其他高效液相色譜法分析化學(xué)課件

第十三章高效液相色譜法

◆學(xué)習(xí)目的⊙◆知識(shí)要求⊙◆能力要求⊙◆進(jìn)入章節(jié)學(xué)習(xí)請(qǐng)點(diǎn)這里第1節(jié)第2節(jié)第3節(jié)第4節(jié)第5節(jié)第6節(jié)1第十三章高效液相色譜法◆學(xué)習(xí)目的⊙1◆學(xué)習(xí)目的通過學(xué)習(xí)高效液相色譜法的特點(diǎn)、類型、速率理論、分離條件和高效液相色譜儀的主要部件及工作流程，加深對(duì)高效液相色譜法的分離原理、條件的理解，熟悉主要類型特別是化學(xué)鍵合相色譜法的特點(diǎn)和應(yīng)用，能利用高效液相色譜儀對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離與分析。為學(xué)習(xí)藥物分析、天然藥物化學(xué)等專業(yè)課程奠定基礎(chǔ)。2◆學(xué)習(xí)目的通過學(xué)習(xí)高效液相色譜法的特點(diǎn)、類型、速率理論、分離◆知識(shí)要求1.熟悉高效液相色譜法的主要類型，化學(xué)鍵合相色譜法及其流動(dòng)相、固定相的選擇；高效液相色譜法速率理論的特點(diǎn)及分離條件的選擇，高效液相色譜儀的主要部件，定性與定量分析方法。2.了解高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法、氣相色譜法的區(qū)別，其他類型高效液相色譜法在分析中的應(yīng)用。3◆知識(shí)要求1.熟悉高效液相色譜法的主要類型，化學(xué)鍵合相色譜法◆能力要求掌握高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及儀器的基本操作方法，學(xué)會(huì)使用高效液相色譜儀對(duì)藥物進(jìn)行分離與分析的操作技術(shù)。4◆能力要求掌握高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及儀器的基本操作方法，第一節(jié)概述

第一節(jié)概述

高效液相色譜法（HPLC）的特點(diǎn)：以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)高壓輸送流動(dòng)相高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器現(xiàn)代液相色譜分析方法（具有分離、分析雙重作用）5第一節(jié)概述第一節(jié)概述5第一節(jié)概述一、與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)109g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1012g。6第一節(jié)概述一、與經(jīng)典液相色譜法相比6第一節(jié)概述二、與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；流動(dòng)相的選擇范圍寬，使分離的選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。7第一節(jié)概述二、與氣相色譜法相比7課堂互動(dòng)您能比較HPLC與GC和LC的主要區(qū)別嗎？第一節(jié)概述8課堂互動(dòng)您能比較HPLC與GC和LC的主要區(qū)別嗎？第一節(jié)概第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理

第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理

一、主要類型 化學(xué)鍵合相色譜法離子抑制色譜法離子對(duì)色譜法離子色譜法親合色譜法9第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理第二節(jié)第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理二、化學(xué)鍵合相色譜法以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)?；瘜W(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相。

10第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理二、化學(xué)鍵合相色譜第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理鍵合相色譜法的優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，使用過程中不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高。根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱分類：分為正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法。

11第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理鍵合相色譜法的優(yōu)點(diǎn)第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（一）正相鍵合相色譜法（固定相極性大于流動(dòng)相極性）固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)節(jié)劑如烷烴加醇類（正己烷-甲醇）。適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。12第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（一）正相鍵合相色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制：分配：把有機(jī)鍵合層看作一層液膜，溶質(zhì)在兩相間溶解。極性強(qiáng)的組分k大，保留時(shí)間（tR）長(zhǎng),后洗脫出柱。13第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制：13第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）反相鍵合相色譜法（固定相極性小于流動(dòng)相極性）固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠。流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)節(jié)劑，常用甲醇-水、乙腈-水等。應(yīng)用范圍：較廣泛，適用于非極性至中等極性的組分分離。14第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）反相鍵合相色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制－保留行為主要是利用非極性溶質(zhì)分子或溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與極性溶劑接觸時(shí)產(chǎn)生排斥力，而從溶劑中被“擠出”，即產(chǎn)生疏溶劑作用，促使溶質(zhì)分子與鍵合相表面的非極性的烷基發(fā)生疏水締合，而使溶質(zhì)分子保留在固定相中。15第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制－保留行為第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理保留行為的主要影響因素溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）

極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大；反之亦然。

固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長(zhǎng)而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。16第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理保留行為的主要影響第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理流動(dòng)相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑種類：水（洗脫能力弱）為弱溶劑，醇（洗脫能力強(qiáng)）為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大

17第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理流動(dòng)相17課堂討論欲測(cè)定的試樣為弱極性分子型有機(jī)化合物，您將采用哪種色譜方法，如何選擇固定相與流動(dòng)相？第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理18課堂討論欲測(cè)定的試樣為弱極性分子型有機(jī)化合物，您將采用哪種色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理三、其他高效液相色譜法（一）離子抑制色譜法

（ionsuppressionchromatography；ISC）通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，

適用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKb≤8的弱堿。19第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理三、其他高效液相色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）離子對(duì)色譜法

（ionpairchromatography；IPC）把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，組分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子（counterion）生成中性離子對(duì)，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。該方法適用于分離可離子化或離子型的化合物，如生物堿類、兒茶酚氨類、有機(jī)酸類、維生素類、抗生素類藥物等。20第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）離子對(duì)色譜法第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理--------------離子對(duì)模型以通式表示為：21第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理---------第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分析酸類或帶負(fù)電荷的物質(zhì)，一般用季銨鹽；如四丁基銨磷酸鹽；

分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)，一般用烷基磺酸鹽或硫酸鹽。

適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇22第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理適用范圍和離子對(duì)試（三）離子色譜法（ionchromatography，IC）離子交換色譜法對(duì)許多正、負(fù)離子可實(shí)現(xiàn)分離。但由于一些常見的無(wú)機(jī)離子在可見或近紫外區(qū)沒有吸收，因此難用紫外-可見檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。1975年Small提出了將離子交換與電導(dǎo)檢測(cè)器相結(jié)合分析各種離子的方法并稱為離子色譜法。適用于分離陰、陽(yáng)離子，以及氨基酸、糖類、DNA和DNA水解物等。

第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理23（三）離子色譜法（ionchromatography，IC（四）親和色譜法（affinitychromatography，AC）親和色譜法是將具有生物活性的配位基鍵合到載體或基質(zhì)表面形成固定相，利用蛋白質(zhì)和生物大分子與固定相表面上配位基的專屬性親和力進(jìn)行分離的色譜方法。是生物大分子分離和分析的重要方法。第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理24（四）親和色譜法（affinitychromatograp課堂互動(dòng)請(qǐng)您總結(jié)正相與反相鍵合相色譜法的不同點(diǎn)。

第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理25課堂互動(dòng)第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理25實(shí)例分析牛黃解毒片中黃芩苷（弱酸性）含量測(cè)定條件如下：固定相：C18，流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（45∶55:0.2）請(qǐng)分析：①該試驗(yàn)采用的是哪一種色譜方法？②流動(dòng)相中為何加入磷酸？第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理26實(shí)例分析第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理26第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇一、固定相HPLC的固定相多采用化學(xué)鍵合相。鍵合相的特點(diǎn)：使用過程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適用梯度洗脫；載樣量大。第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇27第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇一、固定相第三節(jié)第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇（一）非極性鍵合相非極性烴基，如C18﹑C8等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，載樣量提高，穩(wěn)定性更好。28第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇（一）非極性鍵合第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇鍵合反應(yīng)硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)

29第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇鍵合反應(yīng)29第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇（二）中等極性鍵合相醚基鍵合相用于反相或正相色譜（三）極性鍵合相常用氨基（－NH2）﹑氰基（－CN）鍵合相一般用于正相色譜30第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇（二）中等極性第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇不與固定相發(fā)生反應(yīng)。對(duì)試樣有適宜的溶解度，要求k在1～10范圍內(nèi)。與檢測(cè)器相匹配，例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，不能選用對(duì)紫外光有吸收的溶劑。純度高，黏度小。常使用低黏度的甲醇、乙腈，可以降低柱壓，提高柱效。二、化學(xué)鍵合相的流動(dòng)相對(duì)流動(dòng)相的要求：31第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇不與固定相發(fā)生第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇

流動(dòng)相對(duì)分離的影響：溶劑的配比影響流動(dòng)相的洗脫能力，改變保留時(shí)間；溶劑種類影響流動(dòng)相的選擇性，改變分離效果。正相色譜法：溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)。反相色譜法：溶劑的極性強(qiáng)，洗脫能力弱。

32第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇流動(dòng)相對(duì)分第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇例如：水的極性大于甲醇，所以在反相色譜法中，甲醇的洗脫能力比水強(qiáng)，增大甲醇的比例，流動(dòng)相的洗脫能力增強(qiáng)，k與tR減小。33第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇例如：33第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇由于不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，有可能使被分離的兩個(gè)組分的分配系數(shù)不等，所以應(yīng)采用選擇性具有顯著差異的溶劑配制流動(dòng)相，從而獲得理想的分離。34第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇由于不同種類的第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇反相鍵合相色譜法常選用甲醇、乙腈和四氫呋喃為極性調(diào)節(jié)劑，水為底劑（洗脫強(qiáng)度較弱的溶劑）。一般情況下，甲醇-水能滿足多數(shù)樣品的分離要求，黏度小且價(jià)格低，因而是反相鍵合相色譜法中最常用的流動(dòng)相。35第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇反相鍵合相色譜第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇正相鍵合相色譜法常選用乙醚、氯仿和二氯甲烷為極性調(diào)節(jié)劑，正己烷為底劑。

36第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇正相鍵合相色譜課堂互動(dòng)

在反相色譜中，如果某組分保留時(shí)間較短，且與相鄰物質(zhì)沒能達(dá)到完全分離，您將如何處理？第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇37課堂互動(dòng)第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇37第四節(jié)分離條件的選擇第四節(jié)分離條件的選擇一、高效液相色譜中的速率理論GC中的速率理論方程式：HPLC中的速率理論方程式：

H=A+Cmu+Csmu

38第四節(jié)分離條件的選擇第四節(jié)分離條件的選擇38第四節(jié)分離條件的選擇渦流擴(kuò)散項(xiàng)(A)

A=2λdp

減少固定相顆粒的直徑（dp）；采用球形、粒度均勻的固定相，用勻漿法裝柱，以減小填充因子λ（同GC）。39第四節(jié)分離條件的選擇渦流擴(kuò)散項(xiàng)(A)A=2λ第四節(jié)分離條件的選擇縱向擴(kuò)散項(xiàng)(B/u)該項(xiàng)可忽略

B=2rDm

溶質(zhì)在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)（Dm）很小，室溫操作，且u大于u最佳。傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cu）

固定相傳質(zhì)阻力：CS可以忽略，因df（固定液膜厚度）極小。40第四節(jié)分離條件的選擇縱向擴(kuò)散項(xiàng)(B/u)該項(xiàng)可忽略第四節(jié)分離條件的選擇流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：

Cm與固定相顆粒粒度（dp

）及組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)

Dm有關(guān)。Dp越小，Cm越??；Dm越大，Cm越小。要求：dp小，Dm大。靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：由部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留而產(chǎn)生。靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，Dm∝T/η

要求:固定相粒度（dp2）、流動(dòng)相黏度（η）都小。41第四節(jié)分離條件的選擇流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：41第四節(jié)分離條件的選擇HPLC中的速率理論可表示為：

H=A+Cmu+Csmu

原因：HPLC中流動(dòng)相為液體，固定相為化學(xué)鍵合相。結(jié)果：HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：①小而均勻的球形化學(xué)鍵合相；②低粘度的流動(dòng)相，流速不宜過快；③柱溫適當(dāng)。

42第四節(jié)分離條件的選擇HPLC中的速率理論可表示為：42第四節(jié)分離條件的選擇課堂互動(dòng)請(qǐng)回答速率理論方程式在HPLC中與在GC中有何異同？如何選擇HPLC的實(shí)驗(yàn)條件？

43第四節(jié)分離條件的選擇課堂互動(dòng)43第四節(jié)分離條件的選擇二、正相鍵合相色譜法的分離條件固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等流動(dòng)相烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑（正己烷-甲醇）44第四節(jié)分離條件的選擇二、正相鍵合相色譜法的分離條件44第四節(jié)分離條件的選擇三、反相鍵合相色譜法的分離條件固定相非極性鍵合相如C18流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑。45第四節(jié)分離條件的選擇三、反相鍵合相色譜法的分離條件固定相第五節(jié)高效液相色譜儀第五節(jié)高效液相色譜儀輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)組成：46第五節(jié)高效液相色譜儀第五節(jié)高效液相色譜儀輸液系統(tǒng)組成：4進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑高壓泵混合器高效固定相在線檢測(cè)高靈敏檢測(cè)器高效液相色譜儀示意圖第五節(jié)高效液相色譜儀47進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑高壓泵混合器高效固定相在線檢測(cè)高輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬且可調(diào)能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕第五節(jié)高效液相色譜儀一、輸液系統(tǒng)（高壓輸液泵）48輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定第五節(jié)高效液相色譜儀一第五節(jié)高效液相色譜儀高壓輸液泵：恒流泵：在輸送流動(dòng)相過程中流量恒定，常用柱塞往復(fù)泵。雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)，常用串聯(lián)式。49第五節(jié)高效液相色譜儀高壓輸液泵：49

柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖1.轉(zhuǎn)動(dòng)凸輪2.柱塞3.密封墊4.液缸5.入口單向閥6.出口單向閥7.流動(dòng)相入口8.流動(dòng)相出口第五節(jié)高效液相色譜儀50柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖第五節(jié)高泵1泵2阻尼器單向閥串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵示意圖第五節(jié)高效液相色譜儀51泵1泵2阻尼器單向閥串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵示意圖第五節(jié)高效液相色等強(qiáng)度洗脫在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目少，性質(zhì)差別小的試樣。

梯度洗脫在一個(gè)分析周期內(nèi)，程序控制改變流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等。分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差別大的復(fù)雜試樣。

洗脫方式：第五節(jié)高效液相色譜儀52等強(qiáng)度洗脫洗脫方式：第五節(jié)高效液相色譜儀52第五節(jié)高效液相色譜儀進(jìn)樣器進(jìn)樣閥（六通閥），常用帶有定量管的六通閥自動(dòng)進(jìn)樣裝置二、進(jìn)樣系統(tǒng)53第五節(jié)高效液相色譜儀進(jìn)樣器二、進(jìn)樣系統(tǒng)53充樣位置（load)進(jìn)樣位置(inject)來(lái)自泵至色譜柱

來(lái)自泵至色譜柱廢液廢液六通閥進(jìn)樣示意圖第五節(jié)高效液相色譜儀54充樣位置（load)進(jìn)樣位置(inject)來(lái)自泵至色譜柱色譜柱（column）由柱管和固定相組成可重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要用經(jīng)過濾和脫氣的適當(dāng)溶劑沖洗色譜系統(tǒng)

三、分離系統(tǒng)第五節(jié)高效液相色譜儀55色譜柱（column）三、分離系統(tǒng)第五節(jié)高效液相色譜儀5第五節(jié)高效液相色譜儀對(duì)檢測(cè)器（detector）的要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測(cè)限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型）

四、檢測(cè)系統(tǒng)56第五節(jié)高效液相色譜儀對(duì)檢測(cè)器（detector）的要求：四第五節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)原理：朗伯-比爾定律：A=ECl特點(diǎn)：紫外檢測(cè)器的靈敏度、精密度及線性范圍好，不易受溫度和流速的影響，可用于梯度洗脫。

局限：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。為專屬型、濃度型檢測(cè)器。（一）紫外檢測(cè)器(ultravioletdetector)57第五節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)原理：朗伯-比爾定律：A=ECl（固定波長(zhǎng)檢測(cè)器：254nm可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：200~400（800）nm，光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiodearraydetector；PDAD)：

一系列光電二極管，可以進(jìn)行波長(zhǎng)快速掃描，同時(shí)獲得樣品的色譜圖和每個(gè)色譜組分的光譜圖。

吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量，

判斷峰純度。第五節(jié)高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器的分類：58固定波長(zhǎng)檢測(cè)器：254nm第五節(jié)高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器第五節(jié)高效液相色譜儀（二）熒光檢測(cè)器(fluorescencedetector；FD)特點(diǎn)：選擇性好，專屬型檢測(cè)器靈敏度比紫外檢測(cè)器高（檢測(cè)限10-10g/ml）其他檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、安培檢測(cè)器。59第五節(jié)高效液相色譜儀（二）熒光檢測(cè)器(fluorescen第五節(jié)高效液相色譜儀五、數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)微機(jī)采集和分析色譜數(shù)據(jù)給出峰寬、峰高、峰面積、對(duì)稱因子、分離度等色譜參數(shù)。

60第五節(jié)高效液相色譜儀五、數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)微機(jī)采集和分析色課堂互動(dòng)試說出高效液相色譜儀的基本組成及工作流程。第五節(jié)高效液相色譜儀61課堂互動(dòng)第五節(jié)高效液相色譜儀61第六節(jié)定性與定量分析方法一、定性分析方法二、定量分析方法（同GC）：外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法

第六節(jié)定性與定量分析方法62第六節(jié)定性與定量分析方法一、定性分析方法第六節(jié)定性與定量

一、學(xué)習(xí)內(nèi)容

1.化學(xué)鍵合相色譜法正相化學(xué)鍵合相色譜法：固定相極性大于流動(dòng)相極性反相化學(xué)鍵合相色譜法：固定相極性小于流動(dòng)相極性2.其他高效液相色譜法離子抑制色譜法；離子對(duì)色譜法離子色譜法；親和色譜法3.高效液相色譜法（化學(xué)鍵合相色譜法）中速率理論方程表達(dá)式：H=A+Cmu+Csmu。

學(xué)習(xí)小結(jié)63學(xué)習(xí)小結(jié)634.化學(xué)鍵合相色譜法的固定相、流動(dòng)相及分離條件的選擇正相鍵合相色譜法：固定相為極性，常用氰基、氨基鍵合相流動(dòng)相為非極性，常用甲醇-水分離溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性化合物反相鍵合相色譜法：固定相為非極性，常用C18流動(dòng)相為極性，常用甲醇-水分離非極性至中等極性的分子型化合物學(xué)習(xí)小結(jié)644.化學(xué)鍵合相色譜法的固定相、流動(dòng)相及分離條件的選擇學(xué)習(xí)小結(jié)5.高效液相色譜儀的組成輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)

分離系統(tǒng)

檢測(cè)系統(tǒng)

數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)6．HPLC定性與定量分析同GC

學(xué)習(xí)小結(jié)655.高效液相色譜儀的組成輸液系統(tǒng)學(xué)習(xí)小結(jié)65

目標(biāo)檢測(cè)一、選擇題1.HPLC與GC比較，可忽略縱向擴(kuò)散項(xiàng)，主要原因是：（）A.系統(tǒng)壓力較高B.流速比GC的快C.流動(dòng)相黏度大D.柱溫低2.在反相鍵合相色譜法中固定相與流動(dòng)相的極性關(guān)系是：（）A.固定相的極性＞流動(dòng)相的極性B.固定相的極性＜流動(dòng)相的極性

C.固定相的極性＝流動(dòng)相的極性D.不一定，視組分性質(zhì)而定66目標(biāo)檢測(cè)663.在反相鍵合相色譜法中，流動(dòng)相常用（）A．甲醇-水B.正己烷C.水D.正己烷-水4.在正相鍵合相色譜法中，流動(dòng)相常用（）甲醇-水B.烷烴加醇類C.水D.緩沖鹽溶液67675.在反相鍵合相色譜法中，流動(dòng)相的極性增大，洗脫能力（

）。A.降低

B.增強(qiáng)

C.不變化

D.不能確定6.用ODS柱分析一弱極性物質(zhì)，以某一比例甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，樣品的K值較小，若想增大K值應(yīng)（）。增加甲醇的比例B.增加水的比例C.增加流速D.降低流速685.在反相鍵合相色譜法中，流動(dòng)相的極性增大，洗脫能力（7.下列對(duì)反相鍵合相色譜法的描述，不正確的是（

）A.流動(dòng)相為極性

C.適于分離非水溶性的弱極性物質(zhì)B.固定相為非極性

D.流動(dòng)相極性變大，洗脫能力變大8.在反相鍵合相色譜法中，若以甲醇-水為流動(dòng)相，增加甲醇的比例時(shí)，組分的容量因子k與保留時(shí)間tR將有何變化？（）A.k與tR增大B.k與tR減小C.k與tR不變D.k增大，tR減小697.下列對(duì)反相鍵合相色譜法的描述，不正確的是（）69本章結(jié)束！謝謝！70本章結(jié)束！70第十三章高效液相色譜法

◆學(xué)習(xí)目的⊙◆知識(shí)要求⊙◆能力要求⊙◆進(jìn)入章節(jié)學(xué)習(xí)請(qǐng)點(diǎn)這里第1節(jié)第2節(jié)第3節(jié)第4節(jié)第5節(jié)第6節(jié)71第十三章高效液相色譜法◆學(xué)習(xí)目的⊙1◆學(xué)習(xí)目的通過學(xué)習(xí)高效液相色譜法的特點(diǎn)、類型、速率理論、分離條件和高效液相色譜儀的主要部件及工作流程，加深對(duì)高效液相色譜法的分離原理、條件的理解，熟悉主要類型特別是化學(xué)鍵合相色譜法的特點(diǎn)和應(yīng)用，能利用高效液相色譜儀對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離與分析。為學(xué)習(xí)藥物分析、天然藥物化學(xué)等專業(yè)課程奠定基礎(chǔ)。72◆學(xué)習(xí)目的通過學(xué)習(xí)高效液相色譜法的特點(diǎn)、類型、速率理論、分離◆知識(shí)要求1.熟悉高效液相色譜法的主要類型，化學(xué)鍵合相色譜法及其流動(dòng)相、固定相的選擇；高效液相色譜法速率理論的特點(diǎn)及分離條件的選擇，高效液相色譜儀的主要部件，定性與定量分析方法。2.了解高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法、氣相色譜法的區(qū)別，其他類型高效液相色譜法在分析中的應(yīng)用。73◆知識(shí)要求1.熟悉高效液相色譜法的主要類型，化學(xué)鍵合相色譜法◆能力要求掌握高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及儀器的基本操作方法，學(xué)會(huì)使用高效液相色譜儀對(duì)藥物進(jìn)行分離與分析的操作技術(shù)。74◆能力要求掌握高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及儀器的基本操作方法，第一節(jié)概述

第一節(jié)概述

高效液相色譜法（HPLC）的特點(diǎn)：以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)高壓輸送流動(dòng)相高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器現(xiàn)代液相色譜分析方法（具有分離、分析雙重作用）75第一節(jié)概述第一節(jié)概述5第一節(jié)概述一、與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)109g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1012g。76第一節(jié)概述一、與經(jīng)典液相色譜法相比6第一節(jié)概述二、與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；流動(dòng)相的選擇范圍寬，使分離的選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。77第一節(jié)概述二、與氣相色譜法相比7課堂互動(dòng)您能比較HPLC與GC和LC的主要區(qū)別嗎？第一節(jié)概述78課堂互動(dòng)您能比較HPLC與GC和LC的主要區(qū)別嗎？第一節(jié)概第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理

第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理

一、主要類型 化學(xué)鍵合相色譜法離子抑制色譜法離子對(duì)色譜法離子色譜法親合色譜法79第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理第二節(jié)第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理二、化學(xué)鍵合相色譜法以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)?；瘜W(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相。

80第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理二、化學(xué)鍵合相色譜第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理鍵合相色譜法的優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，使用過程中不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高。根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱分類：分為正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法。

81第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理鍵合相色譜法的優(yōu)點(diǎn)第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（一）正相鍵合相色譜法（固定相極性大于流動(dòng)相極性）固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)節(jié)劑如烷烴加醇類（正己烷-甲醇）。適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。82第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（一）正相鍵合相色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制：分配：把有機(jī)鍵合層看作一層液膜，溶質(zhì)在兩相間溶解。極性強(qiáng)的組分k大，保留時(shí)間（tR）長(zhǎng),后洗脫出柱。83第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制：13第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）反相鍵合相色譜法（固定相極性小于流動(dòng)相極性）固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠。流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)節(jié)劑，常用甲醇-水、乙腈-水等。應(yīng)用范圍：較廣泛，適用于非極性至中等極性的組分分離。84第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）反相鍵合相色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制－保留行為主要是利用非極性溶質(zhì)分子或溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與極性溶劑接觸時(shí)產(chǎn)生排斥力，而從溶劑中被“擠出”，即產(chǎn)生疏溶劑作用，促使溶質(zhì)分子與鍵合相表面的非極性的烷基發(fā)生疏水締合，而使溶質(zhì)分子保留在固定相中。85第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分離機(jī)制－保留行為第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理保留行為的主要影響因素溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）

極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大；反之亦然。

固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長(zhǎng)而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。86第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理保留行為的主要影響第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理流動(dòng)相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑種類：水（洗脫能力弱）為弱溶劑，醇（洗脫能力強(qiáng)）為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大

87第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理流動(dòng)相17課堂討論欲測(cè)定的試樣為弱極性分子型有機(jī)化合物，您將采用哪種色譜方法，如何選擇固定相與流動(dòng)相？第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理88課堂討論欲測(cè)定的試樣為弱極性分子型有機(jī)化合物，您將采用哪種色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理三、其他高效液相色譜法（一）離子抑制色譜法

（ionsuppressionchromatography；ISC）通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，

適用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKb≤8的弱堿。89第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理三、其他高效液相色第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）離子對(duì)色譜法

（ionpairchromatography；IPC）把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，組分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子（counterion）生成中性離子對(duì)，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。該方法適用于分離可離子化或離子型的化合物，如生物堿類、兒茶酚氨類、有機(jī)酸類、維生素類、抗生素類藥物等。90第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理（二）離子對(duì)色譜法第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理--------------離子對(duì)模型以通式表示為：91第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理---------第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理分析酸類或帶負(fù)電荷的物質(zhì)，一般用季銨鹽；如四丁基銨磷酸鹽；

分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)，一般用烷基磺酸鹽或硫酸鹽。

適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇92第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理適用范圍和離子對(duì)試（三）離子色譜法（ionchromatography，IC）離子交換色譜法對(duì)許多正、負(fù)離子可實(shí)現(xiàn)分離。但由于一些常見的無(wú)機(jī)離子在可見或近紫外區(qū)沒有吸收，因此難用紫外-可見檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。1975年Small提出了將離子交換與電導(dǎo)檢測(cè)器相結(jié)合分析各種離子的方法并稱為離子色譜法。適用于分離陰、陽(yáng)離子，以及氨基酸、糖類、DNA和DNA水解物等。

第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理93（三）離子色譜法（ionchromatography，IC（四）親和色譜法（affinitychromatography，AC）親和色譜法是將具有生物活性的配位基鍵合到載體或基質(zhì)表面形成固定相，利用蛋白質(zhì)和生物大分子與固定相表面上配位基的專屬性親和力進(jìn)行分離的色譜方法。是生物大分子分離和分析的重要方法。第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理94（四）親和色譜法（affinitychromatograp課堂互動(dòng)請(qǐng)您總結(jié)正相與反相鍵合相色譜法的不同點(diǎn)。

第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理95課堂互動(dòng)第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理25實(shí)例分析牛黃解毒片中黃芩苷（弱酸性）含量測(cè)定條件如下：固定相：C18，流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（45∶55:0.2）請(qǐng)分析：①該試驗(yàn)采用的是哪一種色譜方法？②流動(dòng)相中為何加入磷酸？第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理96實(shí)例分析第二節(jié)高效液相色譜法的主要類型及原理26第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇一、固定相HPLC的固定相多采用化學(xué)鍵合相。鍵合相的特點(diǎn)：使用過程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適用梯度洗脫；載樣量大。第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇97第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇一、固定相第三節(jié)第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇（一）非極性鍵合相非極性烴基，如C18﹑C8等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，載樣量提高，穩(wěn)定性更好。98第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇（一）非極性鍵合第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇鍵合反應(yīng)硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)

99第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及選擇鍵合反應(yīng)29第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇（二）中等極性鍵合相醚基鍵合相用于反相或正相色譜（三）極性鍵合相常用氨基（－NH2）﹑氰基（－CN）鍵合相一般用于正相色譜100第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇（二）中等極性第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇不與固定相發(fā)生反應(yīng)。對(duì)試樣有適宜的溶解度，要求k在1～10范圍內(nèi)。與檢測(cè)器相匹配，例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，不能選用對(duì)紫外光有吸收的溶劑。純度高，黏度小。常使用低黏度的甲醇、乙腈，可以降低柱壓，提高柱效。二、化學(xué)鍵合相的流動(dòng)相對(duì)流動(dòng)相的要求：101第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇不與固定相發(fā)生第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇

流動(dòng)相對(duì)分離的影響：溶劑的配比影響流動(dòng)相的洗脫能力，改變保留時(shí)間；溶劑種類影響流動(dòng)相的選擇性，改變分離效果。正相色譜法：溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)。反相色譜法：溶劑的極性強(qiáng)，洗脫能力弱。

102第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇流動(dòng)相對(duì)分第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇例如：水的極性大于甲醇，所以在反相色譜法中，甲醇的洗脫能力比水強(qiáng)，增大甲醇的比例，流動(dòng)相的洗脫能力增強(qiáng)，k與tR減小。103第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇例如：33第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇由于不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，有可能使被分離的兩個(gè)組分的分配系數(shù)不等，所以應(yīng)采用選擇性具有顯著差異的溶劑配制流動(dòng)相，從而獲得理想的分離。104第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇由于不同種類的第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇反相鍵合相色譜法常選用甲醇、乙腈和四氫呋喃為極性調(diào)節(jié)劑，水為底劑（洗脫強(qiáng)度較弱的溶劑）。一般情況下，甲醇-水能滿足多數(shù)樣品的分離要求，黏度小且價(jià)格低，因而是反相鍵合相色譜法中最常用的流動(dòng)相。105第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇反相鍵合相色譜第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇正相鍵合相色譜法常選用乙醚、氯仿和二氯甲烷為極性調(diào)節(jié)劑，正己烷為底劑。

106第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇正相鍵合相色譜課堂互動(dòng)

在反相色譜中，如果某組分保留時(shí)間較短，且與相鄰物質(zhì)沒能達(dá)到完全分離，您將如何處理？第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇107課堂互動(dòng)第三節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇37第四節(jié)分離條件的選擇第四節(jié)分離條件的選擇一、高效液相色譜中的速率理論GC中的速率理論方程式：HPLC中的速率理論方程式：

H=A+Cmu+Csmu

108第四節(jié)分離條件的選擇第四節(jié)分離條件的選擇38第四節(jié)分離條件的選擇渦流擴(kuò)散項(xiàng)(A)

A=2λdp

減少固定相顆粒的直徑（dp）；采用球形、粒度均勻的固定相，用勻漿法裝柱，以減小填充因子λ（同GC）。109第四節(jié)分離條件的選擇渦流擴(kuò)散項(xiàng)(A)A=2λ第四節(jié)分離條件的選擇縱向擴(kuò)散項(xiàng)(B/u)該項(xiàng)可忽略

B=2rDm

溶質(zhì)在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)（Dm）很小，室溫操作，且u大于u最佳。傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cu）

固定相傳質(zhì)阻力：CS可以忽略，因df（固定液膜厚度）極小。110第四節(jié)分離條件的選擇縱向擴(kuò)散項(xiàng)(B/u)該項(xiàng)可忽略第四節(jié)分離條件的選擇流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：

Cm與固定相顆粒粒度（dp

）及組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)

Dm有關(guān)。Dp越小，Cm越??；Dm越大，Cm越小。要求：dp小，Dm大。靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：由部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留而產(chǎn)生。靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，Dm∝T/η

要求:固定相粒度（dp2）、流動(dòng)相黏度（η）都小。111第四節(jié)分離條件的選擇流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：41第四節(jié)分離條件的選擇HPLC中的速率理論可表示為：

H=A+Cmu+Csmu

原因：HPLC中流動(dòng)相為液體，固定相為化學(xué)鍵合相。結(jié)果：HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：①小而均勻的球形化學(xué)鍵合相；②低粘度的流動(dòng)相，流速不宜過快；③柱溫適當(dāng)。

112第四節(jié)分離條件的選擇HPLC中的速率理論可表示為：42第四節(jié)分離條件的選擇課堂互動(dòng)請(qǐng)回答速率理論方程式在HPLC中與在GC中有何異同？如何選擇HPLC的實(shí)驗(yàn)條件？

113第四節(jié)分離條件的選擇課堂互動(dòng)43第四節(jié)分離條件的選擇二、正相鍵合相色譜法的分離條件固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等流動(dòng)相烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑（正己烷-甲醇）114第四節(jié)分離條件的選擇二、正相鍵合相色譜法的分離條件44第四節(jié)分離條件的選擇三、反相鍵合相色譜法的分離條件固定相非極性鍵合相如C18流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑。115第四節(jié)分離條件的選擇三、反相鍵合相色譜法的分離條件固定相第五節(jié)高效液相色譜儀第五節(jié)高效液相色譜儀輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)組成：116第五節(jié)高效液相色譜儀第五節(jié)高效液相色譜儀輸液系統(tǒng)組成：4進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑高壓泵混合器高效固定相在線檢測(cè)高靈敏檢測(cè)器高效液相色譜儀示意圖第五節(jié)高效液相色譜儀117進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑高壓泵混合器高效固定相在線檢測(cè)高輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬且可調(diào)能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕第五節(jié)高效液相色譜儀一、輸液系統(tǒng)（高壓輸液泵）118輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定第五節(jié)高效液相色譜儀一第五節(jié)高效液相色譜儀高壓輸液泵：恒流泵：在輸送流動(dòng)相過程中流量恒定，常用柱塞往復(fù)泵。雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)，常用串聯(lián)式。119第五節(jié)高效液相色譜儀高壓輸液泵：49

柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖1.轉(zhuǎn)動(dòng)凸輪2.柱塞3.密封墊4.液缸5.入口單向閥6.出口單向閥7.流動(dòng)相入口8.流動(dòng)相出口第五節(jié)高效液相色譜儀120柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖第五節(jié)高泵1泵2阻尼器單向閥串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵示意圖第五節(jié)高效液相色譜儀121泵1泵2阻尼器單向閥串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵示意圖第五節(jié)高效液相色等強(qiáng)度洗脫在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目少，性質(zhì)差別小的試樣。

梯度洗脫在一個(gè)分析周期內(nèi)，程序控制改變流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等。分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差別大的復(fù)雜試樣。

洗脫方式：第五節(jié)高效液相色譜儀122等強(qiáng)度洗脫洗脫方式：第五節(jié)高效液相色譜儀52第五節(jié)高效液相色譜儀進(jìn)樣器進(jìn)樣閥（六通閥），常用帶有定量管的六通閥自動(dòng)進(jìn)樣裝置二、進(jìn)樣系統(tǒng)123第五節(jié)高效液相色譜儀進(jìn)樣器二、進(jìn)樣系統(tǒng)53充樣位置（load)進(jìn)樣位置(inject)來(lái)自泵至色譜柱

來(lái)自泵至色譜柱廢液廢液六通閥進(jìn)樣示意圖第五節(jié)高效液相色譜儀124充樣位置（load)進(jìn)樣位置(inject)來(lái)自泵至色譜柱色譜柱（column）由柱管和固定相組成可重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要用經(jīng)過濾和脫氣的適當(dāng)溶劑沖洗色譜系統(tǒng)

三、分離系統(tǒng)第五節(jié)高效液相色譜儀125色譜柱（column）三、分離系統(tǒng)第五節(jié)高效液相色譜儀5第五節(jié)高效液相色譜儀對(duì)檢測(cè)器（detector）的要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測(cè)限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型）

四、檢測(cè)系統(tǒng)126第五節(jié)高效液相色譜儀對(duì)檢測(cè)器（detector）的要求：四第五節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)原理：朗伯-比爾定律：A=ECl特點(diǎn)：紫外檢測(cè)器的靈敏度、精密度及線性范圍好，不易受溫度和流速的影響，可用于梯度洗脫。

局限：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。為專屬型、濃度型檢測(cè)器。（一）紫外檢測(cè)器(ultravioletdetector)127第五節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)原理：朗伯-比爾定律：A=ECl（固定波長(zhǎng)檢測(cè)器：254nm可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：200~400（800）nm，光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiodearraydetector；PDAD)：

一系列光電二極管，可以進(jìn)行波長(zhǎng)快速掃描，同時(shí)獲得樣品的色譜圖和每個(gè)色譜組分的光譜圖。