動(dòng)物養(yǎng)殖飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定

動(dòng)物養(yǎng)殖飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定是從20世紀(jì)初才有所認(rèn)識(shí)，Thomas(1909)提出了蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值的概念。進(jìn)入20世紀(jì)30年代以后評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至維生素、礦物質(zhì)和氨基酸。20世紀(jì)40年代建立了氨基酸的微生物分析法以及50年代的化學(xué)分析法。以后，隨著化學(xué)、生理、生化、微生物的發(fā)展，分析過程的改進(jìn)和其他相關(guān)科學(xué)的完善，更多地關(guān)注營(yíng)養(yǎng)成分的有效性研究，并推進(jìn)了飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定的發(fā)展和完善。一、粗蛋白動(dòng)物所需要的氮大部分是用于蛋白質(zhì)的合成，飼料里的氮也大都以蛋白質(zhì)的形式存在，因此幾乎全球都是以蛋白質(zhì)來表達(dá)動(dòng)物的氮需要和飼料的氮含量。從化學(xué)上講，飼料中的蛋白質(zhì)含量是根據(jù)多次修正的凱氏定氮法測(cè)定的飼料氮計(jì)算出來的。用凱氏法測(cè)定的氮，除了蛋白質(zhì)中所含氮外，還包括其它一些含氮化合物所含的氮，如硝酸鹽、亞硝酸鹽以及一些環(huán)狀含氮化合物。在根據(jù)含氮量計(jì)算蛋白質(zhì)時(shí)，有2個(gè)假設(shè)：所有的飼料氮都是以蛋白質(zhì)的形式存在，所有的蛋白質(zhì)均含16%的氮，而實(shí)際上這2個(gè)假設(shè)均不完全成立（表3～4）,因此，這樣計(jì)算的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)上稱為“粗蛋白”。二、可消化粗蛋白粗蛋白雖然提供了飼料中的氮含量，但幾乎不知它能否被動(dòng)物利用。飼料蛋白質(zhì)在變成對(duì)動(dòng)物有用的化合物之前都必須經(jīng)過消化和降解，使復(fù)雜的蛋白質(zhì)變成簡(jiǎn)單、可吸收的氨基酸，因此，在很長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)，可消化蛋白質(zhì)作為評(píng)定單胃動(dòng)物飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)之一?？上鞍踪|(zhì)可以由消化實(shí)驗(yàn)來測(cè)定氮的消化率。由于盲腸微生物能利用部分沒有被動(dòng)物消化和吸收的食糜中的氮，而且大腸吸收的氮對(duì)動(dòng)物幾乎無營(yíng)養(yǎng)意義，因此，用回腸末端的氮消化率能更準(zhǔn)確地反映飼料的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。三、飼料氨基酸含量對(duì)單胃動(dòng)物而言，蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值因其所構(gòu)成的氨基酸的種類和結(jié)合狀態(tài)不同而異。特別是必需氨基酸的含量對(duì)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響很大。如果必需氨基酸的含量不能滿足家畜的需要，則其蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就低。因此飼料氨基酸含量的分析在現(xiàn)代飼料工業(yè)中具有十分重要的意義。氨基酸分析的常用方法有以下3種：（一）高效液相色譜（HPLC）法高效液相色譜技術(shù)是目前用于氨基酸分析的常用技術(shù)。許多學(xué)者對(duì)柱前、柱后的衍生條件進(jìn)行了大量研究，并在此基礎(chǔ)上建立了不同的分析程序，如柱后鄰苯二甲醛（OPA）法、丹磺酸（DNS）法及PITC法。表3～4含氮量轉(zhuǎn)換成粗蛋白的系數(shù)（引自McDonaldP.2002,AnimalNutrition,6thedition）飼料蛋白源含氮量（g/kg）轉(zhuǎn)換系數(shù)棉籽大豆大麥玉米燕麥小麥雞蛋肉奶188.7175.1171.5160.0171.5171.5160.0160.0156.85.305.715.836.255.835.836.256.256.38（二）亞二硫基二乙酸（DTDGA）保護(hù)法測(cè)定半胱氨酸測(cè)定蛋白質(zhì)和多肽中氨基酸的組成，絕大部分均是采用了6mol/LHCl、110℃水解24h傳統(tǒng)方法。然而這種傳統(tǒng)方法在精確測(cè)定蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）時(shí)卻遇到了困難，因?yàn)楹虬被嵩谒峤獾倪^程中均不同程度地遭到破壞。近十年來，含硫氨基酸越來越受到營(yíng)養(yǎng)學(xué)家(包括人類營(yíng)養(yǎng)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng))的重視，因此，研究含硫氨基酸分析測(cè)定方法的人越來越多。目前，含硫氨基酸的測(cè)定方法大致有2類：一類是過甲酸氧化法；另一類是二硫化物類試劑保護(hù)法。過甲酸氧化法把胱氨酸和半胱氨酸轉(zhuǎn)化成磺基丙氨酸，雖然測(cè)定了半胱氨酸，但過甲酸使甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成了砜，酪氨酸也被破壞(Hoogerheideetal.，1992)。Barkolt等（1989）提出用二硫化物類試劑作為保護(hù)試劑，如亞二硫基二丙酸、亞二硫基二丁酸等。二硫化合物與半胱氨酸可形成穩(wěn)定的衍生物，并且仍可與發(fā)光衍生試劑反應(yīng)，供儀器檢測(cè)。用亞二硫基二乙酸作為保護(hù)劑，二乙酸的碳鏈短，既不影響衍生物的穩(wěn)定性又可以縮短分析時(shí)間。使用氨基酸分析技術(shù)的柱前PITC衍生，高效液相色譜分離測(cè)定，可以快速、準(zhǔn)確的分析半胱氨酸、甲硫氨酸和所有的氨基酸。四、氨基酸的有效性已有多種可測(cè)定飼料中氨基酸利用率的方法,通常不采用單一的方法來進(jìn)行測(cè)定。為方便起見將這些方法分為三大類:體外法、間接體內(nèi)法和直接體內(nèi)法.（一）體外法此方法的目的是通過對(duì)飼料的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)來估計(jì)動(dòng)物可利用氨基酸的含量。體外法有3種形式：化學(xué)法、酶法和微生物法。1．化學(xué)分析法這種方法多用于測(cè)定賴氨酸的利用率。前提條件是賴氨酸的胺基必須是游離狀態(tài)，以確保賴氨酸的生物利用率。最原始的方法是用賴氨酸與1-氟，2，4-二硝基苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene，F(xiàn)DNB）反應(yīng)，這種方法后來得到了改進(jìn)。也有使用不同試劑的其它方法，如2，4，6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzxenesulfonicacid,TNBS），還有基于染料（如酸性桔12，acidorange12）被蛋白質(zhì)吸收的簡(jiǎn)易方法。雖然同一種飼料的許多樣品的化學(xué)檢測(cè)方法可能有異，而且可能在質(zhì)量控制上起作用。然而，并不鼓勵(lì)直接用動(dòng)物檢測(cè)氨基酸利用率與化學(xué)方法檢測(cè)之間的結(jié)果比較。Batterham等用化學(xué)方法和豬的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)同一飼料的賴氨酸利用率的估計(jì)做了一系列的實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)表明化學(xué)估計(jì)和用豬做實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)沒有相關(guān)性。對(duì)谷類飼料中賴氨酸利用率進(jìn)行的類似比較，也發(fā)現(xiàn)化學(xué)和生物學(xué)估計(jì)的結(jié)果之間沒有相關(guān)。用FDNB和TNBS法及雞生長(zhǎng)鑒定法測(cè)定了幾種魚粉、肉骨粉、羽毛粉和動(dòng)物毛粉（hairmeal）中賴氨酸的利用率。雞生長(zhǎng)法結(jié)果與FDNB-賴氨酸和TNBS-賴氨酸之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.83和0.90。2.酶法有人建議用模擬腸道內(nèi)酶消化的體外測(cè)試法。有幾種酶（包括胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）曾被實(shí)驗(yàn)過。一致認(rèn)為該法最大的弊端是很難確定一種酶或酶復(fù)合物真正模擬了體內(nèi)混合酶的反應(yīng)，而且這些酶是否對(duì)各種飼料都有效也很難確定。體外酶消化的終產(chǎn)物包括氨基酸、不同長(zhǎng)度的肽和未被消化的蛋白。3.微生物評(píng)定法曾經(jīng)是飼料中氨基酸含量測(cè)定的基本方法，也被用來估測(cè)氨基酸利用率。這種方法是基于微生物的生長(zhǎng)對(duì)所研究的氨基酸有特別需求，用作實(shí)驗(yàn)的微生物是細(xì)菌（Streptococcuszymogenes）和原生動(dòng)物(Tetrahymenapyriformis)。由于微生物法測(cè)定氨基酸利用率存在許多理論和實(shí)際中的困難，至今很少用它。通常體外測(cè)定法為加工工藝對(duì)氨基酸利用率的影響提供有用的資料，特別是加熱過程對(duì)賴氨酸的破壞。但是，用體外法測(cè)得的數(shù)據(jù)來作為飼糧配方的依據(jù)并沒有得到認(rèn)可。關(guān)于體外法的更詳細(xì)的資料可參考Carpenter(1973)和Sibbald(1987)的綜述（二）間接體內(nèi)法用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定氨基酸生物利用率很顯然比單獨(dú)在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行更理想，但是，用動(dòng)物來直接測(cè)定既費(fèi)時(shí)、成本也高，因此設(shè)法用間接法來測(cè)定氨基酸利用率。有兩種這樣的方法，一種是用血漿氨基酸濃度來測(cè)量，另一種是通過測(cè)量氮的消化率來測(cè)定。自從Richardson等(1953)和Dentors和Elvehjem（1954）所做的實(shí)驗(yàn)以來，就已清楚地知道動(dòng)物血液中的氨基酸濃度受飼糧水平的影響，而且用血漿中限制性氨基酸的濃度來估計(jì)家禽和豬的氨基酸需要已完全得到了應(yīng)用。有人曾提議用血漿中氨基酸濃度的改變來估計(jì)飼料中氨基酸的利用率，不過這種方法沒有得到更全面的改進(jìn)，主要是由于有多種因素在制約著血漿中氨基酸濃度。而且，進(jìn)行血漿氨基酸濃度分析有許多困難，還有經(jīng)費(fèi)問題。如果單個(gè)氨基酸的消化率和總的蛋白質(zhì)消化率之間有密切的相關(guān)，那么通過氮的消化率的測(cè)量對(duì)氨基酸利用率進(jìn)行預(yù)測(cè)，為間接體內(nèi)法提供了方便的途徑。在一些實(shí)驗(yàn)中，曾報(bào)道過某些氨基酸的利用率與氮消化率之間存在一定的相關(guān)，但這種方法仍有局限性。（三）直接體內(nèi)法1．氨基酸消化率許多研究者著力于利用飼料中可消化氨基酸水平來配制飼糧。腸道后段的微生物發(fā)酵改變了流入糞中的氨基酸，從而導(dǎo)致氨基酸在腸道的損失（或合成）。這樣并不利于動(dòng)物體內(nèi)的氨基酸營(yíng)養(yǎng)作用。因此，通過比較飼糧攝入和糞中排泄來測(cè)定消化率不能很可靠地估計(jì)飼料中對(duì)動(dòng)物有用的那部分氨基酸。微生物降解說明了有大量的氨基酸從后段損失掉，與糞中消化率相比，回盲段消化率更具營(yíng)養(yǎng)意義。在大部分實(shí)驗(yàn)中，回盲消化率值比糞消化率值低，這說明糞消化率過高地估計(jì)了飼料來源的糞中氨基酸值。以飼料攝入和糞尿中排出直接比較測(cè)定的消化率受糞尿中內(nèi)源物質(zhì)的影響。由于那些具有蛋白質(zhì)特性的消化酶和脫落到消化道的粘膜上皮細(xì)胞，因此，包括氨基酸在內(nèi)的內(nèi)源性含氮物質(zhì)大量存在。為盡可能減少這些內(nèi)源性排泄物對(duì)消化率測(cè)定數(shù)據(jù)的影響，將糞中這部分內(nèi)源氮扣除掉，所得的消化率叫真消化率。估測(cè)內(nèi)源氨基酸的方法之一就是在動(dòng)物飼喂無氮飼糧時(shí)測(cè)定其糞中的氨基酸的損失，但是內(nèi)源損失受飼糧攝入量和種類的影響。例如，CraigandBroderick(1981)在鼠中發(fā)現(xiàn)每消耗1kg干物資，相應(yīng)的內(nèi)源氮損失為1.84g。另一種方法就是找出糞氮（氨基酸）損失與蛋白質(zhì)（或氨基酸）攝入之間的回歸關(guān)系，這2種方法都不能解析飼糧攝入的蛋白質(zhì)對(duì)分泌到消化道的內(nèi)源蛋白的影響作用。飼料中的每種氨基酸都有4種可能的值來表示其消化率：即糞和回盲的表觀和真消化率。(1)豬回腸氨基酸消化率的測(cè)定由于大腸微生物干擾較大，使測(cè)定值偏高（約10％），故均采用回腸末端收取食糜的方法測(cè)定回腸氨基酸消化率。由于從消化道后段排出的氨基酸對(duì)機(jī)體沒有價(jià)值（Rerat,1978），故必須測(cè)定來自回腸的氨基酸。這就需要在氨基酸流入結(jié)腸時(shí)，用外科瘺管來收集所有的消化液或是消化液樣品。采用這種方法要在回腸后段安裝一個(gè)瘺管，另一個(gè)瘺管安在回腸末端收集已測(cè)量好的回流的消化液樣品。使用的瘺管有凹型和T型2種，凹型瘺管能準(zhǔn)確測(cè)定消化液的流出量，但是，胃腸道的破壞會(huì)影響到小腸的功能。使用T型瘺管時(shí)，在食糜離開回腸時(shí)收集消化液樣品，根本不會(huì)損壞腸道，然而，T型瘺管需要一個(gè)標(biāo)記來測(cè)定流出量。安裝瘺管的動(dòng)物限制在籠子里，一天24h進(jìn)行收集，從30min到120min不等收集到的消化液樣品測(cè)出總的排泄量。取完樣品后，剩余的從末端瘺管流回豬體內(nèi)，比較回腸氨基酸流出量和飼糧氨基酸攝入量可計(jì)算出表觀回腸消化率。這種方法是可行的和有用的，因?yàn)樗@示出了動(dòng)物最小的氨基酸凈損失量。表觀消化率經(jīng)過內(nèi)源損失修正后，得到的真消化率結(jié)果更準(zhǔn)確，改進(jìn)程度視日糧攝入的氨基酸量而定。但是Buraczeuski和Horaczynski(1983)發(fā)現(xiàn)，把蛋白質(zhì)水平從10%提高到20%對(duì)表觀回腸消化率無影響。實(shí)際上大多數(shù)研究已把表觀回腸消化率作為飼料氨基酸利用率的指標(biāo)。Taverner等(1981)測(cè)定了谷物中的氨基酸回腸表觀和真消化率。就賴氨酸而言，3種小麥樣品的表觀值從70%到81%，真消化率值從79%到89%，因此用內(nèi)源氨基酸進(jìn)行修正很少改變它變化的域值。通過外科手術(shù)收集回腸末端食糜的主要方法有：T型管（simpleT-cannulas）、橋式瘺管（Re-entrantcannulas）、回-直腸接合技術(shù)(Ileo-rectalanastomosistechnique)、可移動(dòng)（可操縱）的回盲瘺手術(shù)（Steeredileo-caecalvalve）。每種方法的測(cè)值并無太大的差異，加上氨基酸分析測(cè)定的誤差本身較大，所以很難說哪一個(gè)方法測(cè)值最準(zhǔn)確。目前主要是看哪種方法最簡(jiǎn)便，包括取樣程序和對(duì)術(shù)荷豬的影響。相對(duì)說來，回一直腸吻合術(shù)還較可取，雖手術(shù)麻煩，但糞樣（食糜）收集簡(jiǎn)單，而且可做到樣品有代表性。（2）禽類氨基酸消化率的測(cè)定禽飼料氨基酸消化率的測(cè)定相對(duì)較簡(jiǎn)單，因禽大腸較短，而且主要是盲腸，所以不必安裝屢管，安裝也困難。為減少盲腸的影響，可切除盲腸。關(guān)于切不切除盲腸現(xiàn)有爭(zhēng)議，大多數(shù)飼料切除盲腸與否對(duì)氨基酸消化率無顯著影響，只少數(shù)飼料，如肉骨粉等切除盲腸氨基酸消化率降低。另一些人認(rèn)為盲腸在氮代謝中對(duì)尿中尿酸的二次利用有重要作用；未經(jīng)小腸吸收的氨基酸和短肽也可為盲腸微生物充分利用，因此不宜切除。氨基酸分析儀的測(cè)定值誤差較大，必然會(huì)影響到飼料氨基酸的消化率測(cè)值的準(zhǔn)確性，一次試驗(yàn)測(cè)得的值很難說準(zhǔn)確、可靠，一般取平均值較合理。2.氨基酸真消化率測(cè)定前面所述方法測(cè)定的飼料氨基酸消化率都是指表觀消化率。收集的回腸末端食糜或糞樣中的氨基酸實(shí)際上包括了2個(gè)部分，即飼料中未被消化吸收的殘余和整個(gè)消化道的分泌物、細(xì)胞脫落物等內(nèi)源性的氨基酸等。因此，為了準(zhǔn)確測(cè)定飼料氨基酸的真消化率，就必須正確評(píng)估動(dòng)物的內(nèi)源性氨基酸排泄量。評(píng)價(jià)方法主要有：（1）無氮日糧法和回歸外推法測(cè)定飼料氨基酸真消化率的最為經(jīng)典的方法是Mitchell(1924)建立的無蛋白質(zhì)(氮)日糧法(protein-freediet)。其假定條件是動(dòng)物采食不含任何蛋白質(zhì)的飼糧后，進(jìn)入食糜或糞中的蛋白質(zhì)、氨基酸即為內(nèi)源性的，并且在不同飼糧條件下動(dòng)物內(nèi)源性氨基酸的排泄量和氨基酸組成是相同或相似的。然而事實(shí)上并非如此，隨著動(dòng)物采食蛋白質(zhì)量的增加，其內(nèi)源性氨基酸的排泄亦相應(yīng)增加。Low(1979)指出，動(dòng)物在采食無氮飼糧后，改變了動(dòng)物的代謝而影響內(nèi)源性氨基酸的排泄量。Ozimek等(1985)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物采食無氮飼糧后，胰腺分泌的消化酶減少，分泌的蛋白質(zhì)量亦減少。由于無氮飼糧影響動(dòng)物消化道的分泌和吸收功能，一般認(rèn)為無氮飼糧法低估了豬的內(nèi)源性氨基酸排泄量，即高估了飼料的氨基酸真消化率。為了克服無氮日糧法的上述缺陷，Carlson等(1970)發(fā)明了一種回歸外推法，用以估測(cè)內(nèi)源性氨基酸排泄量。其方法要點(diǎn)是給豬飼喂不同蛋白質(zhì)水平的飼糧，分別測(cè)定糞或食糜中的氨基酸量，然后用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，推算出飼糧蛋白質(zhì)水平為零時(shí)糞或食糜中的氨基酸即為內(nèi)源性氨基酸。該方法雖然考慮了飼糧蛋白質(zhì)含量對(duì)內(nèi)源性氨基酸排泄的影響，但與無氮飼糧法一樣，在計(jì)算飼料氨基酸真消化率時(shí)，仍然存在不同的飼料都扣除同樣量?jī)?nèi)源性氨基酸的問題。另外，Souffrant(1991)經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)采食量與內(nèi)源性氨基酸排泄之間并不存在線性關(guān)系，因此，本方法也難以對(duì)內(nèi)源性氨基酸排泄作準(zhǔn)確估測(cè)。（2）酶解酪蛋白／超濾法Moughan等(1990)針對(duì)上述問題，提出了一種酶解酪蛋白／超濾的新方法來估測(cè)動(dòng)物的內(nèi)源性氨基酸排泄。其技術(shù)原理和過程如下：給動(dòng)物飼喂含酶解酪蛋白(分子量低于8.25×10-21g)的半純合飼糧，然后收集回腸末端食糜，立即通過離心和超濾等方法，將食糜中的大分子蛋白質(zhì)(分子量大于1.65×10-20g)與小分子蛋白質(zhì)(分子量小于1.65×l0-20g)迅速分離開來，大分子量蛋白質(zhì)即為內(nèi)源性的，而小分子量蛋白質(zhì)是飼糧中未被吸收的部分。當(dāng)然內(nèi)源性蛋白質(zhì)也有可能被水解為小分子蛋白質(zhì)，但所占比例很小，可以忽略不計(jì)。Butts等(1991)將該方法應(yīng)用于生長(zhǎng)大鼠的內(nèi)源性氨基酸排泄的測(cè)定，其測(cè)定值高于無氮日糧法，而與15N同位素標(biāo)記法的結(jié)果相當(dāng)。說明該方法在評(píng)估動(dòng)物內(nèi)源性氨基酸排泄上有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。Yin和Mccracken(1996)認(rèn)為，盡管此方法還未見有直接測(cè)定豬內(nèi)源性氨基酸排泄的報(bào)道，但仍不失一種較為有應(yīng)用價(jià)值的試驗(yàn)方法。（3）15N同位素標(biāo)記法目前認(rèn)為15N同位素標(biāo)記技術(shù)是直接測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄最有效方法，而且可用于測(cè)定飼糧成分變化對(duì)內(nèi)源性氨基酸排泄的影響。15N同位素標(biāo)記技術(shù)方法可通過2種途徑進(jìn)行，一是對(duì)飼料蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記；二是對(duì)動(dòng)物的氨基酸庫即內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行標(biāo)記。15N同位素標(biāo)記的飼料非常昂貴而且不易得到，因而限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。這樣，大多利用各種不同的15N同位素標(biāo)記動(dòng)物的氨基酸庫，即使用15N同位素進(jìn)行連續(xù)的靜脈灌注(或稱稀釋)，糞中或食糜中內(nèi)源性氨基酸可以通過同位素的稀釋方法來計(jì)算。在應(yīng)用15N同位素稀釋技術(shù)時(shí)，有3個(gè)必須解決的現(xiàn)實(shí)問題：一是被標(biāo)記的含氮物的選擇；二是15N豐度穩(wěn)態(tài)的判斷；三是前體庫的選擇。最好選擇15N同位素標(biāo)記的各種氨基酸的混合物作為標(biāo)記。但由于價(jià)格昂貴，實(shí)際應(yīng)用中仍然只選擇一種氨基酸進(jìn)行標(biāo)記。作為標(biāo)記物的氨基酸要具有以下的特點(diǎn)：①可以發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用，使標(biāo)記的同位素轉(zhuǎn)移到其它氨基酸中去；②被標(biāo)記處理后不影響采食量；③被標(biāo)記后不影響氨基酸代謝，不會(huì)導(dǎo)致氨基酸的不平衡。Grala等(1998)經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，唯有亮氨酸完全符合上述條件。因此,15N標(biāo)記亮氨酸被普遍選作測(cè)定內(nèi)源性氨基酸的標(biāo)記物。其灌注劑量一般為4.0～40.0mg／kg.d，灌注時(shí)間8～9d以上。在運(yùn)用15N同位素稀釋技術(shù)時(shí)，采樣時(shí)15N的豐度應(yīng)當(dāng)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)?；啬c末端食糜中內(nèi)源性氨基酸中15N的豐度與血清三氯乙酸(TCA)可溶部分中的15N豐度是相似的。但是血清總氮TCA可溶部分中15N豐度存在晝夜變化。而Schulze(1994)指出，15N灌注5～8d后，并在2次飼喂的中間采血，15N豐度的穩(wěn)定狀態(tài)基本可以達(dá)到。內(nèi)源性氨基酸的前體庫包括所有代謝組織，而且主要是全身肌肉組織。因此必須選擇一個(gè)與15N的親和力相似的參照物，來代替前體組織的15N豐度。而這種參照物中15N豐度也可代表回腸末端食糜中內(nèi)源性氨基酸的15N豐度。血清往往是最理想的參照物。（4）高精氨酸法如前所述，15N同位素標(biāo)記技術(shù)是對(duì)內(nèi)源性氮前體庫進(jìn)行標(biāo)記的，以此為基礎(chǔ)區(qū)分回腸食糜中內(nèi)源性氮與飼料中氮。Souffrant(1991)、Schultz等(1991)和Nyachoti等(1997)提出了用高精氨酸標(biāo)記飼糧蛋白質(zhì)中賴氨酸的方法，測(cè)定內(nèi)源性氮的排泄。其工作原理是：在一定條件下將飼料蛋白質(zhì)中的賴氨酸與甲基異脲(methylisourea)反應(yīng)，生成高精氨酸，當(dāng)高精氨酸被吸收后，在肝臟精氨酸酶的作用下，又可很快轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼幔瑫r(shí)釋放出尿素。高精氨酸不構(gòu)成內(nèi)源性氮，所以消化道脫離細(xì)胞以及分泌的消化液中不含高精氨酸，回腸食糜中高精氨酸即為飼料中未被消化吸收的外源蛋白質(zhì)。動(dòng)物對(duì)胍基化飼糧蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)具有相同的蛋白酶分解和吸收能力。Souffrant(1991)的研究表明，豬對(duì)高精氨酸標(biāo)記過的酪蛋白和大豆分離蛋白的回腸吸收率高達(dá)97％，且只有微量(小于0.2％)的高精氨酸由血液進(jìn)入腸腔。Schulze等(1994)指出，高精氨酸法必須使經(jīng)胍基化的高精氨酸在待測(cè)飼料蛋白質(zhì)中均勻分布，才能有代表性，否則影響測(cè)定結(jié)果。如果飼料蛋白質(zhì)中的賴氨酸側(cè)鏈被封閉，特別是經(jīng)美拉德反應(yīng)(Maillardreaction)后封閉時(shí)，賴氨酸側(cè)鏈就不能與甲基異脲反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成高精氨酸。這樣受熱損害的飼料蛋白質(zhì)經(jīng)胍基化后代表性差，從而導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源性氮估測(cè)誤差。3、氨基酸消化率體外測(cè)定技術(shù)如前所述，飼料的蛋白質(zhì)和氨基酸消化率是評(píng)價(jià)單胃動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最為重要的指標(biāo)之一。人們已普遍接受了采用氨基酸回腸末端表觀或真消化率來評(píng)價(jià)豬飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和衡量動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要。然而測(cè)定這些指標(biāo)，很大程度上要依賴荷術(shù)的試驗(yàn)動(dòng)物，這樣測(cè)定的結(jié)果雖然直觀、可靠，但是十分繁瑣并耗資曠時(shí)。因此，尋求一種體外試驗(yàn)方法來估測(cè)蛋白質(zhì)和氨基酸消化率，以此評(píng)價(jià)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就顯得十分必要。體外消化試驗(yàn)一般是盡可能地模擬動(dòng)物消化道環(huán)境條件來進(jìn)行。但是，消化道中的酶是一個(gè)復(fù)雜多變的多酶系統(tǒng)，因此一般情況下酶的活力受各種因素的影響較大。如喂給低蛋白高能量飼糧豬的小腸液中胰蛋白酶及胰糜蛋白酶活力分別為77.2±27.1和5.1±1.9酶活單位／mL，而喂給高蛋白低能量的卻分別為59.4±20.2和6.5±1.9酶活單位／mL。因此，不同的體外試驗(yàn)方法都是在相應(yīng)的嚴(yán)格控制條件下對(duì)體內(nèi)消化代謝過程進(jìn)行模擬而獲得的。(1)兩階段水解法丹麥Boisen等(1994)和法國(guó)Jaguelin等(1994)提出了先用pH值2.0的胃蛋白酶處理，再用胰蛋白酶處理，結(jié)束后用5m120％的磺基水楊酸沉淀未被消化的蛋白質(zhì)，經(jīng)過濾后，由樣品和未消化殘?jiān)坑?jì)算出粗蛋白和氨基酸的體外消化率。雖然測(cè)得的結(jié)果變異系數(shù)（CV=3.8）很低，但體外法和體內(nèi)法測(cè)得的結(jié)果相關(guān)性不強(qiáng)（r2=0.57）。這一方法盡管可以克服采用小腸液酶活不穩(wěn)定的缺陷，但反應(yīng)過程仍然是在封閉容器中進(jìn)行的。(2)活動(dòng)尼龍袋法Sauer等(1989)發(fā)明了一種用半離體的活動(dòng)尼龍袋法測(cè)定了一些飼料的能量和粗蛋白消化率的方法。其過程是：被測(cè)樣品1g左右置于120目的小尼龍袋中，經(jīng)過酸性胃蛋白酶處理4h后從十二指腸瘺管進(jìn)入試驗(yàn)豬的消化道，然后從糞中收集尼龍袋，這樣小腸液中消化酶進(jìn)入尼龍袋而被消化的氨基酸游離出尼龍袋，并且消化環(huán)境完全與體內(nèi)條件一致,因此測(cè)定結(jié)果可以與糞分析法結(jié)果建立比較好的回歸關(guān)系。Yin等(1995)改進(jìn)為試驗(yàn)動(dòng)物在安裝十二指腸瘺管的同時(shí)進(jìn)行回直腸吻合，這樣測(cè)定結(jié)果可與回腸末端消化率建立更好的回歸關(guān)系。但是這種半離體方法仍然需要荷術(shù)動(dòng)物，并非真正的離體測(cè)試方法。另外該方法因?yàn)槟猃埓趧?dòng)物消化道內(nèi)的滯留時(shí)間差異較大，且難以調(diào)控，往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。（3）體外透析管法黃瑞林等(1999)指出，在體外試驗(yàn)的條件選擇上不應(yīng)該刻意追求與體內(nèi)環(huán)境的一致性，而應(yīng)更注重提高體外試驗(yàn)法的精確度和可重復(fù)性。根據(jù)仿生學(xué)原理，在實(shí)驗(yàn)室條件下，樣品先經(jīng)過胃蛋白酶水解，經(jīng)中和后轉(zhuǎn)移至透析管裝置內(nèi)，用胰蛋白酶水解，透析管的透析液可使水解產(chǎn)物及時(shí)透析至管外，最后定量測(cè)定透析液粗蛋白和氨基酸的含量，即可計(jì)算樣品粗蛋白質(zhì)和氨基酸的消失率。其適宜條件是：溫度為35℃，1g(精確至0.0001g)樣品，胃蛋白酶濃度為0.001g／mL，pH值為2.0，水解4h；經(jīng)中和后，轉(zhuǎn)移至透析管內(nèi)，用pH值7.6且濃度為0.0025g／mL的胰蛋白酶水解24h，透析管外以300mL透析液使水解產(chǎn)物及時(shí)透析至管外。黃瑞林等(2000)進(jìn)一步研究表明，可以用透析管體外法的測(cè)定結(jié)果來較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)飼料蛋白質(zhì)和大部分氨基酸的回腸末端消化率。透析管體外法的優(yōu)點(diǎn)在于：每一測(cè)定結(jié)果的變異較小，變異系數(shù)大都在1％～3％之間，符合一般分析要求。并且在可操作性、重復(fù)性和精確度方面優(yōu)于其它體外方法，與回腸末端消化率結(jié)果之間的相關(guān)性很好，因此其回歸模型可靠。五、單胃動(dòng)物的飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)定用可消化蛋白質(zhì)有時(shí)仍不能全面評(píng)價(jià)一種蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因?yàn)槲盏牡鞍踪|(zhì)的利用效率有很大的差異，以下是幾個(gè)常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。（一）蛋白質(zhì)效率比（proteinefficiencyratio,PER）蛋白質(zhì)效率比就是單位重量的蛋白質(zhì)消耗所產(chǎn)生的體增重。常用小白鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。PER=（3～18）（二）凈蛋白沉積（netproteinretention,NPE）用蛋白質(zhì)效率比來評(píng)價(jià)時(shí)，有時(shí)會(huì)因?yàn)閮?nèi)源氮的不同而影響評(píng)定結(jié)果，因而采用一組飼喂無氮飼糧的動(dòng)物來消除差異。相應(yīng)的計(jì)算公式為：NPR＝(3～19)（三）總蛋白值(grossproteinvalue,GPV)用雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。共用3組實(shí)驗(yàn)雞，分別飼喂含蛋白質(zhì)80g/kg的基礎(chǔ)飼糧；基礎(chǔ)飼糧加30g/kg的測(cè)試蛋白質(zhì)；以及基礎(chǔ)飼糧加30g/kg的酪蛋白，然后比較3組動(dòng)物的體增重。單位重量的補(bǔ)充測(cè)試蛋白質(zhì)所導(dǎo)致的額外體增重占單位重量的補(bǔ)充酪蛋白所導(dǎo)致的額外體增重的百分比。用公式表示為：GPV=(3～20)公式中A代表每克測(cè)試蛋白質(zhì)所增加的體增重；?代表每克酪蛋白所增加的體增重。（四）生物學(xué)價(jià)值(biologicalvalue,BV)這是直接衡量飼料蛋白質(zhì)能夠用于合成體組織和體成分的比例?？梢远x為吸收氮沉積在體內(nèi)的百分比。進(jìn)行一次氮平衡試驗(yàn)，測(cè)定尿氮(Un)和糞氮(Fn)，同時(shí)測(cè)定內(nèi)源尿氮(EUN)和代謝性糞氮(MFN)，就可以計(jì)算出生物學(xué)價(jià)值。內(nèi)源尿氮是指經(jīng)尿排泄的動(dòng)物體內(nèi)分泌蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白不可避免的降解和替代所產(chǎn)生的氮。代謝性糞氮是指從糞排泄的非飼料來源的物質(zhì)所含氮，如唾液、膽汁、胃和胰的分泌物、腸道粘膜脫落的細(xì)胞等。BV=(3～21)（五）化學(xué)比分和必需氨基酸指數(shù)測(cè)定了飼料氨基酸含量以后，我們可以比較不同蛋白質(zhì)飼料的品質(zhì)，如了解蛋白質(zhì)飼料的第一限制性氨基酸等。通常比較不同蛋白質(zhì)飼料的品質(zhì)可以計(jì)算其化學(xué)比分（chemicalscore）和必需氨基酸指數(shù)（essentialaminoacidindex）。前者把全卵粉的蛋白質(zhì)認(rèn)為是最理想的蛋白源，以其必需氨基酸組成為基準(zhǔn)，計(jì)算出各種飼料蛋白質(zhì)的各個(gè)必需氨基酸的比率，得出比例的最小值，就把這個(gè)比率稱為化學(xué)比分。例如玉米的最小比率是賴氨酸，只有33%，故玉米的化學(xué)比分就是33。必需氨基酸指數(shù)也和化學(xué)比分一樣，以全卵蛋白質(zhì)的氨基酸為基準(zhǔn)，全面考慮各種必需氨基酸的比率來評(píng)定蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。即以全卵蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量為100,依此求出供試蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量的比率，比率在100以上的一概以100計(jì)算，由這些比率的積，用下式求出必需氨基酸指數(shù)。EAA-Index=(3-22)六、反芻動(dòng)物的飼料蛋白質(zhì)評(píng)定體系在過去很長(zhǎng)一段時(shí)期，反芻動(dòng)物的飼料蛋白質(zhì)評(píng)定常用粗蛋白質(zhì)或可消化粗蛋白質(zhì)為主要指標(biāo)。由于粗蛋白質(zhì)含有不同數(shù)量的非蛋白氮，故也曾經(jīng)使用真蛋白，但這樣就完全忽視了非蛋白氮的營(yíng)養(yǎng)作用?？上鞍踪|(zhì)曾廣泛用于評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但目前基本上不用，其原因主要是瘤胃微生物的蛋白質(zhì)降解和合成作用。瘤胃微生物負(fù)責(zé)寄主動(dòng)物的能量供應(yīng)，主要通過將飼糧碳水化合物轉(zhuǎn)換成乙酸、丙酸和丁酸。為了完成這一使命，微生物必須生長(zhǎng)和繁殖，這就必然有大量的微生物蛋白質(zhì)合成。而這些蛋白質(zhì)合成的氮來源主要是來自飼料蛋白質(zhì)降解后生成的氨基酸、多肽和氨。作用于飼糧結(jié)構(gòu)性碳水化合物的細(xì)菌只利用氨，而作用于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的細(xì)菌，其氮來源65%是氨基酸和多肽，其余35%是氨。近年來評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值常用的指標(biāo)有飼糧氮的降解率和可代謝蛋白質(zhì)等。（一）飼糧氮的降解率飼糧氮可以根據(jù)其在瘤胃的可降解性分為快速可降解部分、可降解部分和不可降解部分（表3-6）。1.降解率的體內(nèi)測(cè)定需測(cè)定飼糧攝入氮(FIN)、內(nèi)源氮（EN）、通過十二指腸的來源于飼糧的非氨態(tài)氮（NAN）和微生物氮（MIN）。這樣飼糧氮的降解率（Dy）可以用下面的公式表示：Dy＝１－(3～23)表3-6瘤胃降解和小腸消化的日糧氮組分（資料來源：ChalupaandGarnsworthy,1994,Recentadvancesinanimalnutrition）組分主要化合物瘤胃降解腸道消化率（%）A氨、硝酸鹽、氨基酸、肽持續(xù)不斷不會(huì)到達(dá)腸道B1球蛋白、某些清蛋白200～300100B2大多數(shù)清蛋白、面筋蛋白5～15100B3細(xì)胞壁蛋白、變性蛋白、醇溶谷蛋白0.1～1.5—C美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、與木質(zhì)素連接的氮、單寧結(jié)合蛋白00這一方法需準(zhǔn)確測(cè)定十二指腸的食糜流量、微生物氮和內(nèi)源氮，這些參數(shù)的測(cè)定需使用雙指示劑和同位素標(biāo)記技術(shù)，會(huì)使測(cè)定結(jié)果有較大誤差。內(nèi)源氮隨動(dòng)物種類和飼養(yǎng)水平不同有一定差異，約占50～150g/kg，常用150g/kg作為估計(jì)值。盡管這一方法不十分準(zhǔn)確，但是目前測(cè)定氮降解率絕對(duì)值的唯一可用的方法，且用作檢驗(yàn)其他測(cè)定方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。2.瘤胃尼龍袋法測(cè)定氮降解率將飼料裝入一個(gè)人造纖維袋，然后將袋懸于瘤胃內(nèi)。經(jīng)過一定時(shí)間后，比較放入瘤胃前后的氮含量變化。降解率（%）＝×100(3～24)由于纖維袋中的蛋白質(zhì)消失率與時(shí)間相關(guān)，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，增加的幅度變小。因此存在如下關(guān)系式：氮消失率=a+b×（1-）（3～25）式中:a代表時(shí)間為零時(shí)的消失率，即水溶性蛋白部分，b代表緩慢降解的氮部分，c代表有潛力降解的b的消失率。根據(jù)上述關(guān)系，有效的氮降解率可以表示為：P=a+(3～26)公式中r為食糜從瘤胃到真胃的通過速率。從理論上講，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，瘤胃內(nèi)剩余的氮會(huì)降為零，降解的氮也會(huì)為零，因此，有效的氮降解率可以簡(jiǎn)化為：P=a+(3～27)公式中a代表快速可降解氮，bc÷(c+r)為緩慢降解部分。該測(cè)定方法也有許多導(dǎo)致分析誤差的因素，如樣品大小、纖維袋大小、纖維材料的多孔性、袋從瘤胃取出以后的處理等。ARC（1992）提出了該測(cè)定方法的技術(shù)規(guī)程。這一方法假設(shè)纖維袋中的氮消失率能夠反映飼料氮在瘤胃液中的溶解性，即降解率。但事實(shí)上，有