KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用課件

KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用匯報(bào)內(nèi)容KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者KarapetisCS,2008,NEngJMed結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；美國(guó)FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說(shuō)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國(guó)衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）》。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤K-ras基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗；KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）AndersonSM,2011,ExpertRev.Mol.DiagnEberhardDA,2005,JClinOncol非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。EGFR突變背景EGFR基因位于染色體7p11.2，大小約200kb，是上皮生長(zhǎng)因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10%左右，而在東亞為30-50%。其中在亞洲、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR突變率最高，達(dá)70-80%。EGFR突變影響肺癌藥物療效研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。MokT.S.2009,NEngJMedMaemondoM.2010,NEngJMedEGFR突變位點(diǎn)（常規(guī)檢測(cè)29個(gè)）突變外顯子堿基變化CosmicIDG719A182156G>C6239G719S182155G>A6252G719C182155G>T6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753>S192240-2257del1812370E746-A750>I192235-2252>AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750>A192237-2251del1512678E746-S752>A192237-2254del1812367E746-S752>V192237-2250>T(complex)12384E746-S752>D192238-2255del186220L747-A750>P192238-2248>GC(complex)12422L747-T751>Q192238-2252>GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750>P192239-2248TTAAGAGAAG>C12382L747-P753>Q192239-2258>CA(complex)12387L747-T751>S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751>P192239-2251>C(complex)12383T790M202369C>T6240S768I202303G>T6241V769-D770insASV202307-2308insGCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320insCAC12377D770-N771insG202310-2311insGGT12378L858R212573T>G6224L861Q212582T>A6213EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)系所在外顯子突變類(lèi)型與EGFR-TKI療效關(guān)系18G719A(S/C)3種點(diǎn)突變藥敏突變1919種缺失突變藥敏突變20點(diǎn)突變S768I藥敏突變20點(diǎn)突變T790M耐藥突變*203種插入突變耐藥突變*21點(diǎn)突變L858R藥敏突變21點(diǎn)突變L861Q藥敏突變ADxEGFR試劑盒突變結(jié)果檢測(cè)組別突變類(lèi)型所占比例對(duì)吉非替尼敏感性證據(jù)

1Exon19deletions;L858R90%充分2T790M/deletion;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I7%有限3T790Malone;Exon20insertions;othermutations3%無(wú)ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)ARMS-PCR原理ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem(擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫(xiě)。根據(jù)PCR過(guò)程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè),當(dāng)引物3′末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí),產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其3′末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。PCR產(chǎn)物檢測(cè)--RealtimePCR每個(gè)PCR循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)，不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信號(hào)相比凝膠電泳：更快，可定量，無(wú)PCR產(chǎn)物污染信號(hào)產(chǎn)生方法：Scorpion(Qiagen)，雙環(huán)探針(廈門(mén)艾德)，Taqman，Molecularbeacons，Sybrgreen，Yo-proFigure2ThesensitivityofQuanTAS-PCRforquantifyingJAK2mutantalleles.ZapparoliG.V.2013,BMCCancer應(yīng)用于Realtime-PCR的ARMS-PCRGCATGAAGGalleleAallele5’5’5’5’3’3’3’3’ASprimerASprimerMismatchMismatchReverseprimerReverseprimerFAM-5’3’-BHQ1FAM-5’3’-BHQ1ProbeProbe測(cè)序法與ARMS法相比較Sanger測(cè)序法焦磷酸測(cè)序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率低較高高商用試劑盒無(wú)有有流程與速度1-2天2-3天<1天數(shù)據(jù)分析要求高高低試劑成本低低略高儀器成本高高低操作流程及數(shù)據(jù)解讀使用ARMS的KRAS突變檢測(cè)試劑盒試劑盒公司密碼子位點(diǎn)個(gè)數(shù)檢測(cè)技術(shù)TheraScreenassayQiagencodon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR和蝎形探針技術(shù)KRAS檢測(cè)試劑盒廈門(mén)艾德codon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR和雙環(huán)探針技術(shù)人K-RAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒上海透景(Tellgen)codon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR和Taqman探針技術(shù)人類(lèi)KRAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒武漢友芝友Codon12、137個(gè)重要突變ARMS-PCR熒光探針?lè)ㄈ薑RAS基因突變檢測(cè)試劑盒蘇州工業(yè)園codon12、134個(gè)突變ARMS-PCR和Taqman探針技術(shù)使用ARMS的EGFR突變檢測(cè)試劑盒DxSARMSADxARMS友芝友生產(chǎn)廠商英國(guó)DxS公司(Qiagen)廈門(mén)艾德公司武漢友芝友引物與探針設(shè)計(jì)蝎形引物與探針雙環(huán)引物與探針特異性引物和探針檢測(cè)突變種類(lèi)29種29種29種突變判讀FAM信號(hào),ΔCt值FAM信號(hào),Ct值FAM信號(hào),Ct值DNA用量20ng10ng20ng樣本中檢測(cè)1%突變適用qPCR機(jī)型StratageneMx系列,ABI系列StratageneMx系列,ABI系列,Lightcycler480StratageneMx3000P,ABI7500,Lightcycler480等

等位特異性引物設(shè)計(jì)三引物設(shè)計(jì)原理YouF.M.2008,BMCBioinformatics三引物設(shè)計(jì) ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’ 19nt，51℃突變型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 19nt，49℃下游引物（R） 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’ 25nt，54℃三引物設(shè)計(jì)—下游引物設(shè)計(jì) ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列： 5’-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3’互補(bǔ)鏈： 3’-CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5’下游引物： 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’3’端增加錯(cuò)配如果3’端是弱錯(cuò)配（C/A或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或C/T）才可阻斷3’端的擴(kuò)增；如果3’端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或C/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或G/T）或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3’端的擴(kuò)增；當(dāng)3’端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配。野生型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’突變型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3’下游引物（R） 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’四引物設(shè)計(jì)四引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內(nèi)引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’內(nèi)引物（R）5’-ACTCTTGCCTACGCCACC-3’外引物（F）5’-ATGACTGAATATAAACT-3’外引物（R）5’-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3’KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì)KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1.5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA-3’ 12GGT—GAT2.5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCG

GT-3’ 12GGT—GTT3.5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’ 12GGT—GCT4.5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 12GGT—AGT5.5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCG

T-3’ 12GGT—TGT6.5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCC

C-3’ 12GGT—CGT7.5’-GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA-3’ 13GGC—GAC8.參照引物：5’-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT-3’9.下游引物：5’-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’TaqMan探針：5’-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3’鎖核酸阻滯探針(野生型)：5’-TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-P04-3’浙江大學(xué)，CN102367478B反應(yīng)體系引物終濃度：0.3μMTaqma