基因功能研究2RNi+Yeast課件

教師：王華單位：吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室電話：85619369(L)

E-mail:wanghua1973@Strategiesforanalyzinggenefunction基因功能的鑒定技術(shù)之二教師：王華電話：85619369(L)Strategie在mRNA水平上RNA干涉反義RNA在基因水平上基因敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上酵母雙雜交技術(shù)基因功能的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一，希望能發(fā)現(xiàn)更多的功能基因造福于人類。基因功能的鑒定技術(shù)之二在mRNA水平上RNA干涉反義RNA在基因水平上基因敲除技術(shù)反義RNA（anti-senseRNA）能與mRNA互補(bǔ)的RNA鏈,稱作反義RNA.反義技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例：用BCL-2Anti-senseoligonucleotide,通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)特定mRNA互補(bǔ)，封閉特定基因的表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的。治療B淋巴瘤和白血病。BCL-2癌基因第三節(jié)通過(guò)封閉mRNA，而使基因功能失活反義RNA（anti-senseRNA）能與mRNA互補(bǔ)的美國(guó)科學(xué)家安德魯·法爾(左)和克雷格·梅洛(右)：發(fā)現(xiàn)了ＲＮＡ干擾機(jī)制。2006年AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool第四節(jié)RNA干涉（RNAinterference,RNAi）美國(guó)科學(xué)家安德魯·法爾(左)和克雷格·梅洛(右)：發(fā)現(xiàn)了ＲＮ問(wèn):你知道最早發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象是在什么情況下嗎？1995年，康奈爾大學(xué)SuGou博士的實(shí)驗(yàn)：用反義RNA(anti-senseRNA)轉(zhuǎn)染線蟲(chóng)可以阻斷par-1基因的表達(dá)；在正義RNA(senseRNA)的對(duì)照組中也出現(xiàn)了基因受抑現(xiàn)象。Larva:幼蟲(chóng)Moult:脫毛

線蟲(chóng)的優(yōu)點(diǎn)：1.可用大腸桿菌飼喂2.about1000cells,3.基因組小(100Mbp)4.在生活史的各階段皆透明

5.3.5天一代.Hatch:孵化提示:一些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可能是當(dāng)時(shí)知識(shí)背景下所不能認(rèn)識(shí)的，但客觀地呈現(xiàn)這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是非常重要的。許多科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)都源于意外的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象諸如：RNAi現(xiàn)象青霉素——霉菌，抑菌環(huán)葡萄酒——葡萄變“壞”偉哥——心腸變硬的藥，提高性欲，治療冠心病純化抗體——雜蛋白吸附到介質(zhì)上（pH值的變化）

Why？該研究小組一直沒(méi)能給這個(gè)意外以合理解釋。

一、RNAi的歷史問(wèn):1995年，Larva:幼蟲(chóng)線蟲(chóng)的優(yōu)點(diǎn)：Hatc（1）用純化后的單鏈RNA注射線蟲(chóng)，基因抑制現(xiàn)象是非常微弱的?。?）將雙鏈RNA給線蟲(chóng)注射，出現(xiàn)了高效、特異性的基因抑制效應(yīng)。（3）SuGuo博士在轉(zhuǎn)染正義RNA時(shí)污染了微量反義RNA，“十分錯(cuò)誤”地將雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入了細(xì)胞。AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool1998年:Fire和Mello的實(shí)驗(yàn)揭開(kāi)這個(gè)懸疑之謎：他們將這種由雙鏈RNA引起的特異性基因抑制現(xiàn)象，稱作RNA干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：（1）RNAi的活性可以遠(yuǎn)程表現(xiàn)（2）RNAi的作用可傳給后代☆在C.elegans應(yīng)用雙鏈RNA的途徑：（1）直接注射到腸道（2）飼喂（3）浸泡例如：GFP轉(zhuǎn)基因植物的葉子:從葉片的一端注射GFPsiRNA,可干擾整個(gè)葉片GFP的表達(dá)。RNAi廣泛存在于自然界（1）用純化后的單鏈RNA注射線蟲(chóng)，基因抑制現(xiàn)象是非常微弱的想想：

由于antisense-RNA的原因,在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)dsRNA正常嗎？細(xì)胞內(nèi)是否存在特異性降解dsRNA的機(jī)制？Dicer負(fù)責(zé)識(shí)別并切割dsRNARNaseⅢ家族中成員識(shí)別、降解雙鏈RNA產(chǎn)生約21~23nt

bp片段每個(gè)片段3端有2個(gè)堿基突出二、RNA干涉（RNAi）的機(jī)理想想：Dicer負(fù)責(zé)識(shí)別并切割dsRNARNaseⅢ家族活化階段：siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC中的解旋酶將其中的siRNA變成單鏈,成為activatedRISC。Longdouble-strandedRNAs(dsRNAs;typically>200nt)canbeusedtosilencetheexpressionoftargetgenesinavarietyoforganismsandcelltypes(e.g.,worms,fruitflies,andplants).Uponintroduction,thelongdsRNAsenteracellularpathwaythatiscommonlyreferredtoastheRNAinterference(RNAi)pathway.First,thedsRNAsgetprocessedinto20-25nucleotide(nt)smallinterferingRNAs(siRNAs)byanRNaseIII-likeenzymecalledDicer(initiationstep).Then,thesiRNAsassembleintoendoribonuclease-containingcomplexesknownasRNA-inducedsilencingcomplexes(RISCs),unwindingintheprocess.ThesiRNAstrandssubsequentlyguidetheRISCstocomplementaryRNAmolecules,wheretheycleaveanddestroythecognateRNA(effecterstep).CleavageofcognateRNAtakesplacenearthemiddleoftheregionboundbythesiRNAstrand.Inmammaliancells,introductionoflongdsRNA(>30

nt)initiatesapotentantiviralresponse,exemplifiedbynonspecificinhibitionofproteinsynthesisandRNAdegradation.Themammalianantiviralresponsecanbebypassed,however,bytheintroductionorexpressionofsiRNAs.

效應(yīng)階段：ActivatedRISC與靶mRNA結(jié)合，利用自身核酸內(nèi)切酶活性在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置將mRNA切斷、降解靶mRNA。起始階段：異常dsRNA被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶特異識(shí)別、切割成長(zhǎng)21~23nt的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。ViralRNAViralRNAdsRNA激活Dicer，降解具有互補(bǔ)序列的外源RNA或細(xì)胞RNA。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA；RISC中的siRNA與靶RNA結(jié)合時(shí)還可作為引物，并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，合成更多新的dsRNA；新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。二、RNA干涉（RNAi）的機(jī)理*RNA干擾過(guò)程主要有3個(gè)步驟：活化階段：siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱三、RNAi技術(shù)利用短雙鏈RNA

(siRNA)

能啟動(dòng)特定mRNA降解的特性，將人工設(shè)計(jì)的

siRNA

導(dǎo)入靶細(xì)胞中，啟動(dòng)RNAi，從而誘導(dǎo)特定mRNA降解，抑制特定基因表達(dá)的技術(shù)。*三、RNAi技術(shù)利用短雙鏈RNA(siRNA)能啟確定目的基因設(shè)計(jì)SiRNA

序列化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄在體外，獲得

SiRNA構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SiRNARNAi效果檢測(cè)如何開(kāi)展RNAi實(shí)驗(yàn)？確定目的基因設(shè)計(jì)SiRNA序列化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄在體外，構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNApolⅢ啟動(dòng)子(U6)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小分子RNA。BamHIHindIIII將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生發(fā)夾siRNAUU3’5’UUCAAGAGALoopSensestrandAntisensestrand19nt了解構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNApolⅢ啟動(dòng)子UUSiRNADicerRNaseIIIA.TransfectionABCTargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNADSiRNA如何開(kāi)展RNAi實(shí)驗(yàn)？UUSiRNADicerA.TransfectionABC四、SiRNA的設(shè)計(jì)原則：隨機(jī)選取不考慮位點(diǎn)信息脫靶效應(yīng)嚴(yán)重NCBI軟件生物信息分析具有最小脫靶效應(yīng)的功能性siRNA避開(kāi)起始100bpAA（N19）TTGC含量BLAST檢索….大量篩選了解四、SiRNA的設(shè)計(jì)原則：隨機(jī)選取NCBI五、RNAi技術(shù)的應(yīng)用

1)研究基因的功能用RNAi來(lái)抑制癌基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞2)封閉有害基因的表達(dá)：抗腫瘤、抗病毒縮短人類對(duì)基因功能的認(rèn)識(shí)時(shí)間CD4

siRNA封閉受體，使HIV不易進(jìn)入宿主細(xì)胞。p24siRNA

抑制HIV蛋白質(zhì)的合成和HIV的復(fù)制。五、RNAi技術(shù)的應(yīng)用1)研究基因的功能用R六、RNAi技術(shù)優(yōu)點(diǎn)RNAi(knockdown)VS同源重組(knockout)高效率易于操縱可實(shí)現(xiàn)多種基因突變六、RNAi技術(shù)優(yōu)點(diǎn)RNAi(knockdown)VRNA干擾(RNAinterference,RNAi)*

是由短雙鏈RNA（double-strandedRNA，SiRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。

其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。mRNAsiRNAsiRNA是可以反復(fù)利用的!通過(guò)封閉mRNA反推基因的功能Summary:Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS相關(guān)技術(shù)：Anti-senseRNARNAi橙色：解旋酶綠色：內(nèi)切酶

由于使用RNAi技術(shù)可以特異性關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療。RNA干擾(RNAinterference,基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反義RNA在基因水平上基因敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上酵母雙雜交技術(shù)基因功能的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一，希望能發(fā)現(xiàn)更多的功能基因造福于人類?；蚬δ苎芯康牟呗栽趍RNA水平上RNA干涉反義RNA在基第五節(jié)酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）轉(zhuǎn)錄激活因子（TAF=BD+AD）ActivationdomainBD(AD)DNAbindingdomain(BD)回憶：轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)特征AD的作用：促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮活性所必需的，缺一不可。一、原理第五節(jié)酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）轉(zhuǎn)1.兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別與兩個(gè)蛋白融合，各自均沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活因子的活性第五節(jié)酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）一、原理1.兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別與兩個(gè)蛋白融合，各自均沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活因子的2.BD和AD空間位置靠近，可以恢復(fù)TAF的作用：BDADBD-融合蛋白(誘餌)AD-融合蛋白(待測(cè))兩個(gè)蛋白相互作用使BD和AD空間位置靠近一、原理2.BD和AD空間位置靠近，可以恢復(fù)TAF的作用：BDAD酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物酵母中，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來(lái)激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，并以報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物作為檢測(cè)信號(hào)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)間是否發(fā)生了相互作用的技術(shù)方法。體內(nèi)(活細(xì)胞內(nèi))檢測(cè)；敏感方法。報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物二、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是如何進(jìn)行的：二、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是如何進(jìn)行的：BD

MCSP

BDvectorligationligationTransformationTransformation1、構(gòu)建兩種酵母表達(dá)載體AD

MCSP

ADvector已知基因：baitcDNA文庫(kù)基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.selectedonTrpdeficientmedia.色氨酸expressGAL4-AD-Fishprotein.selectedonLeudeficientmedia.LeucineBDMCSPBDvectorligationligatMatingplatingTransformationTransformation交配2、將兩種載體放到一個(gè)酵母細(xì)胞中selectedonTrpdeficientmedia.selectedonLeudeficientmedia.只有共轉(zhuǎn)化成功的酵母菌才能在Trp

&Leudeficient的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)！BD

MCSP

BDvectorligationligationAD

MCSP

ADvector已知基因：bait未知基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.expressGAL4-AD-Fishprotein.MatingplatingTransformation3、篩選發(fā)生了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的酵母株報(bào)告基因----LacZ

基因和His基因的轉(zhuǎn)錄激活因子都是GAL4，即啟動(dòng)子上都有GAL4的bindingsite

。但啟動(dòng)子序列除了GAL4bindingsite相同外，其余序列完全不同。HistidineOnlyyeastcellsexpressinginteractingproteinsurvive.

LacZ表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)：使底物X-GAL顯藍(lán)色營(yíng)養(yǎng)代謝有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)：HIS基因的表達(dá)可以使酵母細(xì)胞在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的平板上生長(zhǎng)lacZGAL4-bindingsiteHis3PromoterReportorGene

酵母菌株Auxotrophic具有報(bào)告基因：LacZ和His。3、篩選發(fā)生了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的酵母株報(bào)告基因----4、分析Fish對(duì)AD-fish質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序、在cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較分析，確定fish確定這些發(fā)生了相互作用的蛋白質(zhì)中，哪些是目前未知的fish！4、分析Fish對(duì)AD-fish質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序、酵母雙雜交技術(shù)的基本過(guò)程fish酵母雙雜交技術(shù)的基本過(guò)程fish三、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、篩選與已知蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白，并確定其編碼基因2、檢測(cè)已知蛋白質(zhì)間的相互作用的結(jié)構(gòu)域及氨基酸序列通過(guò)對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸。三、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、篩選與已知蛋白質(zhì)相互作用的未知拓展知識(shí)拓展知識(shí)是細(xì)胞內(nèi)的一類非編碼小分子RNA(22nt±)細(xì)胞內(nèi)有microRNA(miRNA)miRNAgene-----Pre-microRNA(具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的ssRNA，約70nt）-----運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)-被Dicer切割miRNA控制著幾乎每一個(gè)人類基因的活動(dòng)。拓展知識(shí)1miRNA與siRNA之間有許多相同之處：1.二者的長(zhǎng)度都約在22nt左右。2.二者都依賴Dicer酶的加工,都是由雙鏈RNA或RNA前體形成的。3.

二者都是RISC組分，microRNA也可以引起mRNA降解。是細(xì)胞內(nèi)的一類非編碼小分子RNA(22nt±)細(xì)胞內(nèi)有mi

micro-RNA的形成及作用機(jī)制micro-RNA的形成及作用機(jī)制RNA干擾機(jī)制示意圖翻譯抑制（不完全匹配）剪切目的mRNA（完全匹配）RNA干擾機(jī)制示意圖翻譯抑制（不完全匹配）剪切目的mRNA1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，調(diào)節(jié)基因表達(dá),是生物所固有的；

而siRNA是人工體外合成的，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。正常情況下只有在病毒或其它dsRNA誘導(dǎo)情況下才產(chǎn)生siRNA，作為miRNA的完善和補(bǔ)充。2.在作用位置上：miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3′-UTR區(qū)，可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解;而siRNA可作用于mRNA的任何部位，只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解。miRNA與siRNA的區(qū)別：1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，調(diào)節(jié)基因表達(dá),是生物所固問(wèn)：RNAi為什么可能存在在脫靶(off-targeting)效應(yīng)？拓展知識(shí)2?1.正義鏈與RISC結(jié)合問(wèn)：RNAi為什么可能存在在脫靶(off-targetin?解決辦法：鏈偏好性（Strandbias）使RISC只結(jié)合SiRNA的反義鏈。?解決辦法：鏈偏好性（Strandbias）使RISC只結(jié)2.miRNA-likepathway：Off-targetsilencingviaseed-regionactivity2.miRNA-likepathway：Off-targ基因功能研究2RNi+Yeast課件難點(diǎn)：RNi的機(jī)理、酵母雙雜交的基本程序【重點(diǎn)內(nèi)容】二、機(jī)理*一、定義

*三、生物學(xué)意義*第三節(jié)RNi第四節(jié)酵母雙雜交二、原理*一、定義

*三、基本程序難點(diǎn)：RNi的機(jī)理、酵母雙雜交的基本程序【重點(diǎn)內(nèi)容】二、機(jī)理【課后思考】miRNA的檢測(cè)在乳腺癌或胃腸癌的診斷或用藥指導(dǎo)方面的應(yīng)用?！菊n后思考】miRNA的檢測(cè)在乳腺癌或胃腸癌的診斷或用藥指導(dǎo)教師：王華單位：吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室電話：85619369(L)

E-mail:wanghua1973@Strategiesforanalyzinggenefunction基因功能的鑒定技術(shù)之二教師：王華電話：85619369(L)Strategie在mRNA水平上RNA干涉反義RNA在基因水平上基因敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上酵母雙雜交技術(shù)基因功能的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一，希望能發(fā)現(xiàn)更多的功能基因造福于人類。基因功能的鑒定技術(shù)之二在mRNA水平上RNA干涉反義RNA在基因水平上基因敲除技術(shù)反義RNA（anti-senseRNA）能與mRNA互補(bǔ)的RNA鏈,稱作反義RNA.反義技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例：用BCL-2Anti-senseoligonucleotide,通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)特定mRNA互補(bǔ)，封閉特定基因的表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的。治療B淋巴瘤和白血病。BCL-2癌基因第三節(jié)通過(guò)封閉mRNA，而使基因功能失活反義RNA（anti-senseRNA）能與mRNA互補(bǔ)的美國(guó)科學(xué)家安德魯·法爾(左)和克雷格·梅洛(右)：發(fā)現(xiàn)了ＲＮＡ干擾機(jī)制。2006年AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool第四節(jié)RNA干涉（RNAinterference,RNAi）美國(guó)科學(xué)家安德魯·法爾(左)和克雷格·梅洛(右)：發(fā)現(xiàn)了ＲＮ問(wèn):你知道最早發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象是在什么情況下嗎？1995年，康奈爾大學(xué)SuGou博士的實(shí)驗(yàn)：用反義RNA(anti-senseRNA)轉(zhuǎn)染線蟲(chóng)可以阻斷par-1基因的表達(dá)；在正義RNA(senseRNA)的對(duì)照組中也出現(xiàn)了基因受抑現(xiàn)象。Larva:幼蟲(chóng)Moult:脫毛

線蟲(chóng)的優(yōu)點(diǎn)：1.可用大腸桿菌飼喂2.about1000cells,3.基因組小(100Mbp)4.在生活史的各階段皆透明

5.3.5天一代.Hatch:孵化提示:一些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可能是當(dāng)時(shí)知識(shí)背景下所不能認(rèn)識(shí)的，但客觀地呈現(xiàn)這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是非常重要的。許多科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)都源于意外的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象諸如：RNAi現(xiàn)象青霉素——霉菌，抑菌環(huán)葡萄酒——葡萄變“壞”偉哥——心腸變硬的藥，提高性欲，治療冠心病純化抗體——雜蛋白吸附到介質(zhì)上（pH值的變化）

Why？該研究小組一直沒(méi)能給這個(gè)意外以合理解釋。

一、RNAi的歷史問(wèn):1995年，Larva:幼蟲(chóng)線蟲(chóng)的優(yōu)點(diǎn)：Hatc（1）用純化后的單鏈RNA注射線蟲(chóng)，基因抑制現(xiàn)象是非常微弱的?。?）將雙鏈RNA給線蟲(chóng)注射，出現(xiàn)了高效、特異性的基因抑制效應(yīng)。（3）SuGuo博士在轉(zhuǎn)染正義RNA時(shí)污染了微量反義RNA，“十分錯(cuò)誤”地將雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入了細(xì)胞。AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool1998年:Fire和Mello的實(shí)驗(yàn)揭開(kāi)這個(gè)懸疑之謎：他們將這種由雙鏈RNA引起的特異性基因抑制現(xiàn)象，稱作RNA干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：（1）RNAi的活性可以遠(yuǎn)程表現(xiàn)（2）RNAi的作用可傳給后代☆在C.elegans應(yīng)用雙鏈RNA的途徑：（1）直接注射到腸道（2）飼喂（3）浸泡例如：GFP轉(zhuǎn)基因植物的葉子:從葉片的一端注射GFPsiRNA,可干擾整個(gè)葉片GFP的表達(dá)。RNAi廣泛存在于自然界（1）用純化后的單鏈RNA注射線蟲(chóng)，基因抑制現(xiàn)象是非常微弱的想想：

由于antisense-RNA的原因,在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)dsRNA正常嗎？細(xì)胞內(nèi)是否存在特異性降解dsRNA的機(jī)制？Dicer負(fù)責(zé)識(shí)別并切割dsRNARNaseⅢ家族中成員識(shí)別、降解雙鏈RNA產(chǎn)生約21~23nt

bp片段每個(gè)片段3端有2個(gè)堿基突出二、RNA干涉（RNAi）的機(jī)理想想：Dicer負(fù)責(zé)識(shí)別并切割dsRNARNaseⅢ家族活化階段：siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC中的解旋酶將其中的siRNA變成單鏈,成為activatedRISC。Longdouble-strandedRNAs(dsRNAs;typically>200nt)canbeusedtosilencetheexpressionoftargetgenesinavarietyoforganismsandcelltypes(e.g.,worms,fruitflies,andplants).Uponintroduction,thelongdsRNAsenteracellularpathwaythatiscommonlyreferredtoastheRNAinterference(RNAi)pathway.First,thedsRNAsgetprocessedinto20-25nucleotide(nt)smallinterferingRNAs(siRNAs)byanRNaseIII-likeenzymecalledDicer(initiationstep).Then,thesiRNAsassembleintoendoribonuclease-containingcomplexesknownasRNA-inducedsilencingcomplexes(RISCs),unwindingintheprocess.ThesiRNAstrandssubsequentlyguidetheRISCstocomplementaryRNAmolecules,wheretheycleaveanddestroythecognateRNA(effecterstep).CleavageofcognateRNAtakesplacenearthemiddleoftheregionboundbythesiRNAstrand.Inmammaliancells,introductionoflongdsRNA(>30

nt)initiatesapotentantiviralresponse,exemplifiedbynonspecificinhibitionofproteinsynthesisandRNAdegradation.Themammalianantiviralresponsecanbebypassed,however,bytheintroductionorexpressionofsiRNAs.

效應(yīng)階段：ActivatedRISC與靶mRNA結(jié)合，利用自身核酸內(nèi)切酶活性在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置將mRNA切斷、降解靶mRNA。起始階段：異常dsRNA被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶特異識(shí)別、切割成長(zhǎng)21~23nt的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。ViralRNAViralRNAdsRNA激活Dicer，降解具有互補(bǔ)序列的外源RNA或細(xì)胞RNA。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA；RISC中的siRNA與靶RNA結(jié)合時(shí)還可作為引物，并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，合成更多新的dsRNA；新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。二、RNA干涉（RNAi）的機(jī)理*RNA干擾過(guò)程主要有3個(gè)步驟：活化階段：siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱三、RNAi技術(shù)利用短雙鏈RNA

(siRNA)

能啟動(dòng)特定mRNA降解的特性，將人工設(shè)計(jì)的

siRNA

導(dǎo)入靶細(xì)胞中，啟動(dòng)RNAi，從而誘導(dǎo)特定mRNA降解，抑制特定基因表達(dá)的技術(shù)。*三、RNAi技術(shù)利用短雙鏈RNA(siRNA)能啟確定目的基因設(shè)計(jì)SiRNA

序列化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄在體外，獲得

SiRNA構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SiRNARNAi效果檢測(cè)如何開(kāi)展RNAi實(shí)驗(yàn)？確定目的基因設(shè)計(jì)SiRNA序列化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄在體外，構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNApolⅢ啟動(dòng)子(U6)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小分子RNA。BamHIHindIIII將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生發(fā)夾siRNAUU3’5’UUCAAGAGALoopSensestrandAntisensestrand19nt了解構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNApolⅢ啟動(dòng)子UUSiRNADicerRNaseIIIA.TransfectionABCTargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNADSiRNA如何開(kāi)展RNAi實(shí)驗(yàn)？UUSiRNADicerA.TransfectionABC四、SiRNA的設(shè)計(jì)原則：隨機(jī)選取不考慮位點(diǎn)信息脫靶效應(yīng)嚴(yán)重NCBI軟件生物信息分析具有最小脫靶效應(yīng)的功能性siRNA避開(kāi)起始100bpAA（N19）TTGC含量BLAST檢索….大量篩選了解四、SiRNA的設(shè)計(jì)原則：隨機(jī)選取NCBI五、RNAi技術(shù)的應(yīng)用

1)研究基因的功能用RNAi來(lái)抑制癌基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞2)封閉有害基因的表達(dá)：抗腫瘤、抗病毒縮短人類對(duì)基因功能的認(rèn)識(shí)時(shí)間CD4

siRNA封閉受體，使HIV不易進(jìn)入宿主細(xì)胞。p24siRNA

抑制HIV蛋白質(zhì)的合成和HIV的復(fù)制。五、RNAi技術(shù)的應(yīng)用1)研究基因的功能用R六、RNAi技術(shù)優(yōu)點(diǎn)RNAi(knockdown)VS同源重組(knockout)高效率易于操縱可實(shí)現(xiàn)多種基因突變六、RNAi技術(shù)優(yōu)點(diǎn)RNAi(knockdown)VRNA干擾(RNAinterference,RNAi)*

是由短雙鏈RNA（double-strandedRNA，SiRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。

其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。mRNAsiRNAsiRNA是可以反復(fù)利用的!通過(guò)封閉mRNA反推基因的功能Summary:Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS相關(guān)技術(shù)：Anti-senseRNARNAi橙色：解旋酶綠色：內(nèi)切酶

由于使用RNAi技術(shù)可以特異性關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療。RNA干擾(RNAinterference,基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反義RNA在基因水平上基因敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上酵母雙雜交技術(shù)基因功能的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一，希望能發(fā)現(xiàn)更多的功能基因造福于人類?；蚬δ苎芯康牟呗栽趍RNA水平上RNA干涉反義RNA在基第五節(jié)酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）轉(zhuǎn)錄激活因子（TAF=BD+AD）ActivationdomainBD(AD)DNAbindingdomain(BD)回憶：轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)特征AD的作用：促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮活性所必需的，缺一不可。一、原理第五節(jié)酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）轉(zhuǎn)1.兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別與兩個(gè)蛋白融合，各自均沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活因子的活性第五節(jié)酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）一、原理1.兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別與兩個(gè)蛋白融合，各自均沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活因子的2.BD和AD空間位置靠近，可以恢復(fù)TAF的作用：BDADBD-融合蛋白(誘餌)AD-融合蛋白(待測(cè))兩個(gè)蛋白相互作用使BD和AD空間位置靠近一、原理2.BD和AD空間位置靠近，可以恢復(fù)TAF的作用：BDAD酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物酵母中，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來(lái)激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，并以報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物作為檢測(cè)信號(hào)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)間是否發(fā)生了相互作用的技術(shù)方法。體內(nèi)(活細(xì)胞內(nèi))檢測(cè)；敏感方法。報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄酵母雙雜交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物二、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是如何進(jìn)行的：二、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是如何進(jìn)行的：BD

MCSP

BDvectorligationligationTransformationTransformation1、構(gòu)建兩種酵母表達(dá)載體AD

MCSP

ADvector已知基因：baitcDNA文庫(kù)基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.selectedonTrpdeficientmedia.色氨酸expressGAL4-AD-Fishprotein.selectedonLeudeficientmedia.LeucineBDMCSPBDvectorligationligatMatingplatingTransformationTransformation交配2、將兩種載體放到一個(gè)酵母細(xì)胞中selectedonTrpdeficientmedia.selectedonLeudeficientmedia.只有共轉(zhuǎn)化成功的酵母菌才能在Trp

&Leudeficient的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)！BD

MCSP

BDvectorligationligationAD

MCSP

ADvector已知基因：bait未知基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.expressGAL4-AD-Fishprotein.MatingplatingTransformation3、篩選發(fā)生了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的酵母株報(bào)告基因----LacZ

基因和His基因的轉(zhuǎn)錄激活因子都是GAL4，即啟動(dòng)子上都有GAL4的bindingsite

。但啟動(dòng)子序列除了GAL4bindingsite相同外，其余序列完全不同。HistidineOnlyyeastcellsexpressinginteractingprote