細菌內(nèi)毒素檢測方法介紹課件

細菌內(nèi)毒素檢測方法介紹上海市獸藥飼料監(jiān)察所劉雅妮2006年11月內(nèi)容基本概念實驗方法操作注意事項一、概念及相關(guān)知識熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何可以導(dǎo)致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。機理：外源性熱原質(zhì)通過內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)節(jié)中心發(fā)熱新蛋白合成新mRNA翻譯細胞壁結(jié)構(gòu)：肽聚糖脂蛋白革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌外膜磷壁酸脂多糖細菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當細胞壁外膜結(jié)構(gòu)完整時不具備生物活性，只有當細菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原＋核心多糖＋類脂A致熱活性部分內(nèi)毒素的量值：1、內(nèi)毒素單位（EU）1982年FDA將當時美國代號為EC－2的內(nèi)毒素標準品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國際單位（IU）WHO先后兩次組織協(xié)作標定，建立內(nèi)毒素國際標準品，其中第二批內(nèi)毒素國際標準品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU＝1EU。鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經(jīng)裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，能與極微量的細菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。細菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法濁度法光度法顯色基質(zhì)法重現(xiàn)性好能定量能控制藥物的增強/抑制干擾操作簡便。節(jié)省時間方法分類方法特點實驗材料及用具1、儀器名稱要求天平感量0.1mg以下電熱干燥箱～300℃恒溫水浴箱37±1℃水銀或酒精溫度計～100℃±1℃漩渦混合器/計時器60min±1min2、器具器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑10×75mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆靈敏度復(fù)核試驗：每批鱟試劑用于檢測前都必須進行靈敏度復(fù)核。試驗舉例：內(nèi)毒素工作標準品為100EU/支；待測鱟試劑靈敏度λ＝0.25EU/ml。1、制備內(nèi)毒素標準溶液：取工作標準品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75％酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進行稀釋，步驟如下(箭頭下方為加入BET水量)：100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.8ml0.2ml1.8ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.2ml0.2ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml水水溶解后的標準品水水水水100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標示量加入BET水溶解，再取0.1ml分裝于標準玻璃試管（10mm×75mm），將試管按如下形狀排列。3、加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標準品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。12λ2λ30.5λ40.25λBET水2λ2λ2λ2λλλλλ0.5λ0.5λ0.5λ0.5λ0.25λ0.25λ0.25λ0.25λ反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動混勻，置37℃水浴中保溫60±2min，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180°，凝膠不變形為“＋”，凝膠不能保持完整為“－”。當2.0λ四支管都為陽性，0.25λ四支管都為陰性時，試驗成立，按下面底公式計算復(fù)核的靈敏度λc：

λc＝lg-1(∑X/4)（X:反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值。）

當0.5λ≤λc≤2.0λ時，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測時仍以標示靈敏度λ為準。舉例：設(shè)待復(fù)核的鱟試劑標示靈敏度λ為0.125EU/ml:平行管數(shù)內(nèi)毒素標準溶液濃度（EU/ml）NC反應(yīng)終點濃度CX(lgC)0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--/0.125-0.9034++--/0.125-0.903λc＝lg-1(∑X/4)＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（-1.22

）＋（-1.22

）］/4｝＝0.104（EU/ml）

λc在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定。2、供試品溶液稀釋：將供試品稀釋，稀釋倍數(shù)為MVD。含2λ內(nèi)毒素標準品的供試品溶液（PPC）的制備：3、加樣：取鱟試劑8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支為樣品管，加入樣品液0.1ml；2支加入陰性對照管，加入BET水0.1ml；2支為陽性對照管，加入22λ濃度的內(nèi)毒素標準品溶液0.1ml；2支為樣品陽性管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標準品的樣品溶液。

37±1℃水浴中保溫60±1min。稀釋0.5MVD倍的供試品1.0ml4λ濃度的內(nèi)毒素標準品溶液1.0ml＋混合含2λ內(nèi)毒素的供試品溶液示意圖：結(jié)果判斷：

陽性對照為陽性陰性對照為陰性試驗結(jié)果成立樣品陽性對照為陽性2支樣品管均為陰性時，樣品符合規(guī)定；2支樣品管均為陽性時，樣品不符合規(guī)定；樣品管1支為陽性1支為陰性時，需復(fù)試。復(fù)試時做4支樣品管，有1支為陽性則樣品不符合規(guī)定。樣品陽性陰性樣品陽性供試品溶液制備：含2λ內(nèi)毒素標準品的供試品溶液的制備：取500U/ml的樣品溶液1.0ml＋0.5EU/ml的內(nèi)毒素標準品溶液混合。供試品4000U/ml1000U/ml500U/ml250U/ml0.4ml3.6ml1.0ml3.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml稀釋10倍稀釋40倍稀釋80倍稀釋160倍用量多結(jié)果判斷：結(jié)果判斷樣品管陰性對照陽性對照樣品陽性對照符合規(guī)定－－－－＋＋＋＋不符合規(guī)定＋＋－－＋＋＋＋需復(fù)試＋－－－＋＋＋＋符合規(guī)定－－－－－－＋＋＋＋不符合規(guī)定＋－－－－－＋＋＋＋實驗環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。實驗人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。實驗過程：1、內(nèi)毒素工作標準品應(yīng)嚴格按要求低溫保存；