生氣泡，試劑混勻后再使用。試劑混合不均勻會造成反應(yīng)效果不佳。(1)請勿渦旋振蕩混勻。(2)TBGreenFastqPCRMix(2×)在-20℃保存時，可能會產(chǎn)生白色或淡黃色的沉淀?？捎檬治站徛芙猓蛴谑覝囟虝r間避光放置后，上下顛倒混勻直至沉淀全部消失。(3)沉淀會導(dǎo)致試劑組份不均勻，必須混勻后再使用。2.配制反應(yīng)液時，試劑請于冰上放置。3.本制品中含有熒光染料TBGreen，配制PCR反應(yīng)液時應(yīng)避免