PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展及存在問(wèn)題課件

PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展及存在問(wèn)題衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展及存在問(wèn)題衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明PCR?

PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]PCR?PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝KaryMullisKaryMullis什么是PCR?

我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說(shuō)明。……它的發(fā)明并沒(méi)有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進(jìn)行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過(guò)是一種新工具。

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)什么是PCR?我不認(rèn)為PCR能夠用兩種““…真正驚人的是PCR完全不是為解決某一個(gè)難題而設(shè)計(jì)的,該技術(shù)成熟之后,它所能解決的難題才開(kāi)始涌現(xiàn)…”

-史蒂文·沙夫“…真正驚人的是PCR完全不是為解決某一個(gè)難題而設(shè)計(jì)的,該P(yáng)CR技術(shù)的特點(diǎn)：高特異性引物的特異性。引物延伸時(shí)，堿基配對(duì)的正確性。TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性。靶基因的特異性與保守性。選擇擴(kuò)增特異性和保守性高的靶基因區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性程度就更高。作為臨床測(cè)定的PCR方法，還有一個(gè)影響特異性的決定性因素是寡核苷酸雜交探針。PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高特異性引物的特異性。PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高靈敏度從理論上，其能在2~3小時(shí)內(nèi)，將1個(gè)分子靶DNA，擴(kuò)增至10億個(gè)分子。而就特定的擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)說(shuō)，從理論上，只要反應(yīng)管中有1個(gè)分子，就能將其擴(kuò)增至能檢出的水平。如將一些干擾因素考慮在內(nèi)，一個(gè)反應(yīng)體系中，如有2~3個(gè)以上的靶分子，即可成功的通過(guò)PCR擴(kuò)增，將其檢測(cè)出來(lái)。PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高靈敏度從理論上，其能在2~3小時(shí)內(nèi)，將1PCR技術(shù)的特點(diǎn)：簡(jiǎn)便快速整個(gè)PCR的擴(kuò)增在一個(gè)小小的離心管中完成，過(guò)程也只是簡(jiǎn)單的溫度變化，耐高溫的TaqDNA聚合酶的應(yīng)用，避免了DNA聚合酶的反復(fù)加入。整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在2～4小時(shí)完成。

PCR技術(shù)的特點(diǎn)：簡(jiǎn)便快速特定的低純度標(biāo)本也可使用某些靶基因含量高的標(biāo)本，如人的組織、細(xì)胞、毛發(fā)、血液、培養(yǎng)后的細(xì)菌和病毒等病原體等，DNA粗制品及總RNA即可作為擴(kuò)增模板，但在具體的擴(kuò)增時(shí)，可對(duì)標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)诓挥绊懓谢蚰０宓臄U(kuò)增濃度下，降低標(biāo)本中PCR抑制物的濃度，以利于靶基因的擴(kuò)增。特定的低純度標(biāo)本也可使用某些靶基因含量高的標(biāo)本，如人的組織、PCR技術(shù)的應(yīng)用病原體核酸的檢測(cè)：定量（抗病毒藥物治療療效監(jiān)測(cè)）；定性（耐藥突變、基因分型、血液篩查等）。遺傳病腫瘤個(gè)體鑒定其他（SNP及涉及核酸的科研等）PCR技術(shù)的應(yīng)用病原體核酸的檢測(cè)：定量（抗病毒藥物治療療效監(jiān)在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用病毒的檢測(cè)

定量(感染狀況判斷、抗病毒藥物治療療效監(jiān)測(cè)）定性(耐藥突變、基因分型、血液篩查等）細(xì)菌及其它微生物的檢測(cè)難培養(yǎng)菌耐藥基因寄生蟲(chóng)的檢測(cè)在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用病毒的檢測(cè)在遺傳病及其它基因相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用α地貧β地貧血友病藥物性耳聾在遺傳病及其它基因相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用α地貧地中海貧血地中海貧血是一種常染色體遺傳性溶血性貧血,是世界上最常見(jiàn)和發(fā)生率最高中的一種單基因遺傳病。地中海貧血是由于珠蛋白肽鏈合成障礙所致，出現(xiàn)一種或幾種珠蛋白肽鏈數(shù)量不足或完全缺乏，從而造成這種珠蛋白鏈參與的血紅蛋白合成量的減少。各珠蛋白鏈本身的氨基酸順序并無(wú)異常。其中α珠蛋白鏈合成受抑者，叫做“α地中海貧血”；β珠蛋白鏈合成受抑者，叫做“β地中海貧血”。地中海貧血地中海貧血是一種常染色體遺傳性溶血性貧血,是世界上α地中海貧血α地貧的發(fā)生是由于α珠蛋白鏈基因突變的結(jié)果，α珠蛋白基因定位于第16染色體短臂，每條染色體上均有兩個(gè)α珠蛋白基因，該基因總長(zhǎng)30Kb，共包含七個(gè)連鎖的α類(lèi)基因或假基因。在α-基因的突變中，以缺失型突變最為常見(jiàn)。α-基因的另一突變即為點(diǎn)突變，目前已發(fā)現(xiàn)的突變有18種以上，它包括錯(cuò)義突變、無(wú)意突變、剪接部位突變及起始信號(hào)突變。α地貧的產(chǎn)前診斷目前一般采用PCR-探針雜交或限制性長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法進(jìn)行。α地中海貧血α地貧的發(fā)生是由于α珠蛋白鏈基因突變的結(jié)果，α珠β地中海貧血β地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)β地貧）:β地貧由β珠蛋白鏈基因突變所引起，該基因定位于第11染色體短臂，總長(zhǎng)度約60Kb，其中有許多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有兩個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，總長(zhǎng)約為1.126Kb.β-基因的突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?，亦有堿基的插入和缺失。目前在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變達(dá)160余種，其中在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的有21種。β地貧的產(chǎn)前診斷目前一般采用PCR-探針雜交或限制性長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）或等位基因特異的PCR方法進(jìn)行。β地中海貧血β地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)β地貧）:β地貧由β珠蛋白鏈基血友病血友病是一種X連鎖隱性遺傳病，分為血友病甲和血友病乙，幾乎全部發(fā)生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子Ⅷ的缺乏所致，而血友病乙則是因?yàn)槿狈δ蜃英？刂飘a(chǎn)生凝血因子Ⅷ和Ⅸ的基因位于X性染色體上。血友病血友病是一種X連鎖隱性遺傳病，分為血友病甲和血友病乙，母親為血友病基因攜帶者時(shí)致病基因遺傳每個(gè)兒子患血友病及每個(gè)女兒為致病基因攜帶者的機(jī)會(huì)均為50%母親為血友病基因攜帶者時(shí)致病基因遺傳每個(gè)兒子患血友病及每個(gè)女父親為血友病患者時(shí)的致病基因遺傳

所有兒子都正常，所有女兒都是攜帶者父親為血友病患者時(shí)的致病基因遺傳所有兒子都正常，所有女兒都父親為血友病患者母親為攜帶者時(shí)的致病基因遺傳每個(gè)兒子和女兒患血友病及每個(gè)女兒為致病基因攜帶者的機(jī)會(huì)均為50%，兒子有一半正常

父親為血友病患者母親為攜帶者時(shí)的致病基因遺傳每個(gè)兒子和女兒患血友病的分子診斷大多數(shù)血友病突變的大量變異和近代起源使遺傳篩選過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜。目前基本上使用PCR方法檢測(cè)。診斷攜帶者的最佳途徑是檢測(cè)其家庭成員的特異基因缺陷。策略：根據(jù)全國(guó)性可信基因突變和譜系數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定并記錄每一個(gè)家庭中的病人或攜帶者的突變。這樣，根據(jù)個(gè)人所屬家庭，只有小部分血友病基因需要檢查，所以可以迅速而準(zhǔn)確地篩選每一個(gè)家庭成員并降低成本。英國(guó)和瑞典完全使用這種策略，它代表了利用各種遺傳缺陷譜系鑒定遺傳性疾病的篩選模式。血友病的分子診斷大多數(shù)血友病突變的大量變異和近代起源使遺傳篩藥物性耳聾我國(guó)目前聾啞患者約有1770萬(wàn)，居殘疾人之首。耳聾分先天性和后天性?xún)煞N。在后天性耳聾中，藥物性致聾發(fā)生率占40％。而在藥物引起的耳聾者中，3歲前發(fā)病為50％，7歲前可達(dá)82％。其元兇是氨基糖甙類(lèi)藥物，如鏈霉素、丁胺卡那霉素與慶大霉素、妥布霉素及核糖霉素等，它們均能摧毀毛細(xì)胞與螺旋形神經(jīng)節(jié)，以而使聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害，并導(dǎo)致病人耳聾。

藥物性耳聾我國(guó)目前聾啞患者約有1770萬(wàn)，居殘疾人之首。耳聾藥物性耳聾氨基糖甙類(lèi)抗生素所致的耳聾可分為兩類(lèi)：一類(lèi)因接受了中毒劑量而致聾；另一類(lèi)是有遺傳背景，即帶有線(xiàn)粒體125rRNA基因AI555G均質(zhì)性點(diǎn)突變基因。由細(xì)胞線(xiàn)粒體的遺傳基因發(fā)生變異之故。即家族的變異基因可能通過(guò)母親遺傳給她的子孫，使之具有潛在的過(guò)敏性，此稱(chēng)母系遺傳。該突變使原有的BsmAI酶切位點(diǎn)消失藥物性耳聾氨基糖甙類(lèi)抗生素所致的耳聾可分為兩類(lèi)：一類(lèi)因接受了藥物性耳聾檢測(cè)方法主要是運(yùn)用PCR技術(shù)，結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行分析，其更新的技術(shù)包括變性高效液相色譜分析等。藥物性耳聾檢測(cè)方法主要是運(yùn)用PCR技術(shù)，結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)在親子鑒定中的應(yīng)用每個(gè)人的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自父親，另一半則來(lái)自母親。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳分離和自由組合定律，親代基因型決定子代基因型，在沒(méi)有基因突變和分型錯(cuò)誤的前提下，孩子不可能帶有雙親均沒(méi)有的等位基因。父系遺傳的Y染色體的標(biāo)記，子代的分型必定與父親的相同，而且同一父系的所有個(gè)體的分型一致。母系遺傳的線(xiàn)粒體DNA，子代的分型與母親的分型一致，并且同一母系的所有個(gè)體的分型一致。

在親子鑒定中的應(yīng)用每個(gè)人的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自父親，另一半則來(lái)自在親子鑒定中的應(yīng)用父與子之間僅有一個(gè)遺傳標(biāo)志不符合遺傳規(guī)律尚不能排除親子關(guān)系，因?yàn)橛锌赡苁峭蛔兯?。必須?個(gè)以上不同基因座同時(shí)不符才能否定其親子關(guān)系。親子鑒定的手段主要有兩大類(lèi):(1)血液中各種抗原成分的遺傳多態(tài)性標(biāo)志物檢驗(yàn),如人類(lèi)白細(xì)胞抗原分型、紅細(xì)胞抗原分型、紅細(xì)胞酶型及血清型；（2）DNA多態(tài)性檢驗(yàn)。主要包括有單基因座探針限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（DNA指紋）和單基因座擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（包括用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VNTR)和短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(STR)）。

在親子鑒定中的應(yīng)用父與子之間僅有一個(gè)遺傳標(biāo)志不符合遺傳規(guī)律尚在親子鑒定中的應(yīng)用DNA多態(tài)性檢驗(yàn)是目前親子鑒定中最準(zhǔn)確的一種方法。如果孩子和被測(cè)試男子的DNA模式在兩個(gè)或多個(gè)DNA探針上不吻合,那么被測(cè)試男子便被100%排除,即他是親生父親的可能性是0%。反之，如果孩子和被測(cè)試父親的DNA模式完全吻合,則在理論上不能100%肯定其為親生父親，只能計(jì)算出99.95%或更大的概率。事實(shí)上也發(fā)生過(guò)DNA模式完全吻合但實(shí)際并非為生父的情況，但這種情況的可能性極低。在親子鑒定中的應(yīng)用DNA多態(tài)性檢驗(yàn)是目前親子鑒定中最準(zhǔn)確的一在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用基因指紋又稱(chēng)DNA指紋，指的單基因座探針限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA所含有的遺傳信息是由遺傳密碼字母A、C、G和T的序列決定的。人類(lèi)含有總數(shù)約30億個(gè)這種字母，它們?cè)谌梭w每個(gè)細(xì)胞的染色體上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一個(gè)個(gè)體與另一個(gè)個(gè)體完全不同。個(gè)體間的親緣關(guān)系相距越遠(yuǎn)，基因組的核苷酸字母排列差異就越大。相反，遺傳上相關(guān)的個(gè)體（如同胞、父子）相應(yīng)地在其字母序列上有很大的相似性。在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用基因指紋又稱(chēng)DNA指紋，指的單基因座探針限在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用DNA指紋就是通過(guò)分析這種差異來(lái)確定個(gè)體。DNA指紋是最可靠的個(gè)體確認(rèn)方法，現(xiàn)已在司法實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，有很多案例的唯一證據(jù)就是留在現(xiàn)場(chǎng)的這些藏在細(xì)胞內(nèi)的DNA。在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用DNA指紋就是通過(guò)分析這種差異來(lái)確定個(gè)體。在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤診斷腫瘤療效觀(guān)察腫瘤的轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤診斷在個(gè)體化治療中的應(yīng)用細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP450基因的多態(tài)性細(xì)胞色素P4502D6（CytochromeP4502D6，CYP2D6）是細(xì)胞色素藥物代謝酶中較為重要的一種，由497個(gè)氨基酸組成。主要參與多種重要藥物的代謝，包括多種抗心律失常藥、β1受體阻滯藥、抗高血壓及三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥等。CYP2D6參與代謝的藥物占總P450代謝藥物的30%。CYP2D6的基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致患者代謝藥物能力的很大差別。當(dāng)患者的基因型是CYP2D6*1/*1時(shí)，屬于強(qiáng)代謝型（EM）；當(dāng)患者的基因型是CYP2D6*1/*10時(shí)，屬于中等代謝型（IM）；當(dāng)患者的基因型是CYP2D6*10/*10時(shí)，屬于弱代謝型（PM）。同樣是美托洛爾用藥的常規(guī)劑量為25mg/次，2次/d，對(duì)于EM者，推薦劑量為常規(guī)劑量的140%；對(duì)于IM者，推薦劑量為常規(guī)劑量的60%；對(duì)于PM者，推薦劑量為常規(guī)劑量的30%?？沙Ｒ?guī)地應(yīng)用不同的P450基因型來(lái)評(píng)價(jià)新藥在臨床試驗(yàn)中的療效。在個(gè)體化治療中的應(yīng)用細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP450基因在血液篩檢中的應(yīng)用HCV和HIV感染“窗口期”HBVDNAPCR檢測(cè)篩檢血液的意義在血液篩檢中的應(yīng)用其它Immuno-PCR其它Immuno-PCRPCR應(yīng)用存在的問(wèn)題病原體遺傳病腫瘤PCR應(yīng)用存在的問(wèn)題病原體定量PCR測(cè)定的臨床應(yīng)用

及應(yīng)注意的問(wèn)題：病原體為什么要做定量測(cè)定？定性和定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告上的混淆。定量PCR測(cè)定的臨床應(yīng)用

及應(yīng)注意的問(wèn)題：病原體為什么要做定量測(cè)定？用于已知病毒感染患者抗病毒治療效果的動(dòng)態(tài)觀(guān)察及抗病毒藥物的臨床研究；細(xì)菌、支原體、衣原體等一般不需要做定量檢測(cè)。用于基因表達(dá)方面的研究，如特定的mRNA的定量測(cè)定。為什么要做定量測(cè)定？定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告定量測(cè)定測(cè)定的是量的“多”或“少”.用于已知患者的抗病毒治療的動(dòng)態(tài)觀(guān)察.定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告：根據(jù)所使用的測(cè)定方法的測(cè)定范圍報(bào)告結(jié)果，如樣本測(cè)定結(jié)果高出此范圍，則可報(bào)告>多少，也可對(duì)樣本稀釋后再檢測(cè)；如低于此范圍，則報(bào)告<多少，如<103拷貝數(shù)/ml，而不能報(bào)告為0拷貝數(shù)/ml或陰性。定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告定量測(cè)定測(cè)定的是量的“多”或“少”.用于已定性測(cè)定定性測(cè)定則是測(cè)定某種物質(zhì)的“有”或“無(wú)”，用于未知病人的確認(rèn)診斷。什么樣的病原體感染用定性測(cè)定?

細(xì)菌性感染、一過(guò)性的急性病毒性疾病、支原體和衣原體感染、寄生蟲(chóng)病等。定性測(cè)定遺傳病檢測(cè)的問(wèn)題認(rèn)識(shí)的簡(jiǎn)單化、依賴(lài)于商品試劑盒檢測(cè)與臨床結(jié)合不足遺傳病檢測(cè)的問(wèn)題腫瘤檢測(cè)的問(wèn)題濫用沒(méi)有經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)的商品試劑腫瘤檢測(cè)的問(wèn)題個(gè)體化治療的檢測(cè)問(wèn)題“概念”個(gè)體化治療的檢測(cè)問(wèn)題基因芯片“概念”哪個(gè)項(xiàng)目需要多個(gè)指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的，這種同時(shí)檢測(cè)能帶來(lái)什么樣的方便或快捷，并且將新方法與現(xiàn)有方法比較，有什么樣的優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)或方法的成熟程度判斷的最簡(jiǎn)單的方法：找3~5份含不同濃度特定分析物的臨床標(biāo)本，用其重復(fù)檢測(cè)20次，觀(guān)察結(jié)果是否一致，如出現(xiàn)不一致（哪怕是只有1次不一致），就不能用于臨床檢測(cè)?；蛐酒案拍睢迸R床PCR檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法試劑的標(biāo)準(zhǔn)化

核酸提取“內(nèi)標(biāo)”(Internalcontrol)的應(yīng)用工作程序的標(biāo)準(zhǔn)化

標(biāo)本采集、運(yùn)送、管理、檢測(cè)、質(zhì)量控制、結(jié)果報(bào)告和解釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究臨床PCR檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法試劑的標(biāo)準(zhǔn)化臨床PCR檢驗(yàn)應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)核酸提取方法的簡(jiǎn)便化和自動(dòng)化項(xiàng)目的多樣化：從病原體、到基因疾病的診斷、多標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)、疾病基因指紋不同原理的實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增儀的普遍應(yīng)用擴(kuò)增試劑的改進(jìn)：標(biāo)準(zhǔn)化、防污染、有內(nèi)標(biāo)陰性質(zhì)控臨床PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量理念不斷增強(qiáng)臨床PCR檢驗(yàn)應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)核酸提取方法的簡(jiǎn)便化和自動(dòng)化謝謝！謝謝！PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展及存在問(wèn)題衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展及存在問(wèn)題衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明PCR?

PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念。…

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]PCR?PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝KaryMullisKaryMullis什么是PCR?

我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說(shuō)明?！陌l(fā)明并沒(méi)有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進(jìn)行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過(guò)是一種新工具。

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)什么是PCR?我不認(rèn)為PCR能夠用兩種““…真正驚人的是PCR完全不是為解決某一個(gè)難題而設(shè)計(jì)的,該技術(shù)成熟之后,它所能解決的難題才開(kāi)始涌現(xiàn)…”

-史蒂文·沙夫“…真正驚人的是PCR完全不是為解決某一個(gè)難題而設(shè)計(jì)的,該P(yáng)CR技術(shù)的特點(diǎn)：高特異性引物的特異性。引物延伸時(shí)，堿基配對(duì)的正確性。TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性。靶基因的特異性與保守性。選擇擴(kuò)增特異性和保守性高的靶基因區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性程度就更高。作為臨床測(cè)定的PCR方法，還有一個(gè)影響特異性的決定性因素是寡核苷酸雜交探針。PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高特異性引物的特異性。PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高靈敏度從理論上，其能在2~3小時(shí)內(nèi)，將1個(gè)分子靶DNA，擴(kuò)增至10億個(gè)分子。而就特定的擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)說(shuō)，從理論上，只要反應(yīng)管中有1個(gè)分子，就能將其擴(kuò)增至能檢出的水平。如將一些干擾因素考慮在內(nèi)，一個(gè)反應(yīng)體系中，如有2~3個(gè)以上的靶分子，即可成功的通過(guò)PCR擴(kuò)增，將其檢測(cè)出來(lái)。PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高靈敏度從理論上，其能在2~3小時(shí)內(nèi)，將1PCR技術(shù)的特點(diǎn)：簡(jiǎn)便快速整個(gè)PCR的擴(kuò)增在一個(gè)小小的離心管中完成，過(guò)程也只是簡(jiǎn)單的溫度變化，耐高溫的TaqDNA聚合酶的應(yīng)用，避免了DNA聚合酶的反復(fù)加入。整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在2～4小時(shí)完成。

PCR技術(shù)的特點(diǎn)：簡(jiǎn)便快速特定的低純度標(biāo)本也可使用某些靶基因含量高的標(biāo)本，如人的組織、細(xì)胞、毛發(fā)、血液、培養(yǎng)后的細(xì)菌和病毒等病原體等，DNA粗制品及總RNA即可作為擴(kuò)增模板，但在具體的擴(kuò)增時(shí)，可對(duì)標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)诓挥绊懓谢蚰０宓臄U(kuò)增濃度下，降低標(biāo)本中PCR抑制物的濃度，以利于靶基因的擴(kuò)增。特定的低純度標(biāo)本也可使用某些靶基因含量高的標(biāo)本，如人的組織、PCR技術(shù)的應(yīng)用病原體核酸的檢測(cè)：定量（抗病毒藥物治療療效監(jiān)測(cè)）；定性（耐藥突變、基因分型、血液篩查等）。遺傳病腫瘤個(gè)體鑒定其他（SNP及涉及核酸的科研等）PCR技術(shù)的應(yīng)用病原體核酸的檢測(cè)：定量（抗病毒藥物治療療效監(jiān)在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用病毒的檢測(cè)

定量(感染狀況判斷、抗病毒藥物治療療效監(jiān)測(cè)）定性(耐藥突變、基因分型、血液篩查等）細(xì)菌及其它微生物的檢測(cè)難培養(yǎng)菌耐藥基因寄生蟲(chóng)的檢測(cè)在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用病毒的檢測(cè)在遺傳病及其它基因相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用α地貧β地貧血友病藥物性耳聾在遺傳病及其它基因相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用α地貧地中海貧血地中海貧血是一種常染色體遺傳性溶血性貧血,是世界上最常見(jiàn)和發(fā)生率最高中的一種單基因遺傳病。地中海貧血是由于珠蛋白肽鏈合成障礙所致，出現(xiàn)一種或幾種珠蛋白肽鏈數(shù)量不足或完全缺乏，從而造成這種珠蛋白鏈參與的血紅蛋白合成量的減少。各珠蛋白鏈本身的氨基酸順序并無(wú)異常。其中α珠蛋白鏈合成受抑者，叫做“α地中海貧血”；β珠蛋白鏈合成受抑者，叫做“β地中海貧血”。地中海貧血地中海貧血是一種常染色體遺傳性溶血性貧血,是世界上α地中海貧血α地貧的發(fā)生是由于α珠蛋白鏈基因突變的結(jié)果，α珠蛋白基因定位于第16染色體短臂，每條染色體上均有兩個(gè)α珠蛋白基因，該基因總長(zhǎng)30Kb，共包含七個(gè)連鎖的α類(lèi)基因或假基因。在α-基因的突變中，以缺失型突變最為常見(jiàn)。α-基因的另一突變即為點(diǎn)突變，目前已發(fā)現(xiàn)的突變有18種以上，它包括錯(cuò)義突變、無(wú)意突變、剪接部位突變及起始信號(hào)突變。α地貧的產(chǎn)前診斷目前一般采用PCR-探針雜交或限制性長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法進(jìn)行。α地中海貧血α地貧的發(fā)生是由于α珠蛋白鏈基因突變的結(jié)果，α珠β地中海貧血β地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)β地貧）:β地貧由β珠蛋白鏈基因突變所引起，該基因定位于第11染色體短臂，總長(zhǎng)度約60Kb，其中有許多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有兩個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，總長(zhǎng)約為1.126Kb.β-基因的突變以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎嘤袎A基的插入和缺失。目前在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變達(dá)160余種，其中在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的有21種。β地貧的產(chǎn)前診斷目前一般采用PCR-探針雜交或限制性長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）或等位基因特異的PCR方法進(jìn)行。β地中海貧血β地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)β地貧）:β地貧由β珠蛋白鏈基血友病血友病是一種X連鎖隱性遺傳病，分為血友病甲和血友病乙，幾乎全部發(fā)生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子Ⅷ的缺乏所致，而血友病乙則是因?yàn)槿狈δ蜃英？刂飘a(chǎn)生凝血因子Ⅷ和Ⅸ的基因位于X性染色體上。血友病血友病是一種X連鎖隱性遺傳病，分為血友病甲和血友病乙，母親為血友病基因攜帶者時(shí)致病基因遺傳每個(gè)兒子患血友病及每個(gè)女兒為致病基因攜帶者的機(jī)會(huì)均為50%母親為血友病基因攜帶者時(shí)致病基因遺傳每個(gè)兒子患血友病及每個(gè)女父親為血友病患者時(shí)的致病基因遺傳

所有兒子都正常，所有女兒都是攜帶者父親為血友病患者時(shí)的致病基因遺傳所有兒子都正常，所有女兒都父親為血友病患者母親為攜帶者時(shí)的致病基因遺傳每個(gè)兒子和女兒患血友病及每個(gè)女兒為致病基因攜帶者的機(jī)會(huì)均為50%，兒子有一半正常

父親為血友病患者母親為攜帶者時(shí)的致病基因遺傳每個(gè)兒子和女兒患血友病的分子診斷大多數(shù)血友病突變的大量變異和近代起源使遺傳篩選過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜。目前基本上使用PCR方法檢測(cè)。診斷攜帶者的最佳途徑是檢測(cè)其家庭成員的特異基因缺陷。策略：根據(jù)全國(guó)性可信基因突變和譜系數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定并記錄每一個(gè)家庭中的病人或攜帶者的突變。這樣，根據(jù)個(gè)人所屬家庭，只有小部分血友病基因需要檢查，所以可以迅速而準(zhǔn)確地篩選每一個(gè)家庭成員并降低成本。英國(guó)和瑞典完全使用這種策略，它代表了利用各種遺傳缺陷譜系鑒定遺傳性疾病的篩選模式。血友病的分子診斷大多數(shù)血友病突變的大量變異和近代起源使遺傳篩藥物性耳聾我國(guó)目前聾啞患者約有1770萬(wàn)，居殘疾人之首。耳聾分先天性和后天性?xún)煞N。在后天性耳聾中，藥物性致聾發(fā)生率占40％。而在藥物引起的耳聾者中，3歲前發(fā)病為50％，7歲前可達(dá)82％。其元兇是氨基糖甙類(lèi)藥物，如鏈霉素、丁胺卡那霉素與慶大霉素、妥布霉素及核糖霉素等，它們均能摧毀毛細(xì)胞與螺旋形神經(jīng)節(jié)，以而使聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害，并導(dǎo)致病人耳聾。

藥物性耳聾我國(guó)目前聾啞患者約有1770萬(wàn)，居殘疾人之首。耳聾藥物性耳聾氨基糖甙類(lèi)抗生素所致的耳聾可分為兩類(lèi)：一類(lèi)因接受了中毒劑量而致聾；另一類(lèi)是有遺傳背景，即帶有線(xiàn)粒體125rRNA基因AI555G均質(zhì)性點(diǎn)突變基因。由細(xì)胞線(xiàn)粒體的遺傳基因發(fā)生變異之故。即家族的變異基因可能通過(guò)母親遺傳給她的子孫，使之具有潛在的過(guò)敏性，此稱(chēng)母系遺傳。該突變使原有的BsmAI酶切位點(diǎn)消失藥物性耳聾氨基糖甙類(lèi)抗生素所致的耳聾可分為兩類(lèi)：一類(lèi)因接受了藥物性耳聾檢測(cè)方法主要是運(yùn)用PCR技術(shù)，結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行分析，其更新的技術(shù)包括變性高效液相色譜分析等。藥物性耳聾檢測(cè)方法主要是運(yùn)用PCR技術(shù)，結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)在親子鑒定中的應(yīng)用每個(gè)人的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自父親，另一半則來(lái)自母親。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳分離和自由組合定律，親代基因型決定子代基因型，在沒(méi)有基因突變和分型錯(cuò)誤的前提下，孩子不可能帶有雙親均沒(méi)有的等位基因。父系遺傳的Y染色體的標(biāo)記，子代的分型必定與父親的相同，而且同一父系的所有個(gè)體的分型一致。母系遺傳的線(xiàn)粒體DNA，子代的分型與母親的分型一致，并且同一母系的所有個(gè)體的分型一致。

在親子鑒定中的應(yīng)用每個(gè)人的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自父親，另一半則來(lái)自在親子鑒定中的應(yīng)用父與子之間僅有一個(gè)遺傳標(biāo)志不符合遺傳規(guī)律尚不能排除親子關(guān)系，因?yàn)橛锌赡苁峭蛔兯?。必須?個(gè)以上不同基因座同時(shí)不符才能否定其親子關(guān)系。親子鑒定的手段主要有兩大類(lèi):(1)血液中各種抗原成分的遺傳多態(tài)性標(biāo)志物檢驗(yàn),如人類(lèi)白細(xì)胞抗原分型、紅細(xì)胞抗原分型、紅細(xì)胞酶型及血清型；（2）DNA多態(tài)性檢驗(yàn)。主要包括有單基因座探針限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（DNA指紋）和單基因座擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（包括用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VNTR)和短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(STR)）。

在親子鑒定中的應(yīng)用父與子之間僅有一個(gè)遺傳標(biāo)志不符合遺傳規(guī)律尚在親子鑒定中的應(yīng)用DNA多態(tài)性檢驗(yàn)是目前親子鑒定中最準(zhǔn)確的一種方法。如果孩子和被測(cè)試男子的DNA模式在兩個(gè)或多個(gè)DNA探針上不吻合,那么被測(cè)試男子便被100%排除,即他是親生父親的可能性是0%。反之，如果孩子和被測(cè)試父親的DNA模式完全吻合,則在理論上不能100%肯定其為親生父親，只能計(jì)算出99.95%或更大的概率。事實(shí)上也發(fā)生過(guò)DNA模式完全吻合但實(shí)際并非為生父的情況，但這種情況的可能性極低。在親子鑒定中的應(yīng)用DNA多態(tài)性檢驗(yàn)是目前親子鑒定中最準(zhǔn)確的一在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用基因指紋又稱(chēng)DNA指紋，指的單基因座探針限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA所含有的遺傳信息是由遺傳密碼字母A、C、G和T的序列決定的。人類(lèi)含有總數(shù)約30億個(gè)這種字母，它們?cè)谌梭w每個(gè)細(xì)胞的染色體上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一個(gè)個(gè)體與另一個(gè)個(gè)體完全不同。個(gè)體間的親緣關(guān)系相距越遠(yuǎn)，基因組的核苷酸字母排列差異就越大。相反，遺傳上相關(guān)的個(gè)體（如同胞、父子）相應(yīng)地在其字母序列上有很大的相似性。在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用基因指紋又稱(chēng)DNA指紋，指的單基因座探針限在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用DNA指紋就是通過(guò)分析這種差異來(lái)確定個(gè)體。DNA指紋是最可靠的個(gè)體確認(rèn)方法，現(xiàn)已在司法實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，有很多案例的唯一證據(jù)就是留在現(xiàn)場(chǎng)的這些藏在細(xì)胞內(nèi)的DNA。在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用DNA指紋就是通過(guò)分析這種差異來(lái)確定個(gè)體。在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤診斷腫瘤療效觀(guān)察腫瘤的轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤診斷在個(gè)體化治療中的應(yīng)用細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP450基因的多態(tài)性細(xì)胞色素P4502D6（CytochromeP4502D6，CYP2D6）是細(xì)胞色素藥物代謝酶中較為重要的一種，由497個(gè)氨基酸組成。主要參與多種重要藥物的代謝，包括多種抗心律失常藥、β1受體阻滯藥、抗高血壓及三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥等。CYP2D6參與代謝的藥物占總P450代謝藥物的30%。CYP2D6的基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致患者代謝藥物能力的很大差別。當(dāng)患者的基因型是CYP2D6*1/*1時(shí)，屬于強(qiáng)代謝型（EM）；當(dāng)患者的基因型是CYP2D6*1/*10時(shí)，屬于中等代謝型（IM）；當(dāng)患者的基因型是CYP2D6*10/*10時(shí)，屬于弱代謝型（PM）。同樣是美托洛爾用藥的常規(guī)劑量為25mg/次，2次/d，對(duì)于EM者，推薦劑量為常規(guī)劑量的140%