植物總RNA的提取及RT-PCR

植物總RNA的取及RT-PCR一實(shí)目學(xué)從植物組織中提取總的法了的本原理和實(shí)驗(yàn)方法二實(shí)原取的原理是類極易降解的分子得完整的須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對的解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活酶所以從胞中釋放出來時(shí)不被降解。細(xì)胞裂解后，除了，還有蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總的理提取組織或細(xì)胞中的總，其中的mRNA作為模板，采用Oligo（）作引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得目的基因或檢測基因表達(dá)RNA檢的敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因和合成探針等。三儀、品試配一儀及器皿．低溫離心機(jī)；2．脂凝膠電泳系統(tǒng)；3．高壓滅菌鍋；儀．研缽；一性手套等；離管；培養(yǎng)皿；燒及試劑瓶等。二藥碳酸二乙酯異硫氰酸胍GT醋酸酚乙

異醇氯β－巰基乙醇瓊糖反轉(zhuǎn)錄試劑盒聚酶引物三試配制．水滅菌硫氰酸胍（）滅菌（）滅菌滅菌緩沖液：mMTris-HClmMEDTA（）滅。四實(shí)步（一）總的提?。?研缽冷卻后入2/3液加入0.2g植材料充分研后轉(zhuǎn)入一個(gè)含有300的4MGT的1.5ml的丙烯管，搖勻。（2加入30MNaAcpH4.9-5.2搖勻，加入酸酚（水飽和酚pH<5.0

搖勻，加入100三甲烷，搖勻。（312000rpm4℃離心20min，取上清加入等體積異丙醇，于冰上放置15。（412000rpm℃心10，將沉淀懸浮于含4M氯鋰的mlEP管中，于-℃放置1小或更長時(shí)間。（512000rpm4℃離心10-15min，沉溶于0.4mlDEPC中，加入1/2體積氯仿和1/2體積酸酚，搖勻，進(jìn)抽提12000rpm℃離心5min；清加入等體積氯仿，搖勻，進(jìn)行抽提12000℃離心min。（6上清液加入1/10體的3M酸鈉和兩倍體積的無水乙醇-20℃放置1小或更長時(shí)間。（712000rpm4℃離心15min，超凈臺吹，沉淀溶于10b滅菌水。（8RNA貯80。（二）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生在處理過的離心管中冰上按下表加入：模板RNAOlig(dT)DEPC水

2μ1μ2μl混勻，℃水浴中放置2min，立即放置到冰上min。然后在冰上依次加入：RNasinM－5×buffer10mMdNTP

0.5μ1μ2μ1.5μ42℃，水浴中反應(yīng)90min?！?0min，終止反應(yīng)。加入15μl的DEPC滅菌水，使體積達(dá)到25μl三在菌的管中加入以下成分，形成反體系μldNTP(2.5mmol)2lRT-PCR產(chǎn)5μTaq酶0.5μ上游引物（10l）0.5l下游引物（10l）0.5l滅菌ddHO加25μl2.按下列條件進(jìn)行PCR反94℃5min94℃30s55℃30s72℃1min30個(gè)循環(huán)72℃7min4℃（四）電泳檢測將加的變瓊脂糖凝膠放入水平電泳中，加電緩沖液，覆蓋凝膠約將及樣加到凝膠點(diǎn)樣孔中，條下電泳，紫

外燈下觀察結(jié)果。五注事．研磨過程中，利用液氮時(shí)刻使組織保持冰凍狀態(tài)。酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細(xì)胞內(nèi)源酶外，外界環(huán)境中均存在，所以操作時(shí)應(yīng)戴手套。使，應(yīng)在通風(fēng)櫥中戴手套操作。．提取用品準(zhǔn)備：）通的玻璃器皿℃干?。úＡВ?，研缽，小勺，試劑若干個(gè)。）次性使用的塑料制品：槍頭管先用水理