41 轉(zhuǎn)基因果蠅模型的建立

實(shí)驗(yàn)!1!轉(zhuǎn)基因果蠅模型的建立41.1實(shí)驗(yàn)原理1981年，科學(xué)家構(gòu)建出帶有控制眼睛顏色基因的轉(zhuǎn)座子iyl,注射到果蠅胚胎后，發(fā)育出的果蠅眼睛的顏色為野生型，這表示轉(zhuǎn)入的基因己在體內(nèi)表達(dá)。這一性狀隨果蠅繁殖保留了卜來(lái)。隨著第一只轉(zhuǎn)基因果蠅誕生，轉(zhuǎn)基因果蠅已經(jīng)成為研究廣范的生物學(xué)問(wèn)題和現(xiàn)象的一種技術(shù)了。實(shí)際上，任何克隆基因可以用P轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)插入到基因組中。轉(zhuǎn)基因果蠅是指用實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入的方法使外源基因在果蠅的染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，然后遺傳給后代的果蠅。實(shí)際上，注射的DNA由兩部分組成。一部分是含有缺陷型P因子的輔助質(zhì)粒，它雖然能夠產(chǎn)生P因子轉(zhuǎn)座酶，能夠幫助P因子轉(zhuǎn)化，但是它本身不能移動(dòng)；第二部分是P轉(zhuǎn)座子構(gòu)件，由P因子的轉(zhuǎn)座基因與目的基因構(gòu)建而成的重組載體。在沒(méi)有輔助載體的情況下，P因子構(gòu)件是不能轉(zhuǎn)座整合到果蠅基因組中去的。但當(dāng)輔助載體存在時(shí)，它含有的轉(zhuǎn)座酶可以幫助P因子轉(zhuǎn)座，從而使目的DNA（基因）進(jìn)入細(xì)胞核，再伴隨P因子一道轉(zhuǎn)座整合到基因組上：從而可以產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因果蠅。存在于P因子序列之間的可選擇性的標(biāo)記基因（如眼色基因）可用來(lái)檢測(cè)和鑒定轉(zhuǎn)基因果蠅的生成。41.2實(shí)驗(yàn)材料1.質(zhì)粒DNA溶液的準(zhǔn)備1)2)3)溶液I：50nmioVL25nmiol/L10nmiobL在4°C貯存。溶液II0.21)2)3)溶液I：50nmioVL25nmiol/L10nmiobL在4°C貯存。溶液II0.2mol/L1%配制新鮮的。溶液III5moL;L6011.5niL28.5niL葡萄糖Tns-Cl(pH=8.0)EDTANaOHSDSniLKAc冰醋酸水4)3M醋酸鈉，貯存在室溫6個(gè)月或等份分裝置-20°Co2.培養(yǎng)基4)1）葡萄汁平板:30g瓊脂加入1L水，在微波爐里溶解;分別加360niL葡萄汁，2g羥苯甲酸甲酯;30g購(gòu)買的糖，在熱金屬板上攪拌溶解；把葡萄汁加到溶解的糖中攪拌好，倒入100nun的培養(yǎng)皿內(nèi)o2）酵母糊：將干酵母加到水中，直到變成花生醬狀（30g酵母加入50mL水）：加點(diǎn)摩礫層（顏色變成黑色，比花生醬還軟，但在平板上不會(huì)流動(dòng)）。果蠅品系：白眼品系。其他材料和藥品1）購(gòu)買的籃狀型咖啡過(guò)濾器2）酚、氯仿3）鹵經(jīng)油，系列7004）漂白劑（次氯酸納）5）EB染液6）乙醇7）TAE8）異丙醇9）雙面膠，12nun寬10）塑料大口杯11）注射用玻璃毛細(xì)管12）銀子13）pMD18-T和pUAST載體14）DNA分子量標(biāo)記15）PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA純化試劑16）柱式質(zhì)粒純化試劑盒4.儀器倒置顯微鏡、體視顯微鏡（圖41-1）、拉針儀、微量移液器、轉(zhuǎn)基因儀、顯微操作器、低溫高速臺(tái)式離心機(jī)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、SHINADZU電子天平、HX-1050恒溫循環(huán)器、超凈工作臺(tái)、X-90型暗箱式紫外透射儀、THZ-82B氣浴恒溫振蕩器、YY-III-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYY-III型電泳槽、微波爐、XK96-A快速混勻器、GBII240-89不銹鋼電熱恒溫水浴鍋、TGR16-12高溫冷凍離心機(jī)、血sc。離心機(jī)、超純水純化儀41.3實(shí)驗(yàn)方法1.DNA的制備1）目的基因片段的獲得：（1）.通過(guò)PrunerPreimer5.0程序設(shè)計(jì)引物序列，并引入EcoRI酶切位點(diǎn)：PCR擴(kuò)增目的片段后純化；（2）連接到pMD18-T±o具體連接反應(yīng)如下：pMDBTl匹，PCR產(chǎn)物5匹，連接溶液16ML,16°C連接過(guò)夜；（3）構(gòu)建好的pMD18-T一目的基因的轉(zhuǎn)化：將100匹的感受態(tài)細(xì)胞（DH-5a）加入10pL的pMD18-T目的基因連接子中，置冰上30min；42°C30-90s熱休克；迅速冰上冷卻3~5min；加入1niLLB液體培養(yǎng)基（未加抗生素），37°C搖床1h；3000rpm離心2min,去700pL上清，：剩下菌液混勻，取出150卜iL涂布在37笆預(yù)熱含氨茉青霉素的平板培養(yǎng)基上,剩余菌液4°C保存；倒置平板，于37°C培養(yǎng)，12h可出現(xiàn)菌落（4）pMD18-T目的基因陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定隨機(jī)挑選單個(gè)菌落于含氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基（lOOpg/mL）中，37°C搖床培養(yǎng)15h左右，小量制備質(zhì)粒DNA,瓦wRl和Ps/I酶切鑒定是否含插入片段。分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度，設(shè)計(jì)酶切反應(yīng)體系是：EcoRl與Psfl各1匹，RNase0.5匹，10XHBuffer2pL,質(zhì)粒DNA1pL,超純水15.5將反應(yīng)液成分按以上比例加入EP管中，混勻，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中酶切過(guò)夜，次口電泳點(diǎn)樣檢查。（5）.pMD18-T-目的基因質(zhì)粒的酶切、目的片段的純化回收用EcoRl酶切pMD18-T-目的基因10匹質(zhì)粒,將反應(yīng)液成分按以上酶切鑒定的比例加入EP管中，混勻，于37°C恒溫培養(yǎng)箱放置過(guò)夜，次口用合適濃度的瓊脂糖凝膠，60V電壓2-3h電泳，以使目的DNA片段和其它DNA片段盡可能分開，切下所要回收的瓊脂塊。用純化試劑盒回收。2）pUAST重組載體的構(gòu)建（1）用EcoRI酶切pUAST質(zhì)粒，反應(yīng)體系如下：EcoRl20pL,10XHBuffer20pL,質(zhì)粒DNA40pL,超純水120pL,總體枳200pL。將反應(yīng)液成分加入EP管中，混勻，于37°C恒溫培養(yǎng)箱放置過(guò)夜，點(diǎn)樣3pL檢查，確認(rèn)質(zhì)粒完全切開；（2）去磷酸化：反應(yīng)體系如下：CIAP6pL,AlkalinePlusahataseBuffer40|.iL,質(zhì)粒DNA197pL,超純水157pL,總體枳200將反應(yīng)液成分加入EP管中,混勻，于水浴50°C放置30mm；（3）加入酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提一次，吸上清；（4）加入三氯甲烷抽提兩次，吸上清；（5）加入0.1倍體積3MNaAc和三倍體枳的無(wú)水乙醇：（6）-20°C放置30min；（7）12000rpm離心15-20min,棄上清,空氣干燥;加入10|1L超純水，-20°C保存；載體pUAST和目的基因的連接，連接的方法和比例參照1.1).(2);pUAST-目的基因連接子的轉(zhuǎn)化，方法同1.1).(3);pUAST-目的基因陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定，方法同1.1).(4);pUAST-目的基因質(zhì)粒的大量制備挑取連接正確的菌種加入500niL的液體培養(yǎng)基中，放入37°C搖床培養(yǎng)約16小時(shí)；EP管中加50mL菌液，6000rpm離心2min,棄上清，重復(fù)一次；加入溶液I4mL,重懸打散；加入溶液II8mL,顛倒5-10次，冰上放置小于5min；加入溶液III6mL,顛倒5-10次，冰上放置5T0null；4000rpm離心10mm4°C吸上清轉(zhuǎn)管，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),混勻，4000ipm離心5inin:吸上清轉(zhuǎn)管，加入等體積三氯甲烷，混勻，4000rpm離心5min：重復(fù)一次；吸上清轉(zhuǎn)管，加入0.7倍體枳的異丙醇沉淀，6000rpm離心15nwi;棄上清，加入1mL70%酒精，4000rpm離心5min；棄上清，干燥2h；加入500匹滅菌ddH2Oo放入65笆水浴鍋中30min使DNA酶失活加入RNase放入37°C培養(yǎng)箱中消化過(guò)夜；點(diǎn)樣2卜(L檢查濃度。2.胚胎的制備受體果蠅系是yw(yellowwhite-通常用yDf(1)"和為，一*個(gè)不能自動(dòng)恢復(fù)的缺少白色的品系)°在注射前的至少2d收集約200只羽化的果蠅(2?3d)到籠子里；用有酵母糊的葡萄汁板封閉敞開的一端，按時(shí)間規(guī)律飼養(yǎng)果蠅，至少一天換兩次葡萄汁板。用小皿來(lái)收集胚胎；當(dāng)收集用來(lái)注射的胚胎時(shí)，每30nun換一次平板。丟棄前兩次的收集物，以消除陳舊胚胎的污染；將帶有胚胎的葡萄汁平板自然風(fēng)干5nun,同時(shí)，準(zhǔn)備幾個(gè)用來(lái)注射的蓋玻片；在蓋玻片的一端邊緣貼一塊大約1cm寬的雙面膠；用毛筆或小鐵幺幺輕輕地將葡萄汁平板上的果蠅胚胎排到蓋玻片的雙面膠上；用細(xì)尖銀子輕推胚胎的腹部或側(cè)部，使胚胎按照固定的方向整齊排列。排列時(shí),胚胎的后端向外，前端向內(nèi)。如下圖所示。

針頭方向后面前面蓋玻片針頭方向后囪鹵姓油前面蓋玻片圖41-2胚胎在蓋玻片上的排列。等胚胎干燥后，在上而覆蓋一層鹵燃油，厚度要適中。針頭方向后面前面蓋玻片針頭方向后囪鹵姓油前面蓋玻片要保證在玻片上排列胚胎的時(shí)間最多2.3min,然后繼續(xù)干燥和注射，因?yàn)槿绻麜r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，胚胎脫水將變化太大。8）胚胎排列到玻片上后，須經(jīng)室溫干燥胚胎，然后用鹵燃油覆蓋（如圖41-2）。干燥可能是影響成活率的關(guān)鍵因素。在注射開始時(shí)，要測(cè)定幾塊玻片的胚胎材料來(lái)確定它的干燥時(shí)間（如3,4或5min,這時(shí)間要依據(jù)環(huán)境的溫度和濕度而定）。如果卵黃膜被注射針尖推凹，不能立即返回到它的起始形狀，是胚胎太干燥了。如果針尖很順利的刺入胚胎，但是細(xì)胞質(zhì)在針尖進(jìn)入后立即流出，表明胚胎太濕了。干燥時(shí)間似乎與溫度更加有關(guān)，一般是25°（2下4?51皿或24°C下5?6min.針頭的準(zhǔn)備1）可用任何型號(hào)的拉針儀，用1O-|1L的玻璃毛細(xì)管加熱拉制針頭。也可以買拉好的針頭；2）在正常情況下，需要將針頭尖折斷，使口徑達(dá)到2?4Fun,具體做法是：用一根精細(xì)的鈣針將其折斷，或者在針頭安到顯微操作儀上后，將針頭在顯微鏡蓋玻片的邊上壓，以此折斷針頭；3）要將針頭灌液時(shí)，可以將一小滴注射液滴在固定于載玻片上的石蠟?zāi)ど希棵饔贸錆M針頭。也可以在針頭的大口接上一個(gè)吸頭；4）灌注好的針頭可以將其針尖插入到油中保存起來(lái)。注射因?yàn)樽⑸浔仨氃跇O細(xì)胞形成之前，所以最好用收集一個(gè)小時(shí)的胚胎。也可以用一個(gè)半小時(shí)后的，但通常有很多老胚胎，這些老胚胎在注射過(guò)程中通常會(huì)被針尖破壞。為了避免胚胎體阻礙針尖，要記錄過(guò)期胚胎的位置并在注射后用銀子移開它們。1）拉針：針頭應(yīng)該要提前準(zhǔn)備，需要準(zhǔn)確調(diào)整微移。插入的毛細(xì)管必須足夠小以致小到用肉眼看不見(jiàn)。針頭的延伸部分（插入后的一半）應(yīng)該有1cm長(zhǎng)。用拉針儀拉制大小和長(zhǎng)度均合適的注射針；2）目的DNA溶液的轉(zhuǎn)移：用微量移液器將目的DNA溶液轉(zhuǎn)移至注射玻璃針內(nèi)。3）破針：簡(jiǎn)單的方法是將玻璃注射針的的針尖貼在蓋玻片的邊緣，輕輕移動(dòng)，直到看到液滴出現(xiàn)。液滴大小合適，說(shuō)明針尖大小合適：4）把玻璃注射針的末端與程控注射儀相連，以保證針管內(nèi)的溶液可以通過(guò)壓力被推進(jìn)胚胎。同時(shí)，玻璃注射針必須固定在顯微操縱器上，以便它能夠三維移動(dòng);5）裝上排有去卵殼的胚胎玻片，使胚胎后部朝向針頭；6）在顯微鏡下聚焦，然后移動(dòng)平臺(tái)使胚胎的邊緣剛好與針尖接觸，注射；胚胎蓋玻片（邊緣）圖41-2圖示為果蠅胚胎注射。注意要趕走氣泡，以免細(xì)胞質(zhì)從胚胎里漏出來(lái)。7）在注射過(guò)程中，針頭應(yīng)該很順利的插入。在大部分裝置上，是移動(dòng)平臺(tái)而不是顯微操縱器。然而為了在垂直水平排列有胚胎的針頭，要上下移動(dòng)顯微操縱器。針頭應(yīng)該插入背部尾端，那里是極細(xì)胞形成的地方；8）把胚胎放到針頭（針端應(yīng)該在聚焦區(qū)）來(lái)確定針頭接觸哪里，如必要的話，用顯微操縱器調(diào)整針頭的高度；9）當(dāng)針頭接觸到預(yù)期的點(diǎn)，稍微快速穩(wěn)定地移動(dòng)平臺(tái)來(lái)插入針頭，使針頭快速順利插入；10）拉回胚胎使針尖盡可能接近卵黃膜，然后釋放壓力注射DNAo注射足夠多以致于在細(xì)胞質(zhì)中流動(dòng)，但不要太多而在拔出針頭時(shí)細(xì)胞質(zhì)流出。通過(guò)移動(dòng)平臺(tái)再重復(fù)一次。有時(shí)，針頭從注射的胚胎中拔出時(shí)被殘骸堵塞。就必須對(duì)針頭進(jìn)行疏通，可以通過(guò)在玻片的邊緣接觸，也可■以通過(guò)利用壓力和觀察溶液的出現(xiàn)測(cè)試恢復(fù)端。當(dāng)然，再次破壞可能會(huì)導(dǎo)致針尖太寬影響注射成功，需要用新針頭。11）注射后，胚胎應(yīng)該保存在濕環(huán)境，25°C下22h以上或18°C下3611以上；12）胚胎孵化后，用解剖針收集，把它們輕輕地放入食物小瓶的表面。當(dāng)用瓊脂食物時(shí)，表面應(yīng)該是軟的濕潤(rùn)的，用解剖針在上面劃線再加一滴水。4.雜交1）分離在1天中涌現(xiàn)的成蟲果蠅，阻止它們自交。為了建立獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系，高效的方法是用含有四個(gè)標(biāo)記性狀的雙平衡品系與注射過(guò)的成蟲做單對(duì)雜交（如w/w：CyO/Sco：TM3,D）；2）觀察下一代的w+轉(zhuǎn)化珠。盡管出現(xiàn)隱性致死染色體，這種雜交也不會(huì)明顯減少與野生型相關(guān)的能繁殖的轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生；3）每個(gè)轉(zhuǎn)化果蠅與單個(gè)的平衡系（如yw/yw：CyO/Sco；+/+：或yw/yw；+/+：TM3/D）雜交，根據(jù)與顯性有關(guān)的眼色的分離來(lái)確定轉(zhuǎn)基因在哪條染色體上。這種雜交也促進(jìn)獨(dú)立系的建立。例如，如果轉(zhuǎn)基因被證明是在第二條染色體上，P[w+]/CyO平衡系是因?yàn)镃yO系的雜交的結(jié)果。對(duì)于這種雜交，雄性轉(zhuǎn)基因果蠅更可取，因?yàn)樗鼈兺ǔ．a(chǎn)生更多的后代而不必從同胞中分離出來(lái)，仍然是原始的。如果許多轉(zhuǎn)基因系來(lái)自小瓶，就有可能從單個(gè)注射的母本中得到不止一種的獨(dú)立系。然而，如果是這樣的話，在個(gè)體中就會(huì)增加多個(gè)插入的可能性，這是不期望的；4）從單個(gè)注射母本中取三個(gè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體，分別與單個(gè)平衡系交配，通常就能確保有可育系，尤其當(dāng)它們是雄性時(shí)。所以，一旦從瓶中得到了三個(gè)轉(zhuǎn)基因果蠅，一般就不用再搜索了。5.成功率1）得到轉(zhuǎn)基因果蠅的效率與注射的質(zhì)粒大小有關(guān)。得到類似的轉(zhuǎn)化效率所用的質(zhì)粒大小范圍是12?22kb。平均孵化率是40?70%,羽化（從孵化的胚胎）率是60?80%,然而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅（從注射過(guò)的胚胎）的效率是5?20%。通常注射40?50個(gè)胚胎，可以得到5個(gè)或更多的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系。2）在不同的系里，眼色表現(xiàn)型依據(jù)轉(zhuǎn)基因在染色體上的插入位點(diǎn)而變化：眼色從微黃到橘黃或紅色。這些小白眼表達(dá)的不同水平經(jīng)常與臨近的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平有關(guān)。3）有時(shí)轉(zhuǎn)化效率比預(yù)期的要低好多。實(shí)際上，在一些構(gòu)建體中盡管注射了大量的胚胎，但沒(méi)有得到轉(zhuǎn)基因果蠅。這可?能是注射的轉(zhuǎn)基因的顯性影響，使可能的轉(zhuǎn)基因果蠅致死或引起不育。有時(shí)，只要減少注射的質(zhì)粒的濃度就能解決這個(gè)問(wèn)題，可能是因?yàn)椴迦肭暗霓D(zhuǎn)基因的表達(dá)是致死或不育的主要原因。4）如果用低濃度（約20pg/niL）注射，問(wèn)題還存在的話，在這種條件下平行注射其他構(gòu)建體?；蛘哂肎AL4系，在這個(gè)系里，轉(zhuǎn)基因放在GAL4UAS以下，導(dǎo)致開始建立的轉(zhuǎn)基因系不會(huì)表達(dá)。這個(gè)轉(zhuǎn)基因然后通過(guò)與激活GAL4表達(dá)的另一轉(zhuǎn)基因品系雜交來(lái)誘導(dǎo)。5）另外一種策略是放一個(gè)含有poly-A信號(hào)的FRT盒于轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子和開放閱讀框中。得到轉(zhuǎn)基因果蠅后，F(xiàn)RT盒能夠通過(guò)介入表達(dá)FLPase（催化兩個(gè)FRT序列的連接，因此移開起抑制作用的poly-A信號(hào)）的轉(zhuǎn)基因而除去。6）如果具有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率低，這種轉(zhuǎn)基因的蛋白產(chǎn)物起抑制作用（如LacZ報(bào)告基因），這可能是轉(zhuǎn)基因的調(diào)控序列抑制附近的小白眼基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因果蠅看不到白眼。如果重新得到轉(zhuǎn)基因品系，它們一般有非常明顯的眼色，整合位點(diǎn)可能接近于小白眼和轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增表達(dá)的地方。發(fā)現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)在小白眼可選擇標(biāo)記基因的啟動(dòng)子上游的Glass結(jié)合位點(diǎn)來(lái)克服。Glass位點(diǎn)增加白眼的表達(dá)，是因?yàn)镚lass蛋白在眼觸角盤狀物（其它含光受體的組織腦內(nèi)的一些細(xì)胞）的感應(yīng)現(xiàn)象，因此盡管有抑制效應(yīng)也會(huì)觀察到轉(zhuǎn)基因果蠅。然而，這種方法也可能增加轉(zhuǎn)基因插入到異染色或其它抑制DNA中的可■能性，這會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的抑制表達(dá)。41.4注意事項(xiàng)幾種可供選擇的收集胚胎的處方。另外一種是用2%的瓊脂，冰醋酸（每100niL2滴）和酒精（每100niL2滴）。當(dāng)瓊脂溶液沸騰再冷卻后加入醋酸和酒精。在使用前，每個(gè)平板加一些烘干的酵母，冰醋酸大部分用Kimwipe擦干；當(dāng)注射過(guò)的胚胎在培養(yǎng)時(shí)，油要注意擴(kuò)散，使胚胎露出脫水。用油筆在雙面膠上劃圈阻止擴(kuò)散。然而，厚層油會(huì)使胚胎致死，所以用適量的油是胚胎稍微露出直到孵化。用更輕的400系列鹵炷油，來(lái)減少厚層油的可能性，但要保持油流動(dòng)就更加困難了；用CsCl梯度或購(gòu)買的柱狀物純化的質(zhì)粒DNA可用來(lái)注射。然而，這些方法有時(shí)產(chǎn)生粘性DNA溶液在針頭形成氣泡，導(dǎo)致注射過(guò)程的障礙。沒(méi)必要用高純度的DNA；高于500pg/niL的DNA濃度會(huì)極大地減少幼蟲的成活率。用低至20pg/mL濃度的DNA,轉(zhuǎn)基因效率高；磷酸緩沖注射液（如，5niMKC1,0.1mMPO『+,pH7.8）通常用來(lái)稀釋注射的DNA。然而，用無(wú)菌去離子水稀釋DNA到終濃度為lOOpg/mL,這不會(huì)明顯地影響幼蟲的成活率和轉(zhuǎn)化的效率；不要將葡萄汁培養(yǎng)皿烘太干，因?yàn)楣壱玫綕駳獠判校闪斯壱膊荒芴傻缴厦?。酵母糊?yīng)該是新鮮配制，在培養(yǎng)皿上延伸約1/4的面積，為收集的果蠅提供食物?；\子每4?5d要換，因?yàn)榛\子干了，果蠅就躺到了表面而不是在收集皿中了。大于12d的就不收集：胚胎收集也可用不含食物的能顛倒的1/2-品脫的玻璃或塑料牛奶瓶，但是要接近收集培養(yǎng)皿（蓋子上有從35nun的培養(yǎng)皿中粘有瓊脂/酵母）。然后，在收集前，100?200條2?10d的成蟲轉(zhuǎn)移到新食物中；一般用次氯酸鈉去卵殼。將水移到平板上，用漆刷輕輕刷表面（刷子是#3,駱駝毛的），將胚胎倒入一個(gè)小收集籃里。用水沖洗再轉(zhuǎn)移到50%次氯酸鈉中2.5mm,斷斷續(xù)續(xù)的攪動(dòng)。用水沖洗在用刷子將胚胎轉(zhuǎn)移到瓊脂糖塊（2%瓊脂，25%糖蜜；用剃刀剪一部分）上。用鐐子將去了卵殼的胚胎排列在瓊脂糖塊上，卵孔挨著糖塊。然后，用紙片的膠端收集胚胎：在前面的注射方法中，建議在18°C下培育。然而，在25°C下不會(huì)降低孵化率和整個(gè)效率。（梁淑媛袁婺州吳秀山）主要參考文獻(xiàn)■MarindiaDepra;LeniraMariaNunesSepel;ElgionLuciodaSilvaLoretoV.Alow-costappaiatusfbrtransformingDrosophilaanddetectinggreenfluorescentprotein(GFP)geneticmarkers.Genet.Mol.Biol.vol.27no.1SaoPaulo2004.Thumiel,C.S.,Boulet,A.M.,andLipshitz,H.D.VectorsforDrosopliilaP-element-mediatedtransformationandtissuecultuietiansfection.Gene,1988,74,445-456.Sainbrook,J.,Fritsch,E.F?,andManiatis,T.MolecularClonmg:ALaboratoiyManual.2nded.ColdSpringHarborLaboratoiyPress,ColdSpringHaiboi;NewYork.1989.Brand,A.H.andPeniinon,N.Targetedgeneexpressionasameansofalteringcellfatesandgeneratingdominantphenotypes.Development1993,118,401-415.Baslei;K.andStnihl,G.CompailmentboundariesandthecontrolofDrosopliilalimbpatternbyhedgehogprotem.Nature,1994,368,208-214.Buenzow,D.E.andHohugen,R.ExpressionoftheDrosopliilagooseberrylocusdefinesasubsetofneitoblastlineagesinthecentralnervoussystem.Devel.Bool.1995,170.338-349.Ellis.M.C.,O'Neill,E.M.,andRubin,G.M.Expressi