兔場實驗室細菌培養(yǎng)技術(shù)

Word-6-兔場實驗室細菌培養(yǎng)技術(shù)細菌分別培養(yǎng)是兔場試驗室診斷工作中一個非常重要的步驟，利用對細菌的分別和純培養(yǎng)，能夠按照菌落的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、色澤、氣味以及有無溶血等狀況舉行初步鑒定，然后利用進一步的染色鏡檢或者是特別培養(yǎng)舉行鑒定或討論，為病原確實診提供依據(jù)。

1．培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基是細菌學(xué)檢查過程中十分重要的材料，它含有細菌生長所必須的養(yǎng)分物質(zhì)，細菌經(jīng)過培養(yǎng)基的純培養(yǎng)，才干夠舉行精確?????的檢查，獲得牢靠的結(jié)果。

(1)肉水的制作：

①材料：瘦牛肉500克，蒸餾水(或常水)1000毫升。

②辦法：取瘦牛肉除去脂肪、肌腱，切成碎塊或絞碎，按1千克牛肉2千毫升水的比例，加水浸泡一夜，煮沸一小時，用紗布初步濾去肉渣擠出肉水，再用濾紙濾過，補足原有水量，裝入燒瓶中置高壓滅菌器中120℃20分鐘滅菌，制成肉水。

制作肉水的另一種辦法是：取牛肉浸膏0.5-1.0克，加蒸餾水100毫升，加熱溶解，濾紙濾過，并同上述辦法舉行滅菌即成。

③用途：制作各種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。

(2)養(yǎng)分肉湯：

①材料：肉水1000毫升，蛋白胨I0克，氯化鈉5克。

②辦法：將蛋白胨和氯化鈉加入肉水中，稍加熱溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.6之間，再加溫使溶液勻稱。濾過分裝后高壓滅菌備用。

③用途：可供普通的細菌生長需要，檢查細菌的生長表現(xiàn)，也可作為制作固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。

(3)養(yǎng)分瓊脂：

①材料：養(yǎng)分瓊脂粉40克，蒸餾水1000毫升。

②辦法：將養(yǎng)分瓊脂粉加入蒸餾水中，攪拌浸泡1小時，加熱使充分溶解，高壓滅菌備用。

③用途：分別細菌純培養(yǎng)及作為其他特種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。

(4)血液瓊脂培養(yǎng)基：

①材料：脫纖維血5-10毫升，養(yǎng)分瓊脂100毫升。

②辦法：預(yù)備好滅菌并有玻璃珠的三角燒瓶，無菌采集血液，注入三角燒瓶中，不停地搖動，直至血纖維分別為止，普通需要10分鐘。

高壓滅菌好的養(yǎng)分瓊脂溶化后，冷卻至55-60℃時加人脫纖維血液，注重必需確保無菌操作，加入血液后輕輕搖動，不使產(chǎn)憤怒泡，立刻倒人無菌平皿或分裝于滅菌試管中備用。

③用途：觀看細菌的溶血狀況，有的細菌的初次分別時需要此種培養(yǎng)基。

(5)厭氧肝片肉湯：

①材料：養(yǎng)分肉湯，動物肝塊或肉渣，液體石蠟。

②辦法：通過作肉湯的碎肉塊、肉渣或者是動物肝臟少許，分裝于試管中加養(yǎng)分肉湯5毫升，上層加液體石蠟0.5-1.0毫升．120℃20分鐘滅菌備用。

③用途：厭氧菌的培養(yǎng)。

(6)麥康凱瓊脂：

①材料：麥康凱瓊脂粉38克，蒸餾水1000毫升。

②辦法：將麥康凱瓊脂粉加入蒸餾水中，攪拌浸泡1小時，加熱使充分溶解，高壓滅菌備用。

③用途：常用作大腸桿菌類細菌的分別培養(yǎng)。

2．細菌接種辦法

(1)平板劃線接種法：平板劃線接種法是細菌分別培養(yǎng)中最常用的辦法，能使細菌簇擁生長，形成單個菌落。左手持培養(yǎng)皿，用拇指、食指及中指將平皿揭開，角度不要超過20度，右手拿接種環(huán)，接種環(huán)與瓊脂表面約呈45度角。取少許病料涂布于培養(yǎng)基邊緣，火焰滅菌接種環(huán)，冷卻后輕觸培養(yǎng)基邊緣的病料區(qū)，并向一邊劃出橫線，能夠延續(xù)劃出一個小區(qū)，火焰滅菌接種環(huán)，冷卻后將平皿轉(zhuǎn)換角度，從第一個小區(qū)再向外劃出一個小區(qū)，以后再根據(jù)同樣辦法分區(qū)將平板劃滿，注重只能在起始部位與前一個小區(qū)交錯。

(2)瓊脂斜面接種法：本辦法多用于菌種的保存，也能夠用于細菌的分別。左手持斜面培養(yǎng)基，右手持接種環(huán)，火焰滅菌冷卻后挑取所需的菌落，以右手小拇指夾住棉塞或膠塞，輕轉(zhuǎn)后取出，注重不要污染，立刻將管口和塞子火焰滅菌，將接種環(huán)伸入試管內(nèi)，自斜面底部向管口方向劃曲線，再經(jīng)火焰消毒管口和塞子后蓋嚴，舉行培養(yǎng)。

(3)穿刺接種法：本法適用于半固體、固體培養(yǎng)基以及微量發(fā)酵管的接種，用來做細菌的生化和動力學(xué)試驗。沿培養(yǎng)管中心直刺至距管底約0.5厘米處，然后再沿穿刺線退出接種針。

(4)液體培養(yǎng)基接種法：辦法基本同斜面接種法，將接種環(huán)在培養(yǎng)管壁的液面下摩擦，然后再在液體中振動幾次，塞好塞子。注重塞子和管口的滅菌操作。

3．細菌培養(yǎng)辦法

細菌的培養(yǎng)辦法按照細菌的生長特性、培養(yǎng)目的、要求等不同而不同。主要分為以下幾種：

(1)需氧培養(yǎng)法：即普通培養(yǎng)法。細菌接種培養(yǎng)基后，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)即可。適用于需氧菌及兼性厭氧菌的分別培養(yǎng)。

(2)二氧化碳培養(yǎng)法：某些細菌要在一定的二氧化碳環(huán)境中才干良好生長。

①燭缸法：將接種的培養(yǎng)基置于干燥器內(nèi)，點燃蠟燭后，密封好，連同容器一起置溫箱中培養(yǎng)。

②化學(xué)法：每升容器中根據(jù)碳酸氫鈉0.4克，鹽酸3.5毫升的比例，分離裝入兩個小容器中，置于干燥器中，密封后使兩藥接觸產(chǎn)生二氧化碳。

③二氧化碳培養(yǎng)箱法：將培養(yǎng)基置于特制的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，能夠按照需要調(diào)整二氧化碳的濃度。

(3)厭氧培養(yǎng)法：

①換氣法：將培養(yǎng)基放入干燥器內(nèi)，將干燥器內(nèi)抽成真空，然后充入氮氣、氫氣和二氧化碳的混合氣體，放人溫箱中培養(yǎng)。

②焦性沒食子酸法：焦性沒食子酸在堿性溶液中形成焦性沒食子酸鹽，能夠汲取空氣中的氧氣，從而造成無氧的環(huán)境，適合厭氧菌生長。培養(yǎng)辦法：將平皿去蓋翻轉(zhuǎn)，放置焦性沒食子酸1克，再覆上一層脫脂棉，在脫脂棉上滴加I0%的氫氧化鈉1毫升，然后將接種好的平皿籠罩在翻轉(zhuǎn)的蓋上，快速用蠟封固，置37℃溫箱中培養(yǎng)2-4天，觀看結(jié)果。接種的培養(yǎng)基假如是試管，可取大試管一支，底部放焦性沒食子酸2克，并加玻璃珠10多粒，將培養(yǎng)基試管放在玻璃珠上，再沿大試管壁滴加10%氫氧化鈉溶液2毫升，將大試管口用橡皮塞塞緊，置37℃溫箱中培養(yǎng)。

③厭氧肝片肉湯接種：因肝片或肉渣內(nèi)含有谷胱甘肽，可發(fā)生氧化反應(yīng)而降低環(huán)境中的氧化勢能，以利于厭氧菌的分別。接種辦法是用接種環(huán)鉤取病料，接種于培養(yǎng)基中，在37℃溫箱中培養(yǎng)2-4天，觀看結(jié)果。