多肽的化學(xué)合成

多肽的化學(xué)合成技術(shù)總覽從最簡單的病毒到人類，所有生物體內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都是由相同的20種氨基酸組成，這就構(gòu)成了千姿百態(tài)的蛋白質(zhì)世界。生物學(xué)家在對蛋白質(zhì)進行深入研究的過程中，發(fā)現(xiàn)一類由氨基酸構(gòu)成但又不同于蛋白質(zhì)的中間物質(zhì)，這類物質(zhì)被稱作多肽。多肽是比蛋白質(zhì)簡單，分子量小，由氨基酸通過肽鍵相連的一類化合物。多肽具有調(diào)節(jié)機體生理功能和為機體提供營養(yǎng)的雙重功效，它幾乎影響著人體的一切代謝合成。一種肽含有的氨基酸少于10個稱為寡肽，超過的就稱為多肽;氨基酸為50多個以上的多肽就是人們熟悉的蛋白質(zhì)。多肽合成的價值N-PGN-PC-N-PGgu部嗎OrfurthercN-PGN-PC-N-PGgu部嗎Orfurtherc日叩lingfCI在白廿層。也圖1.多肽合成。到現(xiàn)在，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種存在于人體的肽，對于多肽的研究和利用，出現(xiàn)了空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價值。通過多肽全合成可以:.驗證一個新的多肽的結(jié)構(gòu);.設(shè)計新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系;.為多肽生物合成反應(yīng)機制提供重要的信息;.建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。多肽的化學(xué)合成多肽的合成主要有兩種途徑：化學(xué)合成和生物合成?；瘜W(xué)合成主要通過氨基酸縮合反應(yīng)來實現(xiàn)。為得到具有特定順序的合成多肽，當(dāng)合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體時，應(yīng)將不需要反應(yīng)的基團暫時保護起來，然后再進行連接反應(yīng)，以保證合成的定向進行。一般要求，這些保護基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以完全定量的脫除。a-氨基保護基常用的氨基保護基可分為烷氧羰基、?；屯榛悺Ｆ渲型檠豸驶Ｗo基可防止消旋化，因此應(yīng)用廣泛。使用最普遍的是Z、Fmoc和Boc。Z基團可用鈀黑，5%?20%鈀炭催化氫化法脫除。Boc基團具有與Z基團不同的化學(xué)性質(zhì)，不能用催化氫化法脫除，但易于酸解脫除，它可以和Z基團搭配使用，有選擇性地脫除。Fmoc基團的特點是對酸穩(wěn)定，可被堿脫除。因此尤其適合于合成含有Trp、Met、Cys等對酸不穩(wěn)定的多肽。a-羧基保護基與氨基保護基相比，竣基保護基種類較少，一般以鹽或酯的形式存在。鹽是對竣基的臨時保護，常用的有鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽和三丁胺鹽等。常用的酯類有甲酯、乙酯、芐酯和叔丁酯。叔丁酯是近年來最常用的竣基保護基，可用酸在溫和條件下脫除。側(cè)鏈保護基為了避免副反應(yīng)的發(fā)生，某些氨基酸的側(cè)鏈官能團需采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo基加以保護。同一個側(cè)鏈有多種不同的保護基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義，而且側(cè)鏈保護基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系。安必奇生物科技有限公司消惶墾團日即謝1千M忍IR聚訐THA一OFmPiVDftFOSLJtDW如十工一TFahOdc.hCCji>i得基0B2IICFM.IHF.TFKGAZHiiPd041Fd<P113PH.IWOTHFAHPilgSP出叫琳訴*Md口ILKTH圖2.常見的氨基和竣基保護基。多肽的化學(xué)合成技術(shù)多肽的化學(xué)合成有液相合成和固相合成，其主要的區(qū)別在于是否使用固相載體。1多肽的液相合成多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略，逐步合成簡潔迅速，被用于各種生物活性多肽片段的合成；片段組合法為合成含有 100個以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線，并已成功地合成了多種有生物活性的多肽，其最大的特點是易于純制。液相合成現(xiàn)在主要采用Boc和Z兩種保護方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對于固相合成，具有保護基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點。但是與固相合成比較，液相合成主要缺點是，合成范圍小，一般都集中在10個氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對中間體進行提純，時間長，工作量大。2多肽的固相合成1963年，R.B.Merrifield將氨基酸的C末端固定在不溶樹脂上，然后再此樹脂上依次縮合氨基酸，延長肽鏈、合成多肽，從而創(chuàng)立了固相合成法。經(jīng)過不斷的改進和完善，固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點。

其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化竣基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合 -洗滌-去保護-中和及洗滌-下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。每步反應(yīng)后只需要簡單地洗滌樹脂，便可達到純化的目的，克服了經(jīng)典液相合成法中的每一步都需要純化的問題。固相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略： Boc和Fmoc兩種。Boc方法合成過程中，需要反復(fù)使用TFA脫BOC，而且在最后從樹脂上切割下來需要使用 HF，由于HF必須使用專門的儀器進行操作，而且切割過程中容易產(chǎn)生副反應(yīng)，因此現(xiàn)在使用受到實驗條件限制，使用也逐漸減少。Fmoc方法反應(yīng)條件溫和，在一般的實驗條件下就可以進行合成，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng)用。h2n-chc-CUC-OH95%TFAG]U-Trp1h2n-chc-CUC-OH95%TFAG]U-Trp1CIC/HOBt1.DIEA2.20%PlfrfDMF?1」rl-Ci-d-Oli加圖3.固相合成二肽Glu-Trp。2.1樹脂的選擇能夠用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求:A.必須包含反應(yīng)位點（或反應(yīng)基團），以使肽鏈在這些位點上，并在之后除去;須對合成過程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；C.載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；D.另外，載體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團，才能直接連上氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入的反應(yīng)基團的不同，這些樹脂可以分為氯甲基樹脂、竣基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。Boc合成法通常選擇氯甲基樹脂，F(xiàn)moc合成法通常選擇竣基樹脂如王氏樹脂。2-Cl-TrtM日HA2-Cl-TrtM日HAPAMRiiikArnidfi圖4.固相合成常用樹脂固相合成切割方法固相合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然后經(jīng)過冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過 HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時候，選擇的切割方法也不完全相同。一般都是選擇酸性條件下切割，對于 PAM，MBHA樹脂，一般采用HF切割，切割過程中需要添加對甲苯酚，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對于Wang，Rink-Amide，Trt樹脂，一般采用TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。

這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對部分氨基酸側(cè)鏈的進攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5)，TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5)，反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。游離氨基的檢測固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離的氨基來判斷連接的速率，檢測方法稱為Kaiser方法，判斷的標(biāo)準(zhǔn)是，如果還有游離氨基的時候，溶液或樹脂會顯示藍色或者紅褐色。Kaiser試劑包括:6%茚三酮的乙醇溶液80%苯酚的乙醇溶液2%0.001MKCN的吡啶溶液在配制過程中，吡啶需要經(jīng)茚三酮處理后重蒸再使用。檢測時，取少量樹脂，加入A,B,C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液或者樹脂出現(xiàn)藍色或紫褐色，表明還有游離的氨基，否則說明完全連接。其他檢測游離氨基的方法有：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，澳酚藍法。Nlriydrin*?Nlriydrin*?H即lid—圖5.茚三酮檢測示意圖發(fā)