基因組測序的原理與方法

大規(guī)?；蚪M測序的

原理與方法胡松年husn@

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!

元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀物理、化學研究和發(fā)展的基礎元素周期表“基因組序列圖”將奠定二十一世紀生命科學研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎！

“基因組”----生命科學的“元素周期表”人體解剖圖奠定了現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的基礎基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!生命的奧秘蘊藏于“四字天書”之中…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!基因組學的基礎理論研究基因組學是要揭示下述四種整合體系的相互關系:基因組作為信息載體

（堿基對、重復序列的整體守恒與局部不平衡的關系）基因組作為遺傳物質(zhì)的整合體

(基因作為功能和結(jié)構(gòu)單位與遺傳學機制的關系)基因組作為生物化學分子的整合體

(基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細胞機制的關系）物種進化的整合體

(物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇）基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!

基因組學是一門大科學基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律、和相互關系。基因組的信息含量高?；蚪M學的研究又在于基因組間的比較?；蚪M學的復雜性必然導致多學科的引進和介入（各生物學科、醫(yī)學、藥學、計算機科學、化學、數(shù)學、物理學、電子工程學、考古學等）。基因組學研究的手段和技術已經(jīng)走在生命科學研究的最前沿。基因組信息來自于高效率和規(guī)?；a(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)。人類基因組計劃證明了基因組研究的迫切性和可行性?；蚪M測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!測序設備的壟斷和高速度換代6199020052020Year2015201020001995Mb1000Mb4000ABI373ABI377ABI3130ABI3730ABI3730xlGA-I

GA-IILessThan5yrsHiSeq1000/2000Mb4500ABI3700ABI3700xlSOLiDSOLiD2SOLiD35500xlSOLiDABI3130xlGA-IIx5500SOLiD基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!大規(guī)?；蚪M測序的幾個支撐技術

Sanger雙脫氧末端終止法

PCR技術

DNA自動測序儀的發(fā)展生物信息學分析軟硬件設施基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!

PCR（聚合酶鏈式反應）原理反應所需物質(zhì)：DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液每個循環(huán)包括：變性（90℃）、退火（54

℃）、延伸（72℃）基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!大規(guī)?；蚪M測序的

兩種策略逐步克隆法（ClonebyClone）全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!

兩種大規(guī)?；蚪M測序策略的比較

項目

策略全基因組霰彈法逐步克隆法

遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜）速度快慢費用低高計算機性能高（以全基因組為單位進行拼接）低（以BAC為單位進行拼接）適用范圍工作框架圖精細圖代表測序物種果蠅、水稻人、線蟲基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!“WorkingDraft”(90%;4X)FinishedGenome(99.99%;8X)Gap1Gap2Chromosome工作草稿（框架圖）與完成圖基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!ThesequenceofthehumangenomeC.Venteretal.Science16Feb.291:1304–1351,2001基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!逐步克隆法（ClonebyClone)物理圖譜的構(gòu)建大片段克隆的篩選霰彈法測序與“工作框架圖”的構(gòu)建序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!物理圖譜的制作——序列標簽位點（STS）作圖

物理圖譜是以特異的DNA序列為標志所展示的染色體圖。標志之間的距離或圖距以物理距離如堿基對（basepair；bp，Kb,Mb)表示。最精細的物理圖是核苷酸順序圖，最粗略的物理圖是染色體組型圖。

STS圖譜是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一，STS（SequenceTaggedSite)本身是隨機地從人類基因組上選擇出來的長度在200～300bp左右的特異性短序列（每個STS在基因組中是唯一的，STS圖譜就是以STS為路標（平均每100Kb一個），將DNA克隆片段有序地定位到基因組上。STS的來源隨機基因組序列表達基因序列，如EST遺傳標記序列，如微衛(wèi)星標記有關STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫GDB中找到基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!關于文庫作為載體的基本要求

能在宿主細胞中進行獨立的復制具有多克隆位點，可插入外源

DNA片段有合適的篩選標記，如抗藥性大小合適，易于分離純化拷貝數(shù)多

文庫的概念

含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體載體：能攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具，常用的載體有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、細菌人工染色體等宿主：能容納外源DNA片段的生物體，常用的有大腸桿菌、酵母等基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!BAC克隆的篩選“STS-PCR反應池”方案篩選種子克隆特定的STS標記

相互間具有重疊片段的BAC克隆根據(jù)STS信息組裝成contig，并定位于基因組上Contig每一個菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!Regionalmapping基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!Minimaltilingpathselectedforsequencing.Regionalmapping基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!

Columnpools

Rowpools

123456789101112第八板第二板Platepools板

platepools，rowpools，columnpools的構(gòu)成

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!sheetofsuperpools,platepools,rowpools,columnpools

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!引物OGG1.52對應sp#27,34,45的plate,row,columnpools的篩選結(jié)果基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!引物OGG1.52的Colony-PCR

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!>20kb~300bpMolecularweightmarkerevery5thlaneBACclones在96深孔板中培養(yǎng)-HindIII完全酶切-1%瓊脂糖凝膠電泳

指紋圖譜法

（WalkingbyFingerprintingdatabase）

挑取靠近空洞的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在FPC數(shù)據(jù)庫中進行比對，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達到延伸目的。基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!contig搭建中克隆的錯位

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!四、CloneIdentification

1、STS-PCR

2、BACendsequencing

3、Fingerprinting

4、FISH

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!霰彈法測序組裝與Finishing基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!ShotgunSequencingI:RANDOMPHASEBacClone:100-200kbShearedDNA:1.0-2.0kbSequencingTemplates:RandomReads基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!ConsensusSequenceGap

LowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!ConsensusSequenceGap

Mis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!ShotgunSequencingIII:FINISHINGHighAccuracySequence:<1error/10,000bases基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!BAC-----453F3’sfinishing>>Sp6<<T7?First4primers1234Allthecontigswalkedhundreds’bpstowardthegaps.453F3’s2600reads12contigsOverlappingBAC-454F24’s200reads+>>Sp6<<T71324abcSecond3primers

1200bp’sAT-rich,(CATATATA)nrepeat.Finally,filledbyusingETsequencingKit.

1240bp’sGC-rich,GC-contentis69.03%;theBAC’sis39.98%.WeuseddGTPKitfillingit.>>Sp6<<T7Completedsequence基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!

TheactualandpredictedfingerprintofR-260J13digestedwithHindIII

Lane1:marker,Lane2:R-260J13digestedwithHindIII,3:thepredicted

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!WholeGenomeShotgun

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!Whatisunderheavenisforall.

SunYat-sen,thefatherofmodernChina

天下為公

/riceDDBJ/EMBL/GenBank:AAAA01000000基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!Contigs:127,550

(N50=6,688bp)Scaffolds:102,444(N50=11,764bp)Quality:546bpatQ20基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!Secondgenerationsequencers4541Solexa3SOLiD5DenovosequencingRNA-seq,Re-sequencingChIP-seq，Meth-seqMetagenomicsDenovosequencingRNA-seqRe-sequencingChIP-seqRNA-seq“known”GenomeNovelgenome(s)Bothtypes基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!SecondgenerationsequencersinBIG測序儀PlatformNumRaw/runlengthSolid4580~100Gb50bpGAII340~60Gb120bp4541400Mb400bpSolid5500xl0150~200Gb50bpHiseq20001200~300Gb100bp高通量測序儀10臺，3730XL測序儀2臺，Sequenom儀器1臺，高性能計算機刀片服務器100余臺，大內(nèi)存服務器4臺，存儲設備約800TB。基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.

Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.

Theresultofconnectingnon-overlappingcontigsbyusingpair-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%oftheassembledsequencecanbefound.基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!RecentwholegenomesequencingprojectsTable.BasicinformationofRrecentlysequencedgenomes.OrganismGenomesizestrategyCoverageContigScafffolds#N50MaxTotal#N50MaxTotalHuman3.0GbSolexa45x2.76M1.5Kb18.8Kb2.18GbNRNRNRNRApple742.3MbSangr+4544.4x+12.5x122,14616,171NR603.9Mb1,629102KbNR598.3Castor320MbSanger4.59x54,00021.1kb190kb324Mb25,828496.5kb4.7Mb350.6MbGrapevine500MbSangr+4547x+4.2x58,61118.2Kb238kb531Mb2,0931.33Mb7.8Mb421MbPanda2.4GbSolexa74x200,60436,728434,6352.25Gb81,4961.22Mb6.05Mb2.30GbStraberry220Mb454+solexa+solid24.5x+6.4x+6.4x16,48728,072215,349202Mb3,2631.44Mb4.1Mb214MbCacoo430Mb454+sanger+solexa16.7x+44x25,91219.8kb190Kb291.44,792473.8Kb3415Kb326.9MbTomato900Mb454+sanger+solexa+solid31x+3.6x+82x+140x110,87255.7kbNR763Mb3,7614.45MbNR782MbPotato840Mb454+solexa+solid11x+106x+0.2x111,18731KbNR683Mb66,301387KbNR727Mb基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!

FlowchartoftheWGSdenovoassemblyGenomicDNADNAfragmentation,constructfragmentedlibrariesGeneratesequencingreadsusing454technologySequencingerrorcorrectionOutputcontigsFillinintra-scaffoldgapsandgetthefinalscaffoldsGenomicDNADNAfragmentation,constructpaired-endlibrarieswithvariantinsertsizesGeneratesequencingreadsusingIlluminaGAtechnologySequencingpre-processOutputcontigsandminiscaffoldsSolexapart454partHybridassemblyandscffolding基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!

SolexareadsprocessRawreadsKmerevaluationSequencingpre-processSoapassemblyAssembledreadsUnassembledreadsUnigenecoverageKmerevaluationSolexamappingNr/NtblastContigstatusAssemblyMappingto454contigHybridscaffoldingCov/Comp基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!ESTUnigeneScafAScafCScafBScafDNewScafABCDESTbasedAssemblyinshortreadsofNGS:ConstructeBIGerScaffording基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!Rawsequencingreadspre-processingIISequencingreadsnumbersDuplicatesdetection,regionaldistributionanalysisandtrimmingAdapterdetectionandtrimmingReadsqualityanalysisandlowqualityreadsfilterAveragequalitydensitydistributionAveragequalitypositionaldistributionregionaldistributionF-RcorrelationGCcontent-qualitycorrelationInsertlengthdistribution

Pipeline基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!ImageanalysisandbasecallingGOATpipeline(OLB1.6),CASAVA基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!FastqandQualitySolexareadsoftheFastqformats_1_1_sequence.txt…@HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1GAGCTGTATATGAATAATAGTTCGTTTTTCATTATCCAAGATGGATCGGTATAAAGTCTGCTAAAATAAAGGTACAACG+HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1fcfcfggdfggggfggggcggggggggfgggggcgggfWgggggggggfgcggdgcgcggggfacbbb][bgcgggggds_1_2_sequence.txt…@HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/2TACCGTTAATAGCAGTAATATCATAATAGTAATAGCATCATAACGGTAGTCCCATAAAAGTGTGTCAGTAGTAGTAGTA+HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/2ggggfgggggd_adcggggeggfggeggegf`geececdegggggfegcfegggegggfgac[aced`bd__\_c[[YbIllumina1.3formatencodesaPhredqualityscorefrom0to40usingASCII64to104errorprobability(p):#forsolexa:p=0.01,Q=19;p=0,05,Q=12.8,p=0.10,Q=9.5;#forphred:p=0.01,Q=20;p=0,05,Q=13,p=0.10,Q=10;基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!LowQualityHighQuality

Trim:3’endtrimifQN<20Filter:Percent(hightqualityQ>30)>60Assessment:DistanceDistrubitionbetweentwoLowquality(Q<20)基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!DataassessmentII–Libraryinsertsize基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!DataassessmentIII–MappingRate基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!DuplicatesdetectionandfilterFRNN2NQaverage>20?基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!AverageReadsperStartPoint基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!GenomesizeestimationusingKmerBeforeestimatingthegenomesize,wesetahypothesis:thek-merwepickedoutfromthegenomecanergodicthewholegenomesequence.AccordingtotheLanderwatermanalgorithm,thealgorithmshouldberepresentedas:

G=Knum/KdepthHere,Gisthegenomesize,Knumisthetotalnumberofk-merandKdepthistheexpecteddepthofthek-mer.Ifweobtaintheexpecteddepthofk-mer,wecancalculatethegenomesize.Becausethedistributionofk-merfrequencyyieldstoPoissondistribution,wecanconsiderthepeakofthek-merdistributioncurveastheexpecteddepthofk-merandcalculatethegenomesize.Note:Atotalof15,437,084,746Kmers,thepeakvalueontherightfigureis8,sothegenomesizeisestimatedas:15,437,084,746/8=1.93G基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!QuestionsGenomesizeestimationmethods(K-mer&Cov)Assemblyoptimization(parameters)Assemblyevaluation(454_SolexaEST)Unmappablesolexareadsreuse(filter->assemble)Scaffoldingparison(ABI&BIG&Bambus&blat)

solexatosolidfeasible?Assemblyassessment(BAC,3730,necessary?)基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!OVERVIEWOFTESTEDASSEMBLERS基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!ESTbasedScaffolding基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!

重復序列注釋流程基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!

基因結(jié)構(gòu)及功能注釋技術路線基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!tRNAscan基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁!miRNApredictionUsingmiRNAdatabasefastaasqueryandblastwithourmaskedscaffolds基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁!GOannotationGenScanuniprotannotationGeneOntology基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁!

基因家族進化分析及比較生物學分析技術路線基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁!基因組學研究成果將走近人類的健康與生活疾病相關基因的發(fā)現(xiàn)、功能的鑒定和分子機制的探討突破常見?。◤碗s疾?。┗蛩降难芯恳曰驗榛A的疾病診斷、預測和預防基因治療與細胞治療治療的結(jié)合以基因多態(tài)性為基礎的“個體化”藥物以基因多態(tài)性為基礎的“個體健康計劃”傳統(tǒng)藥物、生物藥物和“有機藥物”的自然回歸基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁!

走向人類賴以生存的環(huán)境基因組信息記錄了物種億萬年來在環(huán)境變遷中起源和進化的歷史。生物多樣性資源的研究、保護與開發(fā)：地球上估計有1億個物種生態(tài)環(huán)境的研究、保護與開發(fā)：巨大的海洋（占地球總面積71％）廣袤的森林（占地球總面積40％）諸多的湖泊與河流基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁!

基因組學是一個大學科“界門綱目科屬種”，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都有個基因組?；蚪M作為信息載體，它所儲存的信息是最基本的生物學信息之一；既是生命本質(zhì)研究的出發(fā)點之一，又是生物信息的歸宿。基因組學研究包括對基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學研究?；蚨鄳B(tài)性的規(guī)?；芯烤褪腔蚪M多態(tài)性的研究?；蚪M學的研究必然要上升到細胞機制、分子機制和系統(tǒng)生物學的水平?；蚪M的起源與進化和物種的起源與進化一樣是一個新的科學領域。基因組信息正在以天文數(shù)字計算，規(guī)模化地積累，它的深入研究必將形成一個嶄新的學科。基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁!基因組與生命之謎基因組的產(chǎn)生與進化?；蚪MDNA組分的變化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。遺傳密碼的發(fā)生、發(fā)展和進化。內(nèi)含子（尤其是大于100，000核苷酸的大內(nèi)含子）剪出后的運輸和降解。最小內(nèi)含子的生物學意義。動物基因組與植物基因組在基因分布上的共性和個性。物種衍變過程中基因組水平的變化?；蚪M大小變化與遺傳、分子、細胞機制的關系。“JUNKDNA”的發(fā)生、分類、進化與功能?；蚪M測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁!測序設備發(fā)展現(xiàn)狀67代（穩(wěn)定需求）ABi3130xL3730xL3500xL第三代（即將面市）HelicosBiosciencesHelicosGeneticAnalysisSystemPacificBiosciencesRSSystem第二代（高速發(fā)展）RocheGenomeSequencerFLXSystemGSJuniorSystemIlluminaGenomeAnalyzerIIxMiSeqHiSeq1000HiSeq2000LifeTechnologies(ABi)5500SOLiD?System5500xLSOLiD?SystemIon

TorrentPGM?DanaherMotionPolonatorG.007CompleteGenomics無錫艾吉因生物信息技術有限公司AG-100深圳華因康基因科技有限公司Pstar-1中科院北京基因組所/半導體所BIGIS-1BIGIS-4基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第67頁!“雙脫氧末端終止”的含義基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第68頁!Sanger雙脫氧末端終止法測序原理基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第69頁!………ATGCCGTAGGCCTAGCTAGGCCTAGCTCGGA……………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因組DNABAC文庫根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC或contig用于霰彈法測序的候選克隆用于霰彈法測序的亞克隆測序并組裝完整的基因組序列逐步克隆法（ClonebyClone）

全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組DNA

霰彈法克隆測序并進行全基因組序列組裝完整的基因組序列基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第70頁!BACbyBACWholeGenomeShotgun…thesequencingofthehumangenomeislikelytobetheonlylargesequencingprojectcarriedtopletionbythemethodsdescribedinthisissue.MaynardV.Olson,Themaps:Clonebyclonebyclone,Nature409,816-818(2001)基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第71頁!BACbyBAC

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第72頁!人類基因組計劃研究的主要成果和進展表現(xiàn)在這“四張圖”上

遺傳圖譜

又稱為連鎖圖譜（linkagemap），指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離物理圖譜

以定位的DNA標記序列如STS作為路標，以DNA實際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜。轉(zhuǎn)錄圖譜

利用EST（expressedsequencetags

表達序列標簽）作為標記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜序列圖譜

通過基因組測序得到的，以A、T、G、C為標記單位的基因組DNA序列

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第73頁!物理圖譜的制作

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第74頁!物理圖譜構(gòu)建的步驟確定各STS序列及其在基因組中的位置大插入片段基因組文庫的構(gòu)建（BAC文庫）

以特定STS為標記篩選并定位克隆含有STS的克隆在基因組中排序基因組數(shù)據(jù)庫（GDB）中至少含有24568個STS路標信息

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第75頁!BAC文庫的構(gòu)建NotI、SacI脈沖場凝膠電泳得200Kb左右的大片段DNA

純化后與載體連接

電轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物導入大腸桿菌感受態(tài)細胞插有外源DNA片段的BAC載體在含有氯霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)每一個菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第76頁!基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第77頁!Regionalmapping基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第78頁!BeijingMap基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第79頁!共48個每組8個每8個96孔板組成1個superpool，384個96孔板組成48個superpools

48superpools基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第80頁!“STS-PCR反應池”方案（PoolingProtocol）

1234567891011

12超級池（8個96孔板，共768個克隆）板池（96個克?。┬谐兀?2個克?。┝谐兀?個克?。┐蟠鬁p少篩選的工作量，降低成本，所得篩選結(jié)果準確可靠

28

VS

768基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第81頁!

一

BACScreening前48個樣品為引物OGG1.51對superpool(sp)的篩選結(jié)果后48個樣品為引物OGG1.52對superpool(sp)的篩選結(jié)果

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第82頁!BACclone確定

(+為陽性克隆)

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第83頁!延伸克隆的篩選

STS的密度尚未達到繪制高精度物理圖譜的要求，且在基因組中的分布不均勻，造成很多區(qū)域沒有陽性克隆覆蓋,形成空洞。因此需用指紋圖譜（FPC法）或末端序列（WalkingbyEndSequence)步移等手段對種子克隆進行延伸，形成連續(xù)克隆群。利用延伸方法篩選得到的克隆稱為延伸克隆。

Contig1Contig2重疊序列重疊序列延伸引物篩選到的延伸克隆基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第84頁!HindIII完全酶切HindIII完全酶切FPC數(shù)據(jù)庫中比對CloneACloneBCloneCCAB基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第85頁!末端序列步行法（WalkingbyEndSequence）

挑取靠近空洞的種子克隆進行末端測序，然后在基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對，確定專一性的序列片段作為新的STS路標。最后設計新路標的PCR引物，按照STS—PCR“反應池”方案篩選新的克隆，達到延伸的目的?？寺?50A18序列輸入endsequencedatabase的查詢結(jié)果基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第86頁!CK2CK1CK2CK113f06267l16481o07250a15204c23340j13對15個克隆進行HindIII酶切后電泳結(jié)果

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第87頁!“工作框架圖”繪制根據(jù)序列與STSdatabase進行blastn比較結(jié)果，將克隆定位末端序的比較，判定延伸在contig外的一端序列。并可及時進行walking，篩選新的克隆

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第88頁!工作流程圖

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第89頁!ShotgunSequencingII:ASSEMBLYConsensusSequenceGap

LowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第90頁!ConsensusSequenceGap

SingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第91頁!ConsensusMis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第92頁!Consed軟件顯示序列組裝結(jié)果界面

1、Filling“intraclonegaps”基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第93頁!

SequencedcloneBACselectedbyend-sequence113L10324K11173F11101A4167P17586C2116K5572B22544N5R-155E142006P232306M15R-149E1560K?Gapfillingbyendsequences2、Filling“interclonegaps”基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第94頁!克隆211B19組裝后的序列的錯誤率為零

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第95頁!Thisbacteriumhasacirculargenomestructurewith2,689,445basepairs,thesecondlargestoneofthermophilesdecodedpletelytodate.CircularrepresentationofthegenomeofT.tengcongensis

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第96頁!國際一流測序生產(chǎn)線7萬克隆，3000萬堿基/天高產(chǎn)出、低成本：$/bp￥/bp美分/bp分/bp基因組學：數(shù)據(jù)導向的大科學有數(shù)據(jù)才是硬道理世上無難事只要肯登攀基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第97頁!DeNovoSequencingtheGenomeinBIGHuSongnianBeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciencesNextGenerationSequencing(NGS)Technology基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第98頁!1x4545xSOLiD4.02x5500xl3xSOLEXA2xHiseq20003x3730xl1xsequenom1000CPUcores800TBStorage數(shù)據(jù)中心完善的試驗與測序體系和流程強有力的計算、存儲及數(shù)據(jù)庫支持體系成熟的生物信息數(shù)據(jù)處理和分析流程2022/12/9.基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第99頁!測序平臺SOLiDSolexaGA454DNAFragment2-5ug2-5ug2-5ugPair-end2-5ug2-5ugMate-pair5-100ug5-100ug5-100ugRNA轉(zhuǎn)錄組10-20ug10ug10ugSmallRNA10-15ug10-15ugMicroRNA40-50ug40-50ug建庫時間1-2周1-2周1-2天上機時間單向6天雙向12天單向5天雙向10天10小時基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第100頁!GenomeassemblystrategyContigassemblyScafffoldingInternalgapclosinggenomebiology./2010/11/4/R41基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第101頁!基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第102頁!

454readsprocessRawreadsKmerevaluationQ20,removeadaptor,trimSequencingpre-processNewblerassemblyAssembledreadsUnassembledreadsUnigenecoverageKmerevaluationSolexamappingNr/NtblastContigstatusAssemblyHybridscaffolding基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第103頁!longreadsassemblycontigsshortreadsA+C–B–scaffoldingA+B–C–scaffoldsFixgapHybridassembly基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第104頁!Rawsequencingreadspre-processingISignificanceandpurposeSequencinglibraryqualitycontrolSequencingbiasanalysisInheritedprosperitiesoncertainsecondgenerationsequencerGenomesequencingblackholeeffectTranscriptomesamplingandquantificationbiasReadyformappingReadyfordenovoassembly基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第105頁!rawdatapre-process基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第106頁!QualityControlGERALDSummary.htmLaneLaneYield(kbases)Clusters(raw)Clusters(PF)1stCycleInt(PF)%intensityafter20cycles(PF)%PFClusters%Align(PF)AlignmentScore(PF)%ErrorRate(PF)152630597464+/-487887676+/-921975+/-2186.17+/-5.2589.76+/-5.9599.06+/-0.25102.41+/-1.621.30+/-0.22基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第107頁!DataassessmentI–Readqualitydistribution基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第108頁!454dinucleotideproportioncheck454rawreadsquality基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第109頁!Numbersofreadswithnon-insertDNA(fulllengthadapter)indifferentinsertsizelibraries

基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第110頁!SolexaSequencingDataUsagein500bpLibraryDataassessmentIV–Duplicationassessment基因組測序的原理與方法共125頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第111頁!Lanedatausageindifferentsolexalibrary

-Fiterduplicationreads基因組測序的原理與方法共1