體內(nèi)藥物方法

體內(nèi)藥物分析Biopharmaceuticalanalysis第一章體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對(duì)人和動(dòng)物血液、尿和組織等樣品進(jìn)行定性定量的分析廣義：通過(guò)體內(nèi)藥物濃度的分析，了解藥物在體內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為藥品的生產(chǎn)、臨床應(yīng)用作出評(píng)價(jià)二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)中的意義1．全面質(zhì)量控制2．新藥報(bào)批3．為設(shè)計(jì)新藥提供信息①?gòu)拇x產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)新藥保泰松→羥基保泰松（作用強(qiáng)、副作用?。┓悄俏鞫　鷵錈嵯⑼储谇八幵O(shè)計(jì)③新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等以上內(nèi)容必須通過(guò)測(cè)定體內(nèi)藥物濃度得以解決（二）臨床合理用藥中的意義

1．血藥濃度與藥理作用2.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素a．生理因素年齡、性別、生理狀況b．病理因素c．遺傳因素（2）藥物因素a．劑型因素（生物利用度問(wèn)題）b．藥物合并使用（酶抑、酶促）c．時(shí)間因素（三）藥物中毒解救的意義（四）興奮劑檢測(cè)的意義三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象3．從樣品的來(lái)源分1．從分析物分母體藥物代謝物內(nèi)源性物質(zhì)2．從生物樣品種類分均勻樣品非均勻樣品人體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四、體內(nèi)藥物分析的任務(wù)（一）方法學(xué)的研究（二）治療藥物監(jiān)測(cè)TDM，therapeuticalDrugMonitoring1．定義2．哪些藥物需進(jìn)行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測(cè)①有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無(wú)療效②劑量小，毒性大的藥物③個(gè)體差異大，劑量難以控制④藥物毒性反應(yīng)與疾病癥狀相似⑤多種藥物合并應(yīng)用，有中毒危險(xiǎn)⑥胃腸道、肝臟、腎臟疾病⑦呈非線性動(dòng)力學(xué)的藥物⑧判斷患者用藥的依從性（三）藥代動(dòng)力學(xué)的研究（四）代謝分型的應(yīng)用（五）內(nèi)源性物質(zhì)測(cè)定

五、體體內(nèi)藥藥物分分析的的特點(diǎn)點(diǎn)1．干干擾雜雜質(zhì)多多2．樣樣品濃濃度低低3．取取樣量量少4．工工作量量大5．時(shí)時(shí)間短短6．有有一定定設(shè)備備六、體體內(nèi)藥藥物分分析的的發(fā)展展1．國(guó)國(guó)外發(fā)發(fā)展概概況60年年代初初發(fā)發(fā)現(xiàn)藥藥效與與血藥藥濃度度關(guān)系系70年年代體體內(nèi)內(nèi)藥物物分析析方法法建立立80年年代~至今今發(fā)發(fā)展迅迅猛，，新儀儀器不不斷涌涌現(xiàn)書(shū)籍出出版《DrugLevelMonitoring》》1980《TherapeuticalDrugMonitoring》》1981《TextbookofBiopharmaceuticAnalysis》19812．國(guó)國(guó)內(nèi)情情況80年年代初初，藥藥物分分析工工作者者倡導(dǎo)導(dǎo)，1980年年版《《藥物物分析析》教教材中中納入入部分分內(nèi)容容，第第二、、三版版增加加體內(nèi)內(nèi)藥物物分析析一章章。80年代開(kāi)始在醫(yī)院進(jìn)行臨床藥學(xué)工作，主要測(cè)定藥物濃度。有關(guān)書(shū)籍吳如金《體體內(nèi)藥物分分析》人人衛(wèi)版1984陸明廉《血血藥濃度測(cè)測(cè)定與臨床床應(yīng)用》上上?？萍?986陳剛《治療療藥物監(jiān)測(cè)測(cè)理論與實(shí)實(shí)踐》人民民軍醫(yī)1988吳萊文《治治療藥物監(jiān)監(jiān)測(cè)》人人衛(wèi)版1989曾經(jīng)澤《生生物藥物分分析》北北京大學(xué)出出版社1998姚彤煒《體體內(nèi)藥物分分析》浙浙大2001張君仁《體體內(nèi)藥物分分析》化化學(xué)學(xué)工業(yè)出版版社 20023．學(xué)科前前沿游離藥物濃濃度測(cè)定直接進(jìn)樣方方法研究代謝物測(cè)定定對(duì)映體分析析第二章體體內(nèi)藥物物存在的狀狀態(tài)與體體內(nèi)藥物物分析的關(guān)關(guān)系一、藥物的的體內(nèi)變化化吸收→分布布→代謝→→排泄ADME過(guò)程發(fā)生兩種變化化物理變化可可逆變變化化學(xué)變化結(jié)結(jié)構(gòu)和數(shù)數(shù)量發(fā)生變化化二、藥物與血血漿蛋白的結(jié)結(jié)合1．游離型藥藥物與結(jié)合型型藥物（非特特異性的結(jié)合合）①在血漿、組組織中均存在在游離型和結(jié)結(jié)合型的藥物物②尿液中含微微量P，血漿漿中含大量P，唾液中P為血漿1/10③與藥物結(jié)結(jié)合的蛋白白主要有白蛋蛋白，a1-酸性糖蛋白白、脂蛋白弱酸性藥物主主要與白蛋白白結(jié)合弱堿性藥物與與白蛋白、a1-酸性糖蛋白白結(jié)合④藥物與蛋白白質(zhì)的結(jié)合通通過(guò)共價(jià)鍵（（氫鍵，離子子間靜電力等等）2．血漿蛋白白結(jié)合率Df+PDbK=解解離常數(shù)血漿蛋白結(jié)合合率：Β==[P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np結(jié)合力強(qiáng)的藥藥物可以置換換結(jié)合力弱的的藥物，通過(guò)過(guò)競(jìng)爭(zhēng)蛋白是是藥物相互作作用類型之一一。由此可見(jiàn)，K、np是影影響β的重要要因素np↓ββ↓K↓ββ↑藥物在足夠高高濃度時(shí)使結(jié)結(jié)合部位飽和和，濃度再增增高，多余的的藥物均呈游游離狀態(tài)，結(jié)結(jié)合部分比率率降低，藥物物血漿蛋白結(jié)結(jié)合率是藥代代動(dòng)力學(xué)的重重要參數(shù)之一一。3．血漿蛋白白結(jié)合的測(cè)定定平衡透析法、、超濾法、凝凝膠過(guò)濾法、、光譜法等。。（1）平衡透透析法①原理②計(jì)算β=××100%=Ct-C袋內(nèi)-袋外袋內(nèi)藥物③注意事項(xiàng)a.蛋白質(zhì)質(zhì)溶液新新鮮血漿pH7.4，，至少三個(gè)濃濃度測(cè)定b.緩沖液液0.13mol/L磷酸鹽緩沖沖液，因?yàn)镹a3PO4抑制酸性性藥物與蛋白白質(zhì)結(jié)合c.溫度與與平衡時(shí)間37℃16~48h注意防防腐劑加入，，藥物的分解解d.透析袋袋滲漏檢測(cè)3%三氯氯醋酸e.攪拌保保持動(dòng)態(tài)態(tài)平衡④影響因素a.藥藥物物膜上上吸附附b.Donnan效應(yīng)應(yīng)由于電電荷的的影響響，可可造成成平衡衡時(shí)半半透膜膜兩側(cè)側(cè)游離離藥濃濃不同同，donnan效效應(yīng)，，加入入中性性鹽可可消除除。c.空空白白值增增加d.緩緩沖沖液體體積變變化，，水分分進(jìn)入入血漿漿游游離藥藥濃↑此法用于測(cè)定藥物時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)，一般少采用（2））超濾濾法原理計(jì)算注意事事項(xiàng)a．裝裝置50μμl→→5ml，，選擇擇不同同型號(hào)號(hào)超濾濾膜，，保濕濕。b．速速度與與時(shí)間間3000~10000r/min5~15minc．溫溫度37℃℃，25℃℃，4℃影響因因素a．膜膜吸附附b．超超濾液液的體體積超超濾液液/總總體積積≈0.3~0.6c．超超濾膜膜溫度度三、藥藥物與與血漿漿蛋白白結(jié)合合對(duì)體體內(nèi)藥藥物分分析的的影響響1．血血漿不不同對(duì)對(duì)體內(nèi)內(nèi)藥物物分析析的影影響2．平平衡狀狀態(tài)不不同對(duì)對(duì)體內(nèi)內(nèi)藥物物分析析的影影響3．平平衡狀狀態(tài)受受破壞壞對(duì)體體內(nèi)藥藥物分分析的的影響響4．游游離與與結(jié)合合同時(shí)時(shí)出現(xiàn)現(xiàn)時(shí)對(duì)對(duì)體內(nèi)內(nèi)藥物物分析析的影影響四、藥藥物代代謝1．研研究藥藥物代代謝的的意義義了解藥藥物在在體內(nèi)內(nèi)的命命運(yùn)及及相互互作用用，保保證臨臨床用用藥安安全有效效研究究藥藥物物代代謝謝途途徑徑、、藥藥物物結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)與與藥藥理理作作用用關(guān)關(guān)系系，，尋尋找找新新藥研究究藥藥物物相相互互作作用用機(jī)機(jī)制制有利利于于建建立立體體內(nèi)內(nèi)藥藥物物分分析析新新方方法法，，避避免免代代謝謝物物干干擾擾2．．藥藥物物代代謝謝的的途途徑徑第一一相相反反應(yīng)應(yīng)：：在在酶酶作作用用下下發(fā)發(fā)生生的的氧氧化化、、還還原原、、水水解解，，使使極極性性增增加加，，水水溶溶性性增增強(qiáng)強(qiáng)第二二相相反反應(yīng)應(yīng)：：藥藥物物或或經(jīng)經(jīng)一一相相反反應(yīng)應(yīng)后后的的代代謝謝物物與與葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸、、硫硫酸酸鹽鹽結(jié)氧化化反反應(yīng)應(yīng)還原原反反應(yīng)應(yīng)水解解反反應(yīng)應(yīng)結(jié)合合反反應(yīng)應(yīng)a．．葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸結(jié)結(jié)合合b．．硫硫酸酸酯酯化化c．．谷谷胱胱甘甘肽肽綴綴合合d．．乙乙酰?；Y(jié)結(jié)合合e．．氨氨基基酸酸結(jié)結(jié)合合五、藥物物代謝與與體內(nèi)藥藥物分析析的關(guān)系系1．樣品品的保存存樣品可能能會(huì)分解解，如血血漿酯酶酶可使酯酯類藥物物水解，，酶類可可使藥物物繼續(xù)代代謝，加加入酶抑抑制劑和和冷藏保保存。2．分析析方法選選擇光光譜法色色譜譜法免免疫法法3．樣品品的提取取、分離離法代謝物極極性大、、水溶性性強(qiáng)，pH緩沖沖系統(tǒng)分分開(kāi)尿液中藥藥物多以以結(jié)合型型存在，，要進(jìn)行行水解（（酸水解解、酶水水解，溶溶劑解））第三章生生物物樣品的的預(yù)處理理一、生物物樣品的的采集與與貯藏體內(nèi)藥物物分析常常用的分分析品種種有血液液、尿液液、唾液液，也可可用乳汁汁、淚液液、腦脊脊液、膽膽汁等。。（一）樣樣品的采采集1．血樣樣血樣濃度度與作用用點(diǎn)的濃濃度密切切相關(guān)，，可以反反映靶器器官的濃濃度。血細(xì)胞血漿（plasma））血小板血清（serum）血細(xì)胞測(cè)定血樣樣中平均均分布于于細(xì)胞內(nèi)內(nèi)和細(xì)胞胞外的藥藥濃抗凝自然全血血液2．尿樣樣目的：藥藥物劑量量回收，，藥物清清除，藥藥物代謝謝和生物物利用度度特點(diǎn)：濃濃度高，，易于收收集，體體內(nèi)代謝謝研究，，應(yīng)水解解分離離3．唾液液唾液中藥藥濃與血血濃相關(guān)關(guān)性收集方法法離離心收收集（二）樣樣品的貯貯藏1．血樣樣（血漿漿、血清清）及時(shí)時(shí)分離→→冷藏，，-70℃℃加入穩(wěn)穩(wěn)定劑劑NaF2．尿尿樣①尿中中水、、無(wú)機(jī)機(jī)鹽、、尿素素等細(xì)細(xì)菌的的生長(zhǎng)長(zhǎng)，4℃℃保存存②加入入防腐腐劑a．1%甲甲苯b．．飽和和氯仿仿c．．pH改變變3．唾唾液：：同血血樣二、生生物樣樣品的的預(yù)處處理（一））預(yù)處處理的的目的的①存在在形式式的多多樣性性游游離離結(jié)結(jié)合合代代謝謝物②濃度度低，，雜質(zhì)質(zhì)多（（分離離濃縮縮）③出現(xiàn)現(xiàn)渾濁濁和沉沉淀④與試試劑起起反應(yīng)應(yīng)⑤影響響色譜譜柱壽壽命（二））處理理方法法選擇擇的一一般原原則1．藥藥物理理化性性質(zhì)pKa親親脂脂性揮揮發(fā)性性溶溶解解度光光譜特特征穩(wěn)穩(wěn)定定性2．濃濃度范范圍靈靈敏的的方3．測(cè)定的目的定性定量母體代謝4．生物樣品的種類5．樣品處理與分析方法的選擇①專一性②靈敏性（三）生物物樣品去蛋蛋白處理1．加入與與水能混溶溶的有機(jī)溶甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀劑三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白質(zhì)分子的陽(yáng)離子形成不溶性鹽而↓，pH低于等電點(diǎn)3．組織酶酶消化法加入酶使蛋蛋白質(zhì)水解解優(yōu)點(diǎn)：①平平衡條件下下進(jìn)行，可可避免反應(yīng)應(yīng)和降解②可改善對(duì)對(duì)蛋白結(jié)合合率強(qiáng)的藥藥物的回收收率③不產(chǎn)生乳乳化4．其他加加熱超超濾（四）生物物樣品綴合合物水解1．酸水解解2．酶水解解β-葡萄糖糖醛酸苷酶酶芳基基硫酸酯酶酶混合合酶pH4.5-7.037℃3．溶劑解解某些藥物的的硫酸酯，，往往加入入率取溶劑劑時(shí)發(fā)生分分解，同時(shí)時(shí)提取有機(jī)機(jī)溶劑中（五）生物物樣品的萃萃取1．液-液液萃?。?）優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：①與雜雜質(zhì)分離②②簡(jiǎn)便③濃集④④提提取率高（2）提取取率：在有有機(jī)相與水水相中的溶溶解度的比比值分配系系數(shù)，一般般少量多次次，對(duì)生物物樣品一般般一次萃取取，>70%重重現(xiàn)性（3）影響響提取率的的因素①pH堿堿性藥物在在堿性pH酸性酸酸性pH②提取溶劑劑相似似相溶原理理沸點(diǎn)低低，不影響響檢測(cè),性性質(zhì)穩(wěn)定，，不起化學(xué)學(xué)反應(yīng)③離子強(qiáng)度度加入入中性鹽增增加離離子強(qiáng)度，，與水結(jié)合合強(qiáng)，便于于有機(jī)溶劑劑提?。?）離子子對(duì)提取對(duì)于離子性性特強(qiáng)，水水溶性極大大的藥物，，可采用離離子對(duì)提取?、僭恝趹?yīng)用陰離子：COOH+SO3H-反離子四四丁基銨銨陽(yáng)離子：NH2+反離子烷基基或芳基磺磺酸鹽（5）提取取技術(shù)一般在試管管中進(jìn)行有有機(jī)相與與水相比1:1或2:1（6）乳化化問(wèn)題措施①輕緩振搖搖②含有分散散度大或不不溶物應(yīng)過(guò)過(guò)濾掉③避免在高高pH條件件下，從水水中提取藥藥物④避免使用用易發(fā)生乳乳化的溶劑劑⑤萃取劑水中中加入少量NaCl破孔方法①機(jī)械法②加入少量高高級(jí)脂肪醇改改變變表面張力③改善混合溶溶劑比例，增增加分散相分分?jǐn)?shù)（7）藥物的的吸附①玻璃容器吸吸附1%三甲一氯硅硅烷10%二甲二氯氯硅烷②血漿2．液固萃取取固相萃取[solidphaseextractionSPE]針管式抽抽空減壓加加壓過(guò)濾濾（1）固相萃萃取步驟①固相選擇樣樣品1ml1ml規(guī)格固相相1~25ml3ml規(guī)格固相相②固相處理反相C18固定相的6~10倍體積積甲醇洗柱，，使溶劑化6~10倍水水緩沖服液沖沖洗達(dá)分離狀狀態(tài)③上樣④分離用用適當(dāng)?shù)娜跞苋軇┫礈煜聪慈ルs質(zhì)，，通N2干燥固相⑤洗脫待測(cè)物物改變pH或極性（2）影響固固相萃取的因因素（1）流速流流速快，，按觸不充分分，樣品流失失回收率率低柱處理5~10ml·min-1洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml··min-1（>300mg）（2）裝樣過(guò)過(guò)載突突破性試驗(yàn)驗(yàn)已知濃度樣品品液①小體積上上柱→洗脫回回收百分率②加大體積→→洗脫回收百百分率③繪圖當(dāng)當(dāng)回收率下降降時(shí)為過(guò)載（六）生物樣樣品的組分濃濃集（七）衍生生化處理GC衍生化HPLC衍生生化第四章體體內(nèi)藥物分析析方法的建立立與評(píng)價(jià)一、分析方法法靈敏度專屬性光譜法++剛開(kāi)始應(yīng)用較多雙波長(zhǎng)，導(dǎo)數(shù)色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性根據(jù)藥物理化化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)構(gòu)特征，藥物物濃度，干擾擾成分大小，，實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、分析方法法的設(shè)計(jì)依據(jù)據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)進(jìn)→創(chuàng)新創(chuàng)立方法1．做好文獻(xiàn)總總結(jié)2．充分了解藥藥物特征及體體內(nèi)狀況pH、親脂性、溶溶解度、極性性、光譜特征征、藥動(dòng)學(xué)參參數(shù)、體內(nèi)代代謝情況3．明確測(cè)定目目的、要求目的4．結(jié)合實(shí)驗(yàn)室室條件設(shè)備條件預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)研研究母體藥物和代代謝物三、分析方法法的建立1．純品進(jìn)行測(cè)測(cè)定確定線性范圍圍、靈敏度、、反應(yīng)條件（（pH、t、T）2．空白樣品測(cè)測(cè)定確定空白樣品品是否有干擾擾3．以水代替空空白樣品，加加標(biāo)準(zhǔn)液后測(cè)測(cè)定了解提取率、、檢測(cè)濃度確定萃取條件件、pH、揮發(fā)濃縮等4．空白樣品加加入標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立立回歸方程回收率5．實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)測(cè)定四、分析方法法的評(píng)價(jià)可行性和可靠靠性1．準(zhǔn)確度accuracy測(cè)定結(jié)果與真真實(shí)性的差異異用回收率表示示①接近100%②相對(duì)恒定①絕對(duì)回收率率也稱萃取回收收率、提取回回收率測(cè)定血漿樣品品中藥物濃度度/相同濃度的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液=絕對(duì)回收率考慮3個(gè)濃度（高、、中、低）分布在標(biāo)準(zhǔn)曲曲線成上、中中、下一般要求絕對(duì)對(duì)回收率在≥≥70%一般方法HPLC內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法時(shí)注意意：藥物與內(nèi)內(nèi)標(biāo)用各自外外標(biāo)法測(cè)定回回收率應(yīng)相近近，差值<10%②相對(duì)回收率率方法回收率藥物系列濃度度+血樣→標(biāo)準(zhǔn)曲曲線取高高、、中中、、低低三三濃濃度度加加入入到到空空白白血血漿漿中中，，處處理理后后測(cè)測(cè)定定，，與與加加入入標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)量量相相比比，，得得方方法法回回收收率率，，測(cè)測(cè)定定值值<15%，定定量量限限<20%注意意問(wèn)問(wèn)題題：：a．加加入入藥藥量量與與實(shí)實(shí)際際測(cè)測(cè)定定值值相相近近b．加加入入物物與與實(shí)實(shí)際際存存在在狀狀態(tài)態(tài)相相近近c(diǎn)．空空白白試試驗(yàn)驗(yàn)與已已確確定定方方法法進(jìn)進(jìn)行行比比較較2．精精密密度度precision①標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)差差SD②相相對(duì)對(duì)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)性性偏偏差差RSD不大大于于15%，定定量量限限不不大大于于20%②日日間間精精密密度度日日內(nèi)內(nèi)精精密密度度3．靈靈敏敏度度（（sensitivity）檢測(cè)測(cè)的的最最小小量量（1）檢檢測(cè)測(cè)限限（（LOD））從背背景景中中檢檢測(cè)測(cè)到到的的最最小小藥藥物物濃濃度度：：S/N≥3的絕絕對(duì)對(duì)量量LOD=3N/S（N噪間間S被測(cè)測(cè)物物信信號(hào)號(hào)/單位位重重量量））N=1mm