細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗技術(shù)課件

腫瘤細(xì)胞運(yùn)動實(shí)驗技術(shù)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗室張寧PI組體內(nèi)實(shí)驗：皮下移植瘤模型原位移植瘤模型腫瘤細(xì)胞運(yùn)動體外實(shí)驗?zāi)[瘤細(xì)胞運(yùn)動常用研究方法Textinhere侵襲實(shí)驗趨化運(yùn)動劃痕實(shí)驗操作步驟1．先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過3條線。操作步驟2.在孔中加入約5×105個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%；3.用10mltip槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS洗滌2次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。

操作步驟4．放入37℃

5%

CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3h測量一次細(xì)胞運(yùn)動的距離，拍照(具體時間依實(shí)驗需要而定)。操作步驟

5.數(shù)據(jù)處理：每個時間點(diǎn)的距離長度-0時距離=每個時間長度細(xì)胞整體遷移的距離，求出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，時間為橫軸，遷移距離為縱軸（單位mm）作圖，并比較初始0時與實(shí)驗結(jié)束時實(shí)驗組與對照組的照片。實(shí)驗原理

趨化運(yùn)動是指細(xì)胞能夠感受到外界化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度，并沿著濃度梯度的方向所做的定向運(yùn)動。趨化運(yùn)動是一個非常保守的過程，對于生物體的生存、生命的繁衍等具有重要的意義。趨化運(yùn)動實(shí)驗（ChemotaxisAssay）微孔小室中的趨化實(shí)驗

微孔小室中的趨化實(shí)驗是根據(jù)靶細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等）能夠趨化性主動遷移，穿過一定孔徑的濾膜而設(shè)計的。

濾膜（聚碳酸脂膜）將小室分隔成上下兩部分。靶細(xì)胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過濾膜形成梯度，細(xì)胞則沿著梯度穿過膜孔，黏附在膜的下面，計數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測出趨化因子的趨化能力。BoydenChamber裝置實(shí)驗步驟4.將趨化小室在37℃，5%CO2的孵化箱中孵育3h；5.在膜的兩端加上夾子，毛面在PBS液面上蘸取，光面禁止碰到液體。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反復(fù)3次后再蘸取一次，晾干；6.固定,染色實(shí)驗步驟7.取載玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蠟，蓋玻片封片；8.顯微鏡觀察計數(shù)，每孔至少3個隨機(jī)視野，3個孔的數(shù)值取平均值;作柱狀圖，縱軸趨化指數(shù)或細(xì)胞數(shù)，橫軸組別；9.趨化指數(shù)(ChemotaxisIndex)=隨著趨化誘導(dǎo)因子的濃度梯度而遷移的細(xì)胞數(shù)目/用培養(yǎng)基做對照的遷移細(xì)胞數(shù)目腫瘤細(xì)胞侵襲試驗MatrigelInvassionAssayTranswell系統(tǒng)Transwell小室0.4um孔徑聚碳酯膜的掃描電鏡原理

人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，4℃時是液體，在37℃

會逐漸凝固成膠狀。主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，能在培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。實(shí)驗步驟及注意事項1.無菌條件下Matrigel于冰浴融化，用PBS（或DMEMonly培養(yǎng)基）稀釋成1mg/ml濃度，-20°C凍存?zhèn)溆茫?.取出已稀釋好的Matrigel，冰浴融化，以50ml的體積鋪于Tramwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好），37°C放置lh，使Matrigel聚合成凝膠（注意：加基質(zhì)膠時最好將24孔板放置在冰盒上，確保膠完全覆蓋孔底，不要有氣泡）；3.每孔加入200ml1640（或DMEM）培養(yǎng)基使膠重構(gòu)；4.在Transwell下室中加入趨化因子或10%FBS培養(yǎng)基600ml/孔；5.在上室孔中準(zhǔn)確加入細(xì)胞l×105

個/孔，細(xì)胞懸液體積200ml，置于5%CO2

培養(yǎng)箱于37°C培養(yǎng)24h（注意：細(xì)胞量和時間根據(jù)實(shí)驗條件摸索）；6.待培養(yǎng)時間結(jié)束后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上未穿過膜的細(xì)胞；實(shí)驗步驟及注意事項①Transwell小室②上層培養(yǎng)液③細(xì)胞④基質(zhì)膠⑤下層培養(yǎng)液⑥細(xì)胞培養(yǎng)板

Transwell侵襲實(shí)驗示意圖7.4%中性甲醛固定10分鐘，Giemsa染色10分鐘，PBS洗滌3次，干燥