腫瘤分子診斷課件

腫瘤分子診斷服務(wù)介紹2標(biāo)準(zhǔn)化用藥個(gè)體化用藥標(biāo)準(zhǔn)化用藥個(gè)體化用藥標(biāo)準(zhǔn)療法1標(biāo)準(zhǔn)療法2標(biāo)準(zhǔn)療法3腫瘤藥物與相關(guān)靶標(biāo)目前的服務(wù)目前的平臺(tái)目前的客戶腫瘤TaqMan-ARMs醫(yī)院感染性疾病測(cè)序健康管理公司新生兒篩查實(shí)時(shí)定量PCR研究所qPCR-HRM藥廠循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）保險(xiǎn)公司體細(xì)胞基因突變檢測(cè)mRNA表達(dá)檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)檢測(cè)基因多態(tài)性檢測(cè)體細(xì)胞基因突變檢測(cè)EGFR,K-RAS,B-RAF，C-KIT1、基因突變檢測(cè)技術(shù)

8——qPCR-HRM（可用于血漿標(biāo)本檢測(cè)）——Taqman-ARMS（與國(guó)際獲批的技術(shù)相當(dāng)）——DNA測(cè)序（基因突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)）突變檢測(cè)技術(shù)之一

qPCR-HRM10qPCR-HRM技術(shù)是基于高效穩(wěn)健的PCR上的高分辨熔解曲線分析（High-ResolutionMelting）技術(shù)，靈敏度可以達(dá)到1%-0.1%，既能檢測(cè)已知突變，也能檢測(cè)未知突變。

qPCR-HRM的突變檢測(cè)已獲國(guó)際多中心雙盲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（JournalofMolecularDiagnostics,Vol.11,No.6,November2009）。實(shí)例圖：利用HRM技術(shù)對(duì)7個(gè)樣本分別進(jìn)行EGFR（左圖）、KRAS（右圖）突變檢測(cè)，紅色表示該樣本發(fā)生突變，藍(lán)色表示未突變，藍(lán)色橫直線為陰性對(duì)照。左圖顯示2個(gè)樣本發(fā)生了EGFR突變；右圖顯示4個(gè)樣本發(fā)生了KRAS突變。EGFRKRAS國(guó)際公認(rèn)的分子檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)有明確的物價(jià)收費(fèi)實(shí)驗(yàn)流程較復(fù)雜，需要大型儀器突變檢測(cè)技術(shù)之一

DNA測(cè)序EGFR突變檢測(cè)EGFRE19/E21敏感突變

適合使用TKI藥物治療耐藥位點(diǎn)檢測(cè)T790MK-RAS突變檢測(cè)BRAFNCCN2010年NCCN《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》指出：K-ras基因?yàn)橐吧投瑫r(shí)具有BRAFV600E突變的患者，靶向EGFR抗體治療無效。BRAF-V600E檢測(cè)腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南（中國(guó)版）2010第一版指導(dǎo)腫瘤靶向治療的靶標(biāo)藥物名稱檢測(cè)靶標(biāo)檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)內(nèi)容吉非替尼/厄洛替尼EGFR基因突變野生型耐藥突變型敏感西妥昔單抗K-ras，B-raf基因突變野生型敏感突變型耐藥伊馬替尼C-Kit基因突變野生型耐藥突變型敏感基因多態(tài)性檢測(cè)與藥物代謝毒性(UGT1A1,CYP,DPD)2022/12/1220為什么

SNPs重要?個(gè)體1個(gè)體2=SNPvariationsinDNASNP標(biāo)志基因A基因B基因ASNP可能使基因B產(chǎn)生變異的蛋白質(zhì)分子2022/12/1221個(gè)體的SNP譜SNP譜ASNP譜BSNP譜CSNP譜FSNP譜ESNP譜D藥物代謝與SNP檢測(cè)化療藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝、分布和清除，通過其活性物質(zhì)對(duì)治療靶點(diǎn)的直接攻擊而發(fā)揮作用，整個(gè)過程需要多種蛋白質(zhì)/酶的共同參與和協(xié)同作用。SNP主要是指在基因組水平上變異頻率大于1%的單核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致不同個(gè)體體內(nèi)各種蛋白，酶活性的差異，因此導(dǎo)致藥物使用情況的不同。膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1A1）UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]:

野生型：6個(gè)TA

UGT1A1*6(G211A)：使UGT1A1的轉(zhuǎn)錄活性下降了三分之二。導(dǎo)致對(duì)伊立替康的毒性增加。FDA提示：UGT1A1的多態(tài)性-伊立替康的毒性增加(6TA)此型的酶活性是野生型的49％

。基因表達(dá)檢測(cè)（mRNA表達(dá)）(ERCC1\BRCA1\TUBB3\TS)基因表達(dá)檢測(cè)指標(biāo)（靶向藥物）相關(guān)腫瘤藥物名稱檢測(cè)靶標(biāo)檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)內(nèi)容結(jié)直腸癌貝伐單抗VEGFRmRNA表達(dá)水平高療效好低療效差乳腺癌曲妥珠單抗HER-2FISH/mRNA表達(dá)水平高療效好低療效差肝癌索拉非尼pDGFRmRNA表達(dá)水平低療效好高療效差28靶向藥物項(xiàng)目名稱樣本結(jié)果療效關(guān)系曲妥珠單抗HER2乳腺癌（手術(shù)/穿刺）+陽性療效好↑-↓HER2基因表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR方法替代FISH或免疫組化方法，臨床準(zhǔn)確率達(dá)97%以上。主要特點(diǎn)：客觀，不用人為觀察。時(shí)間短，整個(gè)檢測(cè)60分鐘左右完成。高通量，一次可以檢測(cè)6人份。貝伐單抗檢測(cè)基因-VEGFR化療藥物與檢測(cè)靶標(biāo)藥物名稱檢測(cè)靶標(biāo)檢測(cè)內(nèi)容奧沙利鉑/卡鉑/順鉑ERCC1/BRCA1mRNA表達(dá)水平

5-FU/培美曲賽TSmRNA表達(dá)水平紫杉醇/多西紫杉醇/長(zhǎng)春瑞濱STUBB3,STMN1mRNA表達(dá)水平替莫唑胺MGMTmRNA表達(dá)水平阿霉素/表柔比星TOPOⅡamRNA表達(dá)水平吉西他濱RRM1mRNA表達(dá)水平ERCC1表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)ERCC1陰性患者，能從鉑類輔助化療中獲益.BRCA1/2表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)BRCA1過度表達(dá)鉑類耐藥的預(yù)測(cè)因子抗微管類藥物的敏感因子34低TSmRNA水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長(zhǎng)。

TS低表達(dá)的患者對(duì)培美曲賽的療效好。TS高表達(dá)影響氟類和培美曲塞藥效ShirotaYetal.JClinOncol.2001;19:4298-304化療藥物與檢測(cè)靶標(biāo)藥物名稱檢測(cè)靶標(biāo)檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)內(nèi)容奧沙利鉑/卡鉑/順鉑ERCC1/BRCA1mRNA表達(dá)水平

高療效差低療效好5-FU/培美曲賽TSmRNA表達(dá)水平高療效差低療效好紫杉醇/多西紫杉醇/長(zhǎng)春瑞濱STUBB3,STMN1mRNA表達(dá)水平高療效差低療效好替莫唑胺MGMTmRNA表達(dá)水平高療效差低療效好阿霉素/表柔比星TOPOⅡamRNA表達(dá)水平高療效好低療效差吉西他濱RRM1mRNA表達(dá)水平高療效差低療效好小結(jié)藥物名稱靶標(biāo)檢測(cè)內(nèi)容化療藥物鉑類ERCC1，BRCA1mRNA水平，2項(xiàng)XRCC1，

GSTP1，

MRP2基因多態(tài)性，4項(xiàng)（女，6項(xiàng)）BRCA1(女)異環(huán)磷酰胺CYP2C9*3基因多態(tài)性，1項(xiàng)絲裂霉素NQO1基因多態(tài)性，1項(xiàng)依托泊苷TopoⅡαmRNA水平，1項(xiàng)CYP3A4*4,MDR1基因多態(tài)性，2項(xiàng)紫杉醇/多西紫杉醇/長(zhǎng)春瑞濱TUBB3,STMN1mRNA水平，2項(xiàng)CYP8*3基因多態(tài)性，1項(xiàng)伊立替康UGT1A1*6,

UGT1A1*28基因多態(tài)性，2項(xiàng)吉西他濱RRM1mRNA水平，1項(xiàng)CDA基因多態(tài)性，1項(xiàng)培美曲賽TSmRNA水平，1項(xiàng)靶向藥物吉非替尼/厄洛替尼EGFR(Exon19/20/21)基因突變，3項(xiàng)西妥昔單抗K-ras,B-raf基因突變，3項(xiàng)EGFRmRNA水平，1項(xiàng)貝伐單抗VEGFRmRNA水平，1項(xiàng)NSCLC個(gè)體化用藥系統(tǒng)方案

遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC)是由DNA錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR)發(fā)生基因突變導(dǎo)致的一種單基因的顯性遺傳疾病，又稱lynch綜合癥，發(fā)生基因異常的個(gè)體其患發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)約為60%。HNPCC實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程

1背景介紹之HNPCC與MMRMSI目前已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類HNPCC發(fā)生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突變占已發(fā)現(xiàn)突變的90%左右。391背景介紹之HNPCC與MMRMSI研究顯示，

約有86%-95%的HNPCC具有MSI特征，

而散發(fā)型大腸癌中只有16%。MSI所產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性將加速惡性腫瘤的發(fā)生。1997年美國(guó)NCI(nationalcancerinstitution)將MSI確定為檢測(cè)和篩選HNPCC的重要方法之一，并推薦將BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S2505個(gè)位點(diǎn)作為檢測(cè)HNPCC的位點(diǎn)。40實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程HNPCC檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)名稱檢測(cè)技術(shù)臨床意義MSI（5個(gè)位點(diǎn)）PCR+片段分析法HNPCC風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估明確是否檢測(cè)MMR突變MLH1,MSH2,MSH6基因突變檢測(cè)（35個(gè)外顯子）DNA測(cè)序HNPCC鑒別診斷確定突變位點(diǎn)，評(píng)估家族中高危個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)熱點(diǎn)突變檢測(cè)DNA測(cè)序確定家族中是否存在已知的突變標(biāo)本要求檢測(cè)名稱標(biāo)本要求MSI檢測(cè)病理蠟塊一份（或白片10片），外加5ml抗凝外周血，4度運(yùn)達(dá)MLH1,MSH2,MSH6基因突變檢測(cè)病理蠟塊一份（或白片10片），常溫運(yùn)達(dá)熱點(diǎn)突變檢測(cè)5ml抗凝外周血，4度運(yùn)達(dá)腫瘤在變"WecanlookattumorsforchangesattheDNA,RNAandproteinlevels.Itcertainlygivesusawayoflookingatwhatishappeninginsideatumor,andthat'sveryexciting."

Dr.GordonMillsChairSystemsBiologyMDAndersonCancerCenterHouston,TxAsreportedin“TheCancerTest”–TIME

(June

14,2007)/time/magazine/article/0,9171,1633070,00.html循環(huán)腫瘤細(xì)胞1869年AustMedJ，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli證實(shí)治療前CTC數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實(shí)體瘤中脫離出來并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。原發(fā)腫瘤血管生成侵潤(rùn)侵入血管內(nèi)侵入血管外

(CTC)血管內(nèi)增殖

(CTM)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移播散腫瘤細(xì)胞（DTC）微轉(zhuǎn)移休眠灶循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）循環(huán)腫瘤

微栓（CTM）凋亡的CTC侵潤(rùn)腫瘤細(xì)胞

擴(kuò)增血管生成上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）間質(zhì)－上皮轉(zhuǎn)化（MET）轉(zhuǎn)移到骨髓和其他器官獲取CTC需要解決的技術(shù)問題從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞

將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而10mL血液中含有的白細(xì)胞約有1億個(gè)，紅細(xì)胞有500億個(gè)。三種技術(shù)過濾法ISET:

IsolationbySizeofEpithelialTumorcells8μm孔徑過濾膜，漏檢體積較小的腫瘤細(xì)胞敏感性低梯度密度法腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞密度小于1.077g/mlCTC純度低，混入較多白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞會(huì)遷移至血漿層，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)對(duì)細(xì)胞有毒性免疫磁珠法腫瘤細(xì)胞表面抗原EpCAM與包繞著磁珠的特異性單抗相結(jié)合CellSearch細(xì)胞保存方法長(zhǎng)達(dá)96小時(shí)實(shí)驗(yàn)室室間差異小EpCAM的假陽性和假陰性CellSearch是全球第一也是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）產(chǎn)品1983磁流體白細(xì)胞Anti-CD45CD45NucleusDAPI如何