聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)課件

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

(Separatingserumby

polyacrylamidegel

electrophoresis)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)課件1實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑、儀器實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)的原理。2.熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法和操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)的原理。3實(shí)驗(yàn)原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測(cè)定等。實(shí)驗(yàn)原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象4在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。+-實(shí)驗(yàn)原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、5聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。凝膠是聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的，催化劑為過(guò)硫酸銨，加速劑為T(mén)EMED。實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)6實(shí)驗(yàn)原理電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）分子篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）濃縮效應(yīng)凝膠的不連續(xù)性緩沖離子的不連續(xù)性pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性分離膠pH8.9濃縮膠pH6.7實(shí)驗(yàn)原理電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）凝膠的不連續(xù)性7

①

凝膠的不連續(xù)性：濃縮膠：大孔徑。樣品在其中濃縮，并按遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。分離膠：小孔徑。蛋白質(zhì)分子在大孔膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快，進(jìn)入小孔膠時(shí)遇到的阻力大，遷移速度減慢。由于凝膠的不連續(xù)性，在大孔膠和小孔膠界面處就會(huì)使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。濃縮效應(yīng)①凝膠的不連續(xù)性：濃縮效應(yīng)8

②緩沖離子的不連續(xù)性③pH的不連續(xù)性④電位梯度的不連續(xù)性制膠緩沖液：Tris-HCl

濃縮膠：pH6.7分離膠：pH8.9電泳緩沖液：Tris-甘氨酸在濃縮膠中，pH環(huán)境呈弱酸性，甘氨酸解離少，在電場(chǎng)作用下泳動(dòng)效率低，而Cl—卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子介于二者之間泳動(dòng)。濃縮效應(yīng)②緩沖離子的不連續(xù)性濃縮效應(yīng)9

由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。樣品進(jìn)入分離膠（pH8.9）后，由于膠中pH的增加，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨Cl-之后，樣品不再受離子界面的影響。濃縮效應(yīng)由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶形成了較高的電壓梯10實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1．垂直板電泳糟2．直流穩(wěn)壓電源3．微量注射器4．電泳儀實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1．垂直板電泳糟11實(shí)驗(yàn)流程

制板制備分離膠制備濃縮膠加樣電泳及結(jié)果檢測(cè)染色和脫色實(shí)制板制備分離膠制備濃縮膠加樣電泳及結(jié)果檢測(cè)染色和脫色12實(shí)驗(yàn)步驟1、安裝夾心式垂直板電泳槽：主要注意：安裝前，膠條、玻璃板都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2、制備凝膠板（1）分離膠制備（10%分離膠，20ml/電泳槽）（2）濃縮膠的制備（5%濃縮膠，10ml/電泳槽）實(shí)驗(yàn)步驟1、安裝夾心式垂直板電泳槽：13

凝膠配方

濃縮膠5%分離膠10%

丙烯酰胺儲(chǔ)存液ml1.5

8.4

濃縮膠緩沖液3.75——分離膠緩沖液——

12.5

雙蒸水——

0.75

2.5%過(guò)硫酸銨0.40.5TEMED1.01.5凝膠配方143.配置血清樣品及加樣將樣品梳拔出，用電極級(jí)沖液沖洗樣品孔。樣品與樣品緩沖液按一定比例混合好（蛋白含量大約為1-2μg/μl）。用微量注射器加入加樣孔，加樣量為5-10μl。3.配置血清樣品及加樣將樣品梳拔出，用電極級(jí)沖液沖洗樣品孔。154.電泳及染色、脫色電泳：連接直流穩(wěn)壓電源，矮板連負(fù)極，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。調(diào)節(jié)電流，進(jìn)入分離膠之前為100v，進(jìn)入分離膠之后為120v。染色:

關(guān)閉電源，取下凝膠模。在脫色搖床上用考馬斯亮蘭染色1h。脫色：將膠取出，蒸餾水沖洗數(shù)次后，放入脫色液中，數(shù)小時(shí)換液一次，直至背景清晰為止。4.電泳及染色、脫色電泳：連接直流穩(wěn)壓電源，矮板16實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果17注意事項(xiàng)勿用手碰凝膠勿使膠液產(chǎn)生氣泡凝膠聚合后勿倒入水池電極緩沖液回收注意事項(xiàng)勿用手碰凝膠18聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

(Separatingserumby

polyacrylamidegel

electrophoresis)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)課件19實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑、儀器實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?0實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)的原理。2.熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法和操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)的原理。21實(shí)驗(yàn)原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測(cè)定等。實(shí)驗(yàn)原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象22在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。+-實(shí)驗(yàn)原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、23聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。凝膠是聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的，催化劑為過(guò)硫酸銨，加速劑為T(mén)EMED。實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)24實(shí)驗(yàn)原理電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）分子篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）濃縮效應(yīng)凝膠的不連續(xù)性緩沖離子的不連續(xù)性pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性分離膠pH8.9濃縮膠pH6.7實(shí)驗(yàn)原理電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）凝膠的不連續(xù)性25

①

凝膠的不連續(xù)性：濃縮膠：大孔徑。樣品在其中濃縮，并按遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。分離膠：小孔徑。蛋白質(zhì)分子在大孔膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快，進(jìn)入小孔膠時(shí)遇到的阻力大，遷移速度減慢。由于凝膠的不連續(xù)性，在大孔膠和小孔膠界面處就會(huì)使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。濃縮效應(yīng)①凝膠的不連續(xù)性：濃縮效應(yīng)26

②緩沖離子的不連續(xù)性③pH的不連續(xù)性④電位梯度的不連續(xù)性制膠緩沖液：Tris-HCl

濃縮膠：pH6.7分離膠：pH8.9電泳緩沖液：Tris-甘氨酸在濃縮膠中，pH環(huán)境呈弱酸性，甘氨酸解離少，在電場(chǎng)作用下泳動(dòng)效率低，而Cl—卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子介于二者之間泳動(dòng)。濃縮效應(yīng)②緩沖離子的不連續(xù)性濃縮效應(yīng)27

由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。樣品進(jìn)入分離膠（pH8.9）后，由于膠中pH的增加，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨Cl-之后，樣品不再受離子界面的影響。濃縮效應(yīng)由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶形成了較高的電壓梯28實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1．垂直板電泳糟2．直流穩(wěn)壓電源3．微量注射器4．電泳儀實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1．垂直板電泳糟29實(shí)驗(yàn)流程

制板制備分離膠制備濃縮膠加樣電泳及結(jié)果檢測(cè)染色和脫色實(shí)制板制備分離膠制備濃縮膠加樣電泳及結(jié)果檢測(cè)染色和脫色30實(shí)驗(yàn)步驟1、安裝夾心式垂直板電泳槽：主要注意：安裝前，膠條、玻璃板都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2、制備凝膠板（1）分離膠制備（10%分離膠，20ml/電泳槽）（2）濃縮膠的制備（5%濃縮膠，10ml/電泳槽）實(shí)驗(yàn)步驟1、安裝夾心式垂直板電泳槽：31

凝膠配方

濃縮膠5%分離膠10%

丙烯酰胺儲(chǔ)存液ml1.5

8.4

濃縮膠緩沖液3.75——分離膠緩沖液——

12.5

雙蒸水——

0.75

2.5%過(guò)硫酸銨0.40.5TEMED1.01.5凝膠配方323.配置血清樣品及加樣將樣品梳拔出，用電極級(jí)沖液沖洗樣品孔。樣品與樣品緩沖液按一定比例混合好（蛋白含量大約為1-2μg/μl）。用微量注射器加入加樣孔，加樣量為5-10μl。3.配置血清樣品及加樣將樣品梳拔出，用電極級(jí)沖液沖洗樣品孔。334.電泳及染色