干細(xì)胞鑒定課件

干細(xì)胞鑒定QualityAssuranceDept.JaneChenOricellTM檢測項目常規(guī)檢測：細(xì)菌、真菌檢測；支原體檢測；內(nèi)毒素檢測；鑒定檢測：生長形態(tài)、增殖能力、誘導(dǎo)分化能力、特異性抗原表達(dá)、核型分析等常規(guī)檢測項目檢測方法檢測對象檢測標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌、真菌檢測直接接種培養(yǎng)法培養(yǎng)上清液陰性支原體檢測直接接種培養(yǎng)法培養(yǎng)上清液陰性PCR法細(xì)胞陰性內(nèi)毒素檢測凝膠法培養(yǎng)上清液≤50EU細(xì)胞倍增時間：生長曲線測定（計數(shù)法或MTT法）

細(xì)胞倍增的時間區(qū)間即細(xì)胞對數(shù)生長期，細(xì)胞傳代、實驗等多應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行?？稍诩?xì)胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細(xì)胞增加一倍所需的時間，即倍增時間。

細(xì)胞周期測定：

碘化丙錠(PI)染色流式檢測法

由于細(xì)胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA

含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此，可通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測，由此可知細(xì)胞周期的分布情況并確知細(xì)胞的倍體是否正常。生長增殖要求細(xì)胞類別復(fù)蘇存活率增殖速度細(xì)胞密度(個/cm2）間質(zhì)干細(xì)胞≥80%按1:3分種率，2～3天可傳代人：1.5~2.5X104大鼠：6x103小鼠：8x103兔：2~3x104狗：1.5~2.5X104小鼠胚胎干細(xì)胞≥70%按1:6分種率，2～3天可傳代5~10X104人胚胎干細(xì)胞≥10%按1:6分種率，5～7天可傳代1~5X104大、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞≥50%按1:6分種率，3～4天可傳代1.5X105間質(zhì)干細(xì)胞定義：來源于中胚層的早期細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞。來源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。梭形、纖維樣細(xì)胞原代：克隆樣生長傳代后：均質(zhì)、旋渦狀排列HumanDogMonkeyMouseRatRabbit形態(tài)學(xué)名稱CD34CD45CD11bCD44CD29CD90檢驗標(biāo)準(zhǔn)≤5%≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%結(jié)論陰性陰性陰性陽性陽性陽性

3.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

4.大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞名稱CD34CD45CD11bCD106CD44CD29CD90檢驗標(biāo)準(zhǔn)≤5%≤5%≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%結(jié)論陰性陰性陰性陰性陽性陽性陽性誘導(dǎo)分化能力成骨：茜素紅染色成脂：油紅O染色成軟骨：阿利辛藍(lán)/甲苯胺藍(lán)染色成骨誘導(dǎo)誘導(dǎo)原理：

地塞米松：通過促進(jìn)CbfalmRNA（核心結(jié)合因子-1）和OsterixmRNA（成骨分化必需轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)而促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

β-甘油磷酸鈉：提供磷離子作為ALP作用的底物，誘導(dǎo)和激活A(yù)LP，促進(jìn)有機磷向無機磷轉(zhuǎn)化，為鈣鹽礦化沉積提供條件。

Vc：一種重要的營養(yǎng)素和氧化還原劑，在骨鹽代謝及骨形成中具有重要作用。在體外，它能增加鈣鹽的沉積，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成。成骨誘導(dǎo)檢測方法

茜素紅染色

堿性磷酸酶染色

成骨誘導(dǎo)過程中鈣離子以鈣鹽的方式沉淀下來，形成“鈣結(jié)節(jié)”，茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成深紅色。

堿性磷酸酶活性是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志。BCIP/NBT是堿性磷酸酯酶的常用底物。在其催化下，BCIP會被水解產(chǎn)生強反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的NBT-formazan。

VonKossa染色

I型膠原檢測

確定細(xì)胞外基質(zhì)礦化的方法，只有成骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時能形成礦化的細(xì)胞外基質(zhì)，一般培養(yǎng)至6~8周即可出現(xiàn)。原理是將礦化基質(zhì)中的磷酸鹽(鈣)、碳酸鹽(鈣)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徙y、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強還原劑使其還原為黑色的金屬銀。成骨細(xì)胞可合成I型膠原，是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)識物之一，免疫熒光法檢測其表達(dá)在骨細(xì)胞核周圍。各種屬MSCs成骨誘導(dǎo)茜素紅染色效果HumanRatMouseRabbit成脂誘導(dǎo)檢測方法油紅O染色

成脂肪誘導(dǎo)的過程中，細(xì)胞在胞漿中不斷有滴的累積，并不斷的增加變大，最后整個細(xì)胞的胞漿中都是油滴。OilRedO染色的方法是對油滴的染色的一種方法。

各種屬MSCs成脂誘導(dǎo)油紅O染色效果HumanRatMouseRabbit成軟骨誘導(dǎo)方法

三維培養(yǎng)法：能容納高密度的細(xì)胞（與胚胎體內(nèi)軟骨發(fā)育的過程類似），細(xì)胞外基質(zhì)也可良好地固定在細(xì)胞附近，細(xì)胞之間的粘附、增殖，有利于細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，為維護(hù)細(xì)胞的代謝活動提供適宜的微環(huán)境?？梢哉f，在離心管三維培養(yǎng)法中細(xì)胞外基質(zhì)對細(xì)胞增殖分化及代謝的調(diào)節(jié)作用得到了充分地發(fā)揮，是構(gòu)建組織塊的良好方法。但后續(xù)需做石蠟切片后方可進(jìn)行染色鑒定，較為繁瑣。貼壁誘導(dǎo)：后續(xù)檢測較為簡便，但不適用于增殖過快或貼壁性較差的細(xì)胞。成軟骨誘導(dǎo)檢測方法甲苯胺藍(lán)染色：檢測蛋白多糖（軟骨細(xì)胞特異分泌的基質(zhì)成分）的分泌；是一種異染染料，可將蛋白多糖類（粘液）染成紫紅色，而其余組織呈不同程度的藍(lán)色阿利辛藍(lán)染色：檢測軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)中的葡萄糖胺聚糖,可使軟骨中硫酸軟骨素、硫酸膠質(zhì)素等主要成分呈現(xiàn)藍(lán)色，阿利新藍(lán)的軟骨染色常與染液的pH（大約為2.5左右）有關(guān)II型膠原檢測：軟骨細(xì)胞合成的特異性成分，通過免疫組化的方法可以觀察細(xì)胞II型膠原的表達(dá)情況。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell-ES)是指囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細(xì)胞無限增殖、自我更新可分化為三個胚層來源的各種組織及細(xì)胞類型形態(tài)學(xué)：集落樣或克隆樣生長特異性轉(zhuǎn)錄因子/抗原表達(dá)：表達(dá)OCT-4，Nanog；SSEA種屬間表達(dá)有差異染色體結(jié)構(gòu)：傳代過程中保持正常穩(wěn)定的核型全能性：具有向胚胎的3個胚層來源的所有細(xì)胞分化的能力鑒定方法形態(tài)學(xué)鼠ES：緊密牢固結(jié)合、多層密集立體生長，呈堆積狀，邊緣清楚，細(xì)胞核大、核仁明顯、核漿比高。

人ES：相對松散、扁平狀集落,集落內(nèi)細(xì)胞界限隱約可見堿性磷酸酶染色染色體結(jié)構(gòu)核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。人（46，XX/XY），鼠（40，XX/XY)

人ES核型分析：46，XX鼠ES核型分析：40，XY全能性體內(nèi)：畸胎瘤實驗體外：去除飼養(yǎng)層細(xì)胞擬胚體（EB,embryoidbody。為ES細(xì)胞懸浮生長自發(fā)分化形成，含有內(nèi)中外三個胚層組織，能模擬體內(nèi)的發(fā)育過程)

貼壁誘導(dǎo)特定條件誘導(dǎo)/自然分化（除去LIF）各胚層特定抗體免疫組化檢測體內(nèi)分化畸胎瘤將細(xì)胞注射入（約106個）SCID（重癥聯(lián)合免疫缺陷）或裸鼠體內(nèi)，約4周后（人ES可能需要8~10周），可見細(xì)胞注射處有腫塊生成，處死小鼠，腫瘤固定后做石蠟包埋，切片，普通HE染色后觀察。ES可在小鼠體內(nèi)生長、分化、形成含有三個胚層來源的良性畸胎瘤。外胚層：鱗狀上皮、神經(jīng)組織等中胚層：骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等內(nèi)胚層：柱狀上皮、腸管樣組織等體外分化ESEB貼壁誘導(dǎo)約5~7天后出現(xiàn)自主性搏動AFP(endoderm)Troponin(mesoderm)Tubulin(ectoderm)Nestin(ectoderm)定向分化脂肪細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)胞肝細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內(nèi)可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。鑒定方法形態(tài)學(xué)特征：可做懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)特異性抗原表達(dá)：Nestin分化能力：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征懸浮培養(yǎng)1.“神經(jīng)球”樣結(jié)構(gòu)2.懸浮狀生長3.細(xì)胞無明顯的突起貼壁培養(yǎng)1.需用PLL及Lamin包被生長表面2.多角形或梭形大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-懸浮培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)特異性抗原表達(dá)≥75%positivefornestin

(neuralstemcellmarker)；≤10%positiveforβ3-tubulin(neuronalmarker)；≤10%positiveforGFAP

(astrocytemarker)；≤10%positiveforGalCoroligodendrocytespecificproteinOSP

(oligodendrocytemarkerRatNSCnestinstainingMouseNSCnestinstaining≥10%positiveforβ3-tubulin(neuronalmarker);≥30%positiveforGFAP(astrocytemarker);≥2%positiveforoligodendrocytespecificproteinOSP(oligodendrocytemarker)分化能力自然分化：加入含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)約7天，可分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。三者的分化比例約為(16±7)%，(75±7)%和(5±3)%。定向分化：1.神經(jīng)元方向分化：用無血清無生長因子誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，可使分化比例升至60%以上。2.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。分化方法神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Tubulin：即微管蛋白，是細(xì)胞的一種骨架蛋白，神經(jīng)元早期標(biāo)志物。分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin，其中α-tubulin和β-tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種tubulin。β-Tubulin表達(dá)和分布隨著神經(jīng)元發(fā)育成熟而變化,生長初期主要分布于核周附近,隨神經(jīng)元的成熟散在分布于胞質(zhì)及突起內(nèi),構(gòu)成細(xì)胞骨架,維持細(xì)胞形態(tài)。MAP2(microtubuleassociateprotein2)：微管相關(guān)蛋白2，在神經(jīng)元發(fā)育、分化、可塑性方面起主導(dǎo)作用，MAP-2主要存在于樹突和胞體，是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白。但是在體外培養(yǎng)未成熟神經(jīng)元中,MAP2分布無區(qū)域特異性,可出現(xiàn)于包括軸突在內(nèi)的整個細(xì)胞。NF(neuralfilament)：神經(jīng)絲蛋白，是神經(jīng)元所特有的中間絲蛋白(10-12nm)，分為NF-L(68kDa)、NF-M(160kDa)和NF-H(200kDa)三種不同類型的蛋白。它們與其他中間絲蛋白相互聚合形成網(wǎng)絡(luò)，是構(gòu)成神經(jīng)元骨架的主要成分。

NSE(Neuronalspecificenolase)：神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有的一種酸性蛋白酶，是小細(xì)胞肺癌(SCLC)最敏感最特異的腫瘤標(biāo)志物。

GFAP(glialfibrillaryacidicprotein):膠質(zhì)纖維酸性蛋白，星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物。參與許多細(xì)胞功能性活動，如細(xì)胞組成及遷移等。OSP（Oligodend