PCR-HPV-DNA熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

PCR-HPV-DNA熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序PCR-HPV-DNA熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序PCR-HPV-DNA熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序資料僅供參考文件編號(hào)：2022年4月PCR-HPV-DNA熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序版本號(hào)：A修改號(hào)：1頁(yè)次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：?jiǎn)挝患皩?shí)驗(yàn)室名稱項(xiàng)目編號(hào)：ASJYK-LAB-C-P-53日期：2015年6月21日版本：第一版，第1次修訂第1頁(yè)，共3頁(yè)檢驗(yàn)科HPV-DNA擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序1.目的：明確高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測(cè)的操作規(guī)程，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員正確進(jìn)行巨細(xì)胞病毒核酸定量的檢測(cè)。2.適用范圍：適用于進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測(cè)的檢驗(yàn)人員。適合儀器：LightCycler480型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀方法原理：采用PCR方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增技術(shù)樣品要求：宮頸脫落細(xì)胞3.職責(zé)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.試劑來(lái)源：潮州凱普生物化學(xué)有限公司高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒。5.質(zhì)控物：陰性、陽(yáng)性對(duì)照及陽(yáng)性參控品系列均來(lái)源于試劑盒6.標(biāo)準(zhǔn)操作：試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作）6.1.1將試劑盒及其它所需試劑置室溫解凍（臨用前取出，用后立即放回冰箱，反復(fù)凍融不可超過(guò)三次），取出PCRMIX,室溫下避光解凍，上下顛倒混勻后，8000轉(zhuǎn)/分鐘10s從試劑盒中取出DVA聚合酶，8000轉(zhuǎn)/分鐘lOs。根據(jù)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量，取出相應(yīng)試劑（1管=MIX+DVA聚合酶）總的需求量于一管中（其余隨即放回原溫度保存），如所需要的管數(shù)為n(n=標(biāo)本數(shù)+1空白管對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)取PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本制備區(qū)。樣本處理(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)取宮頸脫落細(xì)胞樣本0.5ml~1ml(如果細(xì)胞數(shù)量少可以加大體積到2m1)13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘棄上清，加入細(xì)胞保存液重懸細(xì)胞13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，盡量棄干凈上清每樣本加入50ul細(xì)胞裂解液，充分振蕩重懸細(xì)胞，煮沸10分鐘。13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，保留上清備用(上清中為釋放的DNA)。取上清作為PCR擴(kuò)增的模板，其余保存于一20℃在對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管中分別加入2ul處理好的樣本DVA,空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，蓋緊管蓋，稍做離心(反應(yīng)總體積為2ou1/人份，每次反應(yīng)需要設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照以及一個(gè)空白對(duì)照)。轉(zhuǎn)移到檢測(cè)區(qū)，放入相應(yīng)的熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序PCR擴(kuò)增（在擴(kuò)增區(qū)操作）6.3.1打開(kāi)穩(wěn)壓器電源，再打開(kāi)計(jì)算機(jī)電源。6.3.2打開(kāi)擴(kuò)增儀電源，按儀器操作規(guī)程進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)條件設(shè)定。設(shè)置四種熒光檢測(cè)通道的報(bào)告熒光、淬滅熒光;PassiveReference選擇none(見(jiàn)表1)ASJYK-LAB-C-P-53第2頁(yè)，共3頁(yè)表1:設(shè)置四種熒光檢測(cè)通道DetectorNameTargetReporterDyeQuencherFAM12種高危型HPV(31,33,35,39,45,51,52,56,58,5966，68)FAMnoneHEMHPV16HEX/JOEnoneROXHPV18ROX/Red610noneCy5β-globinCy5none將循環(huán)條件設(shè)定為ProgramCyclesTemperature(℃)IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(℃/sec)AcquisitonModeAnalysisMode119510:00min20NoneNone2459515sec20NoneNone6060secSingleQuantification31385sec20NoneNone檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。將待反應(yīng)的PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀中，并根據(jù)實(shí)際情況和儀器操作規(guī)程在程序中設(shè)定好樣孔位置。按儀器操作規(guī)程開(kāi)始循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源，反應(yīng)管直接放入焚燒垃圾桶內(nèi)。ASJYK-LAB-C-P-52第3頁(yè)，共3頁(yè)分析數(shù)據(jù)，在AnalysisNotes窗口中注明檢測(cè)基線值、試劑批號(hào)、陽(yáng)參批號(hào)等相關(guān)信息，進(jìn)行結(jié)果分析。關(guān)閉計(jì)算機(jī)。檢驗(yàn)結(jié)果判斷：基線，閡值的設(shè)定:基線的確定為:取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào):閾值設(shè)定:使閾值線超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線(無(wú)規(guī)則的噪音線)的最高點(diǎn)，且Ct值為Under質(zhì)控對(duì)照1陰性對(duì)照Ct值均應(yīng)顯示為Undet2陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤363內(nèi)對(duì)照β-globin在Cy5通道Ct值≤40符合以上三個(gè)條件，此反應(yīng)是為有效結(jié)果判斷1樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值顯示為Undet，內(nèi)對(duì)照β-globin在Cy5通道Ct值≤40,判斷為陰性2樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值≤40,內(nèi)對(duì)照β-globin在Cy5通道Ct值≤40判斷為陽(yáng)性3若樣本在FAM、HEX、ROX通道40<Ct值<45的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值<40者為陽(yáng)性，否則為陰性7.支持性文件：《高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR一熒光探針?lè)?》說(shuō)明書（潮州凱普生物化學(xué)有限公司）