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Word-6-兔場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌分別培養(yǎng)是兔場(chǎng)試驗(yàn)室診斷工作中一個(gè)非常重要的步驟,利用對(duì)細(xì)菌的分別和純培養(yǎng),能夠按照菌落的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、色澤、氣味以及有無(wú)溶血等狀況舉行初步鑒定,然后利用進(jìn)一步的染色鏡檢或者是特別培養(yǎng)舉行鑒定或討論,為病原確實(shí)診提供依據(jù)。
1.培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基是細(xì)菌學(xué)檢查過(guò)程中十分重要的材料,它含有細(xì)菌生長(zhǎng)所必須的養(yǎng)分物質(zhì),細(xì)菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基的純培養(yǎng),才干夠舉行精確?????的檢查,獲得牢靠的結(jié)果。
(1)肉水的制作:
①材料:瘦牛肉500克,蒸餾水(或常水)1000毫升。
②辦法:取瘦牛肉除去脂肪、肌腱,切成碎塊或絞碎,按1千克牛肉2千毫升水的比例,加水浸泡一夜,煮沸一小時(shí),用紗布初步濾去肉渣擠出肉水,再用濾紙濾過(guò),補(bǔ)足原有水量,裝入燒瓶中置高壓滅菌器中120℃20分鐘滅菌,制成肉水。
制作肉水的另一種辦法是:取牛肉浸膏0.5-1.0克,加蒸餾水100毫升,加熱溶解,濾紙濾過(guò),并同上述辦法舉行滅菌即成。
③用途:制作各種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。
(2)養(yǎng)分肉湯:
①材料:肉水1000毫升,蛋白胨I0克,氯化鈉5克。
②辦法:將蛋白胨和氯化鈉加入肉水中,稍加熱溶解,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.6之間,再加溫使溶液勻稱(chēng)。濾過(guò)分裝后高壓滅菌備用。
③用途:可供普通的細(xì)菌生長(zhǎng)需要,檢查細(xì)菌的生長(zhǎng)表現(xiàn),也可作為制作固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。
(3)養(yǎng)分瓊脂:
①材料:養(yǎng)分瓊脂粉40克,蒸餾水1000毫升。
②辦法:將養(yǎng)分瓊脂粉加入蒸餾水中,攪拌浸泡1小時(shí),加熱使充分溶解,高壓滅菌備用。
③用途:分別細(xì)菌純培養(yǎng)及作為其他特種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。
(4)血液瓊脂培養(yǎng)基:
①材料:脫纖維血5-10毫升,養(yǎng)分瓊脂100毫升。
②辦法:預(yù)備好滅菌并有玻璃珠的三角燒瓶,無(wú)菌采集血液,注入三角燒瓶中,不停地?fù)u動(dòng),直至血纖維分別為止,普通需要10分鐘。
高壓滅菌好的養(yǎng)分瓊脂溶化后,冷卻至55-60℃時(shí)加人脫纖維血液,注重必需確保無(wú)菌操作,加入血液后輕輕搖動(dòng),不使產(chǎn)憤怒泡,立刻倒人無(wú)菌平皿或分裝于滅菌試管中備用。
③用途:觀看細(xì)菌的溶血狀況,有的細(xì)菌的初次分別時(shí)需要此種培養(yǎng)基。
(5)厭氧肝片肉湯:
①材料:養(yǎng)分肉湯,動(dòng)物肝塊或肉渣,液體石蠟。
②辦法:通過(guò)作肉湯的碎肉塊、肉渣或者是動(dòng)物肝臟少許,分裝于試管中加養(yǎng)分肉湯5毫升,上層加液體石蠟0.5-1.0毫升.120℃20分鐘滅菌備用。
③用途:厭氧菌的培養(yǎng)。
(6)麥康凱瓊脂:
①材料:麥康凱瓊脂粉38克,蒸餾水1000毫升。
②辦法:將麥康凱瓊脂粉加入蒸餾水中,攪拌浸泡1小時(shí),加熱使充分溶解,高壓滅菌備用。
③用途:常用作大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的分別培養(yǎng)。
2.細(xì)菌接種辦法
(1)平板劃線接種法:平板劃線接種法是細(xì)菌分別培養(yǎng)中最常用的辦法,能使細(xì)菌簇?fù)砩L(zhǎng),形成單個(gè)菌落。左手持培養(yǎng)皿,用拇指、食指及中指將平皿揭開(kāi),角度不要超過(guò)20度,右手拿接種環(huán),接種環(huán)與瓊脂表面約呈45度角。取少許病料涂布于培養(yǎng)基邊緣,火焰滅菌接種環(huán),冷卻后輕觸培養(yǎng)基邊緣的病料區(qū),并向一邊劃出橫線,能夠延續(xù)劃出一個(gè)小區(qū),火焰滅菌接種環(huán),冷卻后將平皿轉(zhuǎn)換角度,從第一個(gè)小區(qū)再向外劃出一個(gè)小區(qū),以后再根據(jù)同樣辦法分區(qū)將平板劃滿(mǎn),注重只能在起始部位與前一個(gè)小區(qū)交錯(cuò)。
(2)瓊脂斜面接種法:本辦法多用于菌種的保存,也能夠用于細(xì)菌的分別。左手持斜面培養(yǎng)基,右手持接種環(huán),火焰滅菌冷卻后挑取所需的菌落,以右手小拇指夾住棉塞或膠塞,輕轉(zhuǎn)后取出,注重不要污染,立刻將管口和塞子火焰滅菌,將接種環(huán)伸入試管內(nèi),自斜面底部向管口方向劃曲線,再經(jīng)火焰消毒管口和塞子后蓋嚴(yán),舉行培養(yǎng)。
(3)穿刺接種法:本法適用于半固體、固體培養(yǎng)基以及微量發(fā)酵管的接種,用來(lái)做細(xì)菌的生化和動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。沿培養(yǎng)管中心直刺至距管底約0.5厘米處,然后再沿穿刺線退出接種針。
(4)液體培養(yǎng)基接種法:辦法基本同斜面接種法,將接種環(huán)在培養(yǎng)管壁的液面下摩擦,然后再在液體中振動(dòng)幾次,塞好塞子。注重塞子和管口的滅菌操作。
3.細(xì)菌培養(yǎng)辦法
細(xì)菌的培養(yǎng)辦法按照細(xì)菌的生長(zhǎng)特性、培養(yǎng)目的、要求等不同而不同。主要分為以下幾種:
(1)需氧培養(yǎng)法:即普通培養(yǎng)法。細(xì)菌接種培養(yǎng)基后,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)即可。適用于需氧菌及兼性厭氧菌的分別培養(yǎng)。
(2)二氧化碳培養(yǎng)法:某些細(xì)菌要在一定的二氧化碳環(huán)境中才干良好生長(zhǎng)。
①燭缸法:將接種的培養(yǎng)基置于干燥器內(nèi),點(diǎn)燃蠟燭后,密封好,連同容器一起置溫箱中培養(yǎng)。
②化學(xué)法:每升容器中根據(jù)碳酸氫鈉0.4克,鹽酸3.5毫升的比例,分離裝入兩個(gè)小容器中,置于干燥器中,密封后使兩藥接觸產(chǎn)生二氧化碳。
③二氧化碳培養(yǎng)箱法:將培養(yǎng)基置于特制的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),能夠按照需要調(diào)整二氧化碳的濃度。
(3)厭氧培養(yǎng)法:
①換氣法:將培養(yǎng)基放入干燥器內(nèi),將干燥器內(nèi)抽成真空,然后充入氮?dú)?、氫氣和二氧化碳的混合氣體,放人溫箱中培養(yǎng)。
②焦性沒(méi)食子酸法:焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中形成焦性沒(méi)食子酸鹽,能夠汲取空氣中的氧氣,從而造成無(wú)氧的環(huán)境,適合厭氧菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)辦法:將平皿去蓋翻轉(zhuǎn),放置焦性沒(méi)食子酸1克,再覆上一層脫脂棉,在脫脂棉上滴加I0%的氫氧化鈉1毫升,然后將接種好的平皿籠罩在翻轉(zhuǎn)的蓋上,快速用蠟封固,置37℃溫箱中培養(yǎng)2-4天,觀看結(jié)果。接種的培養(yǎng)基假如是試管,可取大試管一支,底部放焦性沒(méi)食子酸2克,并加玻璃珠10多粒,將培養(yǎng)基試管放在玻璃珠上,再沿大試管壁滴加10%氫氧化鈉溶液2毫升,將大試管口用橡皮塞塞緊,置37℃溫箱中培養(yǎng)。
③厭氧肝片肉湯接種:因肝片或肉渣內(nèi)含有谷胱甘肽,可發(fā)生氧化反應(yīng)而降低環(huán)境中的氧化勢(shì)能,以利于厭氧菌的分別。接種辦法是用接種環(huán)鉤取病料,接種于培養(yǎng)基中,在37℃溫箱中培養(yǎng)2-4天,觀看結(jié)果。
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