一種基于SARS冠狀病毒S蛋白的新型靶向輸送生物仿真系統(tǒng)的研

一種基于SARS冠狀病毒S蛋白的新型靶向輸送生物仿真系統(tǒng)的研究研究背景嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（severacuterespiratorysyndrome,SARS）于2002年11月首先在我國廣東省出現(xiàn)，此后該癥于2003年初在全球傳播。至2003年6月SARS流行被控制為止，全球被確診的患者達(dá)到8098人，死亡人數(shù)774人；該病造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SARS出現(xiàn)不久，經(jīng)過全球科學(xué)家多中心協(xié)作努力，鑒定出導(dǎo)致SARS的元兇是一種新型的冠狀病毒（SARScoronavirus，SARS?CoV）。SARS冠狀病毒(SARS-Cov)，屬于巢狀病毒目(Order:Nidovirales),冠病毒科(Family:Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Genus:Coronavirus)。根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)分類，它屬于單鏈正義RNA病毒[(+)sense,ssRNAVirus]。成熟的冠狀病毒顆粒直徑約為60至220nm不等。其形態(tài)學(xué)上最顯著的特征在于，在病毒包膜(envelope)外，有明顯的棒狀膜外粒子(‘club-shaped’peplomers)。這一酷似中世紀(jì)歐洲帝王王冠(crown)的結(jié)構(gòu)，正是其”名字”-Coronavirus的來源。研究背景S蛋白（spike-protein）即伸出包膜的棒-球形的糖蛋白，它在病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合及介導(dǎo)病毒包膜和細(xì)胞膜融合并進(jìn)入細(xì)胞的過程中，起關(guān)鍵性作用，也是冠狀病毒主要的抗原蛋白。HE蛋白構(gòu)成包膜的短突起，其可能與冠狀病毒早期吸附有關(guān)，某些CoV的HE蛋白可引起紅細(xì)胞凝集及對紅細(xì)胞產(chǎn)生吸附M蛋白則是一種跨膜蛋白，在病毒的包膜形成與出芽(budding)過程中起重要作用。E蛋白是一種相對較小的蛋白質(zhì)，主要散在分布于病毒包膜上。N蛋白是一種堿性磷蛋白，其中央?yún)^(qū)同基因組RNA結(jié)合，形成卷曲的核衣殼蛋白研究背景S1能夠與細(xì)胞受體特異性結(jié)合，S2介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜發(fā)生融合作用研究背景DNA測序結(jié)果表明SARS-CoV的S蛋白長度為1256個氨基酸，S2蛋白約600個氨基酸。S2包括三個螺旋結(jié)構(gòu)（helix）和一個穿膜區(qū)（1197~1218aa）S2的三個螺旋結(jié)構(gòu)是介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞融合（membranefusion）的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)；而穿膜區(qū)則將S蛋白固定在病毒包膜上S1與特異性受體的高親和力結(jié)合并不能直接介導(dǎo)細(xì)胞融合，但卻可有效地驅(qū)動S2介導(dǎo)的細(xì)胞融合反應(yīng)。如果能找到細(xì)胞/組織特異性的高親和力結(jié)合肽，就有可能模仿或替代S1的功能，為S2介導(dǎo)的細(xì)胞融合反應(yīng)提供動力，同時又可避免S1作為病毒抗原介導(dǎo)的免疫病理反應(yīng)。研究背景研究背景利用噬菌體展示技術(shù)（phagedisplay）篩選細(xì)胞/組織特異性的高親和力結(jié)合肽FusionproteinPIIIphenotypegenotype噬菌體展示技術(shù)的本質(zhì)就是在一個單一的噬菌體粒子當(dāng)中遺傳基因表型和蛋白表型的直接的對應(yīng)關(guān)系。利用這種對應(yīng)關(guān)系人們可以將各種自然界存在或不存在的DNA整合到噬菌體基因中，以重組蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面，從中篩選出人們所需的目的片斷。研究背景外源基因融合于噬菌體不同區(qū)段外殼蛋白基因的表達(dá)模式3~4輪篩選將噬菌體文庫鋪在固定的誘餌上洗脫未結(jié)合的噬菌體加入宿主菌，擴(kuò)增和富集洗脫的噬菌體鋪富集文庫鋪盤分離單個克隆驗(yàn)證結(jié)合實(shí)驗(yàn)3-4輪經(jīng)典噬菌體展示技術(shù)篩選流程圖研究背景噬菌體體展示示技術(shù)術(shù)最初初被廣廣泛應(yīng)應(yīng)用于于從復(fù)復(fù)雜的的重組組文庫庫中篩篩選和和特定定靶分分子結(jié)結(jié)合的的蛋白白或多多肽。。隨著發(fā)發(fā)展，，該技技術(shù)也也已經(jīng)經(jīng)被應(yīng)應(yīng)用到到細(xì)胞胞系、、組織織和疾疾病模模型水水平，，篩選選和鑒鑒定靶靶向特特定細(xì)細(xì)胞系系、組組織和和疾病病模型型的結(jié)結(jié)合蛋蛋白和和多肽肽。目前，，惡性性腫瘤瘤治療療的關(guān)關(guān)鍵問問題之之一就就是缺缺乏特特異性性攻擊擊腫瘤瘤細(xì)胞胞的有有效藥藥物。。噬菌體體展示示技術(shù)術(shù)已經(jīng)經(jīng)被用用來篩篩選和和表達(dá)達(dá)與不不同腫腫瘤細(xì)細(xì)胞表表面的的特異異性大大分子子結(jié)合合的多多肽或或蛋白白，以以期將將這些些蛋白白或多多肽應(yīng)應(yīng)用到到腫瘤瘤靶向向藥物物的設(shè)設(shè)計中中。研究究背背景景培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞篩選隨機(jī)12肽庫Ph.D.-12TM生物信息學(xué)聚類陽性克隆分離S2基因片段（S2）構(gòu)建pET-14b-S2質(zhì)粒確定多條靶向多肽（TP）綠色熒光蛋白基因（GFP）構(gòu)建pET-14b-S2-TP質(zhì)粒MKK6活性誘變體MKK6(E)基因構(gòu)建pET-14b-S2-GFP-TP質(zhì)粒構(gòu)建pET-14b-S2-MKK6-TP質(zhì)粒表達(dá)蛋白評價蛋白定向輸入功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)流流程程基于于SARS冠冠狀狀病病毒毒S蛋蛋白白介介導(dǎo)導(dǎo)細(xì)細(xì)胞胞膜膜融融合合機(jī)機(jī)制制的的生生物物仿仿真真靶靶向向輸輸送送系系統(tǒng)統(tǒng)的的設(shè)設(shè)計計理理念念實(shí)驗(yàn)驗(yàn)流流程程實(shí)驗(yàn)驗(yàn)流流程程評價價蛋蛋白白定定向向輸輸入入功功能能該靶靶向向輸輸送送系系統(tǒng)統(tǒng)中中融融合合蛋蛋白白后后接接綠綠色色熒熒光光蛋蛋白白（（greenfluoresenceprotein，，GFP）），，可可在在熒熒光光顯顯微微鏡鏡下下動動態(tài)態(tài)觀觀察察細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)綠綠色色熒熒光光強(qiáng)強(qiáng)度度的的變變化化，，可可用用于于研研究究這這一一系系統(tǒng)統(tǒng)攜攜帶帶外外源源蛋蛋白白特特異異性性靶靶向向進(jìn)進(jìn)入入細(xì)細(xì)胞胞的的能能力力。。融合合蛋蛋白白后后接接誘誘導(dǎo)導(dǎo)細(xì)細(xì)胞胞凋凋亡亡的的蛋蛋白白或或多多肽肽，，如如MKK6(E)，，檢檢測測A549細(xì)細(xì)胞胞的的凋凋亡亡情情況況，，用用于于研研究究這這一一系系統(tǒng)統(tǒng)攜攜帶帶凋凋亡亡誘誘導(dǎo)導(dǎo)蛋蛋白白靶靶向向?qū)?dǎo)入入肺肺癌癌細(xì)細(xì)胞胞，，從從而而殺殺滅滅肺肺癌癌細(xì)細(xì)胞胞的的能能力力。。近年年來來我我國國的的肺肺癌癌發(fā)發(fā)病病率率明明顯顯上上升升，，在在一一些些大大中中城城市市肺肺癌癌已已占占常常見見惡惡性性腫腫瘤瘤的的首首位位。。生物靶向治療療已逐漸成為為一種新的腫腫瘤治療策略略。本靶向輸送系系統(tǒng)，巧妙地地利用了SARS-CoV特異性侵侵襲肺組織的的分子進(jìn)化機(jī)機(jī)制，結(jié)合腫腫瘤靶向多肽肽和可誘導(dǎo)肺肺癌細(xì)胞凋亡亡的蛋白或多多肽，靶向輸輸送殺滅腫瘤瘤細(xì)胞，具有有良好的開發(fā)發(fā)應(yīng)用前景和和實(shí)踐意義。。研究意義研究進(jìn)展T載體中保存存的S1，S2片段S1markerS2T-S1T-S2digestion(T-S1)digestion(T-S2)1500bp_2000bp_3000bp_4000bp_1000bp_750bp_研究進(jìn)展pET-14b-S2質(zhì)質(zhì)粒的構(gòu)建markerS2pET-14b-S2digestion(pET-14b-S2)pET-14bVector1500bp_2000bp_3000bp_4000bp_1000bp_750bp_BRASIL法（Biopanningandrapidanalysisofselectiveinteractiveligands）是一種種通過差異離離心的方法將將細(xì)胞-噬菌菌體復(fù)合物從從親水環(huán)境分分離到疏水性性有機(jī)相中，，從而與未結(jié)結(jié)合細(xì)胞的噬噬菌體分離的的過程。與細(xì)胞結(jié)合的的噬菌體和細(xì)細(xì)胞一起被離離心沉淀到有有機(jī)相中，而而未結(jié)合的噬噬菌體仍以可可溶形式保存存于上層水相相中。該法僅需一步步離心分離就就可完成，比比當(dāng)前細(xì)胞篩篩選方法更加加快速、簡單單；而且篩選選得到的多肽肽更加敏感和和特異。最常用的有機(jī)機(jī)相是9:1[v:v]的鄰苯二二甲酸二丁酯酯和環(huán)己烷。。研究進(jìn)展細(xì)胞篩選模型型的建立（BRASIL法）研究進(jìn)展細(xì)胞篩選模型型的建立我們已經(jīng)利用用該法完成了了LPS刺激激人臍靜脈內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC））篩選噬菌體體環(huán)七肽庫的的模型利用建立的篩篩選方法，以以A549腺腺癌細(xì)胞為為靶細(xì)胞，篩篩選噬菌體隨隨機(jī)12肽庫庫生物信息學(xué)聚聚類陽性克隆隆，確定靶向向肽