基因工程 第五章 基因轉(zhuǎn)化

第五章目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1第一節(jié)受體細(xì)胞受體細(xì)胞：可攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞，具有應(yīng)用價值或理論價值。又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞，2成為受體細(xì)胞的條件：便于重組DNA導(dǎo)入。能使重組DNA分子穩(wěn)定存在。便于重組體的篩選。遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)。安全，無致病性，環(huán)保。蛋白酶缺失\含量低，利用表達(dá)蛋白積累。遺傳密碼的使用無明顯偏倚性。有轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制（真核基因）。在理論和實踐上有較高的價值。3一、原核生物細(xì)胞1、優(yōu)勢：大部分沒有纖維素組成的堅硬細(xì)胞壁，便于DNA進(jìn)入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合蛋白質(zhì)，這為外源DNA與染色體DNA重組減少了麻煩?；蚪M簡單，無線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細(xì)胞，容易獲得一致性的實驗材料，培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，周期短，重復(fù)快。42、缺點：無折疊系統(tǒng)，真核基因表達(dá)后，蛋白可能結(jié)構(gòu)不正確無修飾系統(tǒng)，真核基因表達(dá)后，蛋白不同被修飾。E.coli.有蛋白酶，外源蛋白不穩(wěn)定。53、E.coli.

優(yōu)點：繁殖快，培養(yǎng)簡單，代謝易于控制。缺點：有內(nèi)毒素64、枯草桿菌具有大腸桿菌的所有優(yōu)點。基因表達(dá)產(chǎn)物可分泌到培養(yǎng)基中，簡化蛋白的提取和加工。真核生物的重組蛋白被分泌后便具有天然構(gòu)象和生物活性。無內(nèi)毒素，安全。7二、真菌細(xì)胞常用酵母菌可進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞生物。8優(yōu)勢：結(jié)構(gòu)簡單，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理清楚，遺傳操作相對簡單。有蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不產(chǎn)生毒素，安全。培養(yǎng)簡單，利用大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉。能將表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。9三、植物細(xì)胞具有細(xì)胞全能性，單細(xì)胞可培養(yǎng)成植株。

將細(xì)胞去壁后成為原生質(zhì)體，可直接轉(zhuǎn)入基因，也可利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入外源基因。10四、動物細(xì)胞多采用生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞常用受體細(xì)胞有小鼠L細(xì)胞、Hela細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞等。11第二節(jié)重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞重組DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。12一、Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法1、感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞：是指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。CaCl2冷處理是制備E.coli.感受態(tài)細(xì)胞的最常用方法。132、過程：培養(yǎng)生命活動旺盛的菌體：進(jìn)行菌種的活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，最適條件下培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)5×106~2×107

個/mL（A600為0.4），處于對數(shù)生長期沉淀菌體：取3-4mL菌液在冰水浴中預(yù)冷10min，然后在4℃下以適當(dāng)速度離心沉淀菌體，5000g離心5min。14化合物處理：將沉淀的菌體懸浮在相當(dāng)于原體積的含CaCl2無菌預(yù)冷緩沖溶液中（50-100mmol/LCaCl2

、10mmol/LTris-HCl,pH8.0）。置冰水浴15min后，4℃下放置12-14h，不要劇烈振蕩。如此制備的感受態(tài)細(xì)胞在1-2d內(nèi)能有效吸收DNA分子。152、DNA分子轉(zhuǎn)化：0.2ml感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1mlDNA，冰浴1h以上，期間輕搖幾次。轉(zhuǎn)移至42℃水浴2min。馬上轉(zhuǎn)到37℃水浴中溫育5min，加入1ml不含選擇藥物的LB液體培養(yǎng)基。37℃振蕩培養(yǎng)30-60min，然后鋪板培養(yǎng)篩選。16二、轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素1、轉(zhuǎn)化率：DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)量的比。轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)的比。172、影響轉(zhuǎn)化的因素：DNA越小越容易，親和性越強(qiáng)越容易。不同受體菌細(xì)胞不同。不同轉(zhuǎn)化方法不同，電穿孔法最高、Ca2+

轉(zhuǎn)化法居中、三親雜交法最低。18第三節(jié)重組子的篩選一、遺傳表型直接篩選載體有標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化細(xì)胞出現(xiàn)特殊的表型特性。1、抗藥性篩選載體有抗藥性標(biāo)記。轉(zhuǎn)化受體在含有藥物的培養(yǎng)基上正常生長，未轉(zhuǎn)化的菌不能生長。192、顯色互補(bǔ)篩選法載體上有LacZ基因，含有外源DNA的菌落為白色，沒有的菌落為藍(lán)色.20二、依據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征篩選1、酶切鑒定從受體細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，酶切質(zhì)粒DNA電泳檢測酶切產(chǎn)物的大小。21質(zhì)粒目的基因圖酶切鑒定Marker空質(zhì)粒酶切產(chǎn)物目的基因222、利用PCR方法篩選從受體細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA利用載體或插入片段兩端的已知序列合成引物進(jìn)行PCR電泳檢測PCR結(jié)果，判斷否轉(zhuǎn)化成功。23第四節(jié)核酸探針與分子雜交24探針(probe):用于檢測樣品中是否含有待測核酸的已知核酸片段。選擇的原則：高度特異、來源方便。探針的來源：人工合成一、探針標(biāo)記25探針的種類：A、基因組DNA探針：B、cDNA探針：無高重復(fù)序列、無內(nèi)含子，不易獲得。C、人工合成寡核苷酸探針（適于點突變）26探針標(biāo)記：探針必須加以標(biāo)記，用于檢測。標(biāo)記物:探針上可靈敏和特異檢測到的標(biāo)記,不影響其主要物化特性的物質(zhì)。標(biāo)記物的種類A、放射性核素B、非放射性標(biāo)記物。27放射性同位素可示蹤、不影響反應(yīng)靈敏：可檢測10-14～10-18g（光譜法只能到10-9g）。放射性的探測蓋革計數(shù)器閃爍計數(shù)器28缺點一、核幅射對人體損傷；二、污染環(huán)境；三、探針使用時間短，常用的32P半衰期14.3天；四、依賴進(jìn)口和價格昂貴。29標(biāo)記方法缺口平移法。DNA聚合酶IdCTP32dGTP32dATP32dTTP32dCTP32dGTP32dATP32dTTP325`3`5`3`30非放射性標(biāo)記物優(yōu)點：無污染、可保存2年以上。缺點：靈敏度低?；舅枷雽⒖纱呋@色反應(yīng)的酶與核酸的堿基連接，以示蹤。31直接標(biāo)記方法：化學(xué)法將酶結(jié)合在核酸上。缺點：酶是大分子，可能會因結(jié)構(gòu)大而影響分子雜交。標(biāo)記后酶活性可能會受到影響。

32間接酶標(biāo)法常用方法：先將較小的分子標(biāo)記在核酸上，再通過一個既能該小分子結(jié)合又與酶結(jié)合的蛋白質(zhì)把酶間接地與核酸連接。小分子：生物素和半抗原(如地高辛)常用的酶：辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶.常用的小分子及酶的結(jié)合物：抗生物素抗體、抗半抗原抗體等。33DIG是植物毛地黃特有的固醇化合物。人工合成的核苷酸為dig-11-dUTP可通過缺口轉(zhuǎn)移法、隨機(jī)引物法、PCR法使dig-11-dUTP摻入DNA分子而合成探針。1.

DIG(地高辛)標(biāo)記34特點：專一性強(qiáng)敏度高（0.1pg同源序列）雜交時探針濃度低（只要10-20ng/mL）過程：BCIP/NBT紫藍(lán)色沉淀抗地高辛抗體堿性磷酸酶待測DNA變性為單鏈并轉(zhuǎn)移到膜上變性后探針352.生物素標(biāo)記生物素－親合素系統(tǒng)（BAS)生物素與核酸相連，親合素（結(jié)合有酶或熒光物質(zhì)）可與生物素特異性的結(jié)合通過顯色或檢測熒光檢測雜交信號。親合素-酶OCOOH咪唑酮環(huán)噻吩環(huán)結(jié)合核酸36二.核酸分子雜交定義：利用已知的核酸序列(探針)探測樣本中是否含有與其同源的核酸序列。

基本原理:

探針DNA與目標(biāo)DNA分子的變性和復(fù)性37核酸分子雜交優(yōu)點A、靈敏度高(可檢測10g樣品)B、特異性強(qiáng)(可鑒別20個堿基對左右的同源序列)操作步驟標(biāo)記核酸，制備探針。待測核酸轉(zhuǎn)移到合適的薄膜上。適當(dāng)條件下使探針和待測核酸雜交。檢測雜交信號。-12381.膜上印跡雜交

印跡：經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用，被轉(zhuǎn)移到濾膜上。

膜：硝酸纖維濾膜、尼龍膜等。39Southernblot：步驟：首先進(jìn)行DNA電泳對電泳后DNA進(jìn)行堿變性和中和處理。平鋪在用電泳緩沖溶液飽和的兩張濾紙上，在凝膠上覆蓋一張硝酸纖維素濾膜，濾膜上壓一疊干燥濾紙，濾紙上壓一重物。由于干燥濾紙吸水，凝膠下緩沖溶液向上移動，凝膠中DNA便隨之轉(zhuǎn)移到纖維素膜上。取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交聯(lián)使DNA穩(wěn)定結(jié)合在膜上，將膜放在已變性的探針溶液中進(jìn)行核酸雜交。洗去沒有雜交的探針顯色40取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交聯(lián)使DNA穩(wěn)定結(jié)合在膜上，將膜放在已變性的探針溶液中進(jìn)行核酸雜交。洗去沒有雜交的探針顯色，41玻璃板干燥濾紙硝酸纖維素膜酶切電泳電泳后變性電泳緩沖液雜交顯色緩沖液浸濕的濾紙42Southern印跡時間取決于NDA片段的大小1kb以下1小時15kb要18小時如大于15kb，可進(jìn)行水解成小片段來提高轉(zhuǎn)移效率但不能太小，否則會影響片段與膜的結(jié)合，并且產(chǎn)生較大的擴(kuò)散作用。43電轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移電泳槽電場的作用使凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。不能用硝酸纖維素膜44電轉(zhuǎn)移的一般過程：首先進(jìn)行DNA電泳對電泳后DNA進(jìn)行堿變和中和處理。尼龍膜、濾紙及海綿也在緩沖溶液中充分浸泡。將凝膠與尼龍膜貼緊，外側(cè)各貼一張濾紙。再其外是起保護(hù)作用的海綿。該體系夾在多孔的支持夾中固定在電泳槽內(nèi)，浸泡在電泳緩沖溶液中。通電進(jìn)行轉(zhuǎn)移。取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交聯(lián)使DNA穩(wěn)定結(jié)合在膜上，將膜放在已變性的探針溶液中進(jìn)行核酸雜交。洗去沒有雜交的探針顯色，45凝膠支持夾海綿濾紙凝膠尼龍膜凝膠支持夾海綿濾紙46-+濕式電轉(zhuǎn)移裝置結(jié)構(gòu)示意圖47凝膠支持夾48硝酸纖維素濾膜（NC膜）的不足之處：NC膜依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA，不牢固。質(zhì)地較脆，易碎。NC膜對小分子DNA片段結(jié)合力不強(qiáng)。NC膜的結(jié)合依賴高鹽濃度，不適宜于電轉(zhuǎn)移。49

NorthernblotAlwine等1979年應(yīng)用于RNA研究上。測定細(xì)胞的總RNA或mRNA。過程：將各種RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后將RNA從凝膠上轉(zhuǎn)移到NC膜上，并與探針雜交。印跡過程類似于Southernblot。但有區(qū)別。50區(qū)別1：防止RNA形成高級結(jié)構(gòu)，采用變性電泳。不能采用堿變性，常用的變性劑：甲醛、乙二醛、羥甲基汞、尿素和甲酰胺等。尿素和甲酰胺可引起瓊脂糖固化只能用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。羥甲基汞毒性較大。乙二醛操作不如甲醛變性凝膠電泳簡單。51區(qū)別2：電泳時要求低電壓，3-4V/cm。電泳時緩沖溶液要不斷循環(huán)，或30min換一次。區(qū)別3為防止RNA被降解要抑制Rnase的作用。52

Westernblot

1979年，Towbin等將blot技術(shù)擴(kuò)展到蛋白質(zhì)研究中。實際上是一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)一配基間締合作用分析、酶的鑒定、單價抗體的親和純化、顯示細(xì)胞與蛋白質(zhì)之間的相互作用等。532、斑點或狹縫雜交經(jīng)過變性的DNA或RNA點樣于NC膜上，成為斑點或狹縫，然后進(jìn)行核酸分子雜交。在同一張膜上可同時檢測多個樣品，但不能鑒定所測基因的分子量。優(yōu)點：快速、節(jié)時、經(jīng)濟(jì)缺點：目的序列與非目的序列未分離，不能了解目的序列的長度。用途：基因分析、基因診斷、基因表達(dá)543、菌落雜交主要用于基因組（cDNA）文庫的篩選基本程序：菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到NC膜上，溶菌、變性的DNA與濾膜原位結(jié)合；烤干合DNA固定在濾膜上與探針雜交；漂洗除去雜質(zhì)探針，檢測雜交信號根據(jù)雜交位置，對照原來的平板，從