二維核磁共振譜課件

二維核磁共振波譜法二維核磁共振(2DNMR)方法是Jeener于1971年首先提出的,是一維譜衍生出來的新實驗方法。引入二維后,

不僅可將化學位移、偶合常數(shù)等參數(shù)展開在二維平面上，減少了譜線的擁擠和重疊,

而且通過提供的HH、CH、CC之間的偶合作用以及空間的相互作用，確定它們之間的連接關系和空間構型，有利于復雜化合物的譜圖解析，特別是應用于復雜的天然產(chǎn)物和生物大分子的結構鑒定。2DNMR也是目前適用于研究溶液中生物大分子構象的唯一技術。1第一節(jié)基本原理

NMR一維譜的信號是一個頻率的函數(shù)，共振峰分布在一個頻率軸（或磁場）上，可記為S(ω)。二維譜信號是二個獨立頻率（或磁場）變量的函數(shù)，記為S(ω1,ω2),共振信號分布在兩個頻率軸組成的平面上。也就是說2DNMR將化學位移、偶合常數(shù)等NMR參數(shù)在二維平面上展開，于是在一般一維譜中重迭在一個坐標軸上的信號，被分散到由二個獨立的頻率軸構成的平面上，使得圖譜解析和尋找核之間的相互作用更為容易。不同的二維NMR方法得到的圖譜不同，二個坐標軸所代表的參數(shù)也不同。2一、1D-NMR到2D-NMR的技術變化（一）一維核磁共振譜及脈沖序列基本脈沖序列:33、混合期：由一組固定長度的脈沖和延遲組成。在此期間通過相干或極化的傳遞，建立檢測條件。混合期有可能不存在，它不是必不可少的（視二維譜的種類而定）4、檢測期：在此期間檢測作為t2函數(shù)的各種橫向矢量的FID的變化，它的初始相及幅度受到t1函數(shù)的調(diào)制。

與t2軸對應的ω2（F2軸），通常是化學位移，與t1軸對應的ω1（F1軸）是什么，取決于二維譜的類型。2、演化期：在t1開始時由一個脈沖或幾個脈沖使體系激發(fā)，使之處于非平衡狀態(tài)。t1=t+nΔt，逐步延長，其對應的核磁信號的相位和幅值也就不相同。5t1=t+nΔt實驗過程：二維核磁共振譜數(shù)據(jù)矩陣數(shù)據(jù)矩陣對t2FT數(shù)據(jù)矩陣對t1FTF2F16

用固定時間增量⊿t1依次遞增t1進行系列實驗，反復疊加，因t2時間檢測的信號S(t2)的振幅或相位受到s(t1)的調(diào)制，則接收的信號不僅與t2有關，還與t1有關。每改變一個t1，記錄S(t2),

因此得到分別以時間變量t1,

t2為行列排列數(shù)據(jù)矩陣，即在檢測期獲得一組FID信號，組成二維時間信號S(t1,t2)。因t1,t2是兩個獨立時間變量，可以分別對它們進行傅立葉變換，一次對t2,一次對t1,兩次傅立葉變換的結果，可以得到兩個頻率變量函數(shù)S(ω1,ω2)的二維譜。7二、常用2D-NMR圖譜的表現(xiàn)形式1.堆積圖堆積圖的優(yōu)點是直觀,具有立體感.缺點是難以確定吸收峰的頻率。大峰后面可能隱藏小峰，而且耗時較長。8β-紫羅蘭酮102.交叉峰交叉峰也稱為相關峰，它們不在對角線上，即坐標F1≠F2。交叉峰顯示了具有相同偶合常數(shù)的不同核之間的偶合（交叉）。交叉峰有兩組，分別出現(xiàn)在對角線兩側，并以對角線對稱。這兩組對角峰和交叉峰可以組成一個正方形，并且由此來推測這兩組核A和X有偶合關系。21534F2F15432112第二節(jié)二維J分解譜二維J分解譜是將不同的NMR信號分解在兩個不同的軸上，使重疊在一起的一維譜的化學位移δ和偶合常數(shù)J分解在平面兩個坐標上，提供了精確的偶合裂分關系，便于解析。二維J分解譜分為同核和異核J分解譜。一、氫、氫同核二維J分解譜同核二維J分解譜將1HNMR中重迭密集的譜線多重峰結構展開在一個二維平面上，可將偶合常數(shù)3JHH（或2JHH)與化學位移分別在F1、F2二個軸上給出。14在同核1H,1H－2DJ分解譜中，被測定的核為1H核。15反式丙烯酸乙酯的1H－1H同核二維J分解譜161/2JHH1718二、碳、氫異核二維J分解譜在異核13C,1H－2DJ分解譜中，被測定的核為13C核，分解譜的F2軸為13C化學位移δC，F(xiàn)1軸為1H與13C的偶合(1JCH)多重峰，為1/2JCH。出峰情況是CH為二重峰，CH2為三重峰，CH3為四重峰，季碳單峰或不出峰。20反式丙烯酸酯的13C,1HJ分解2D譜。

F2軸為13C的化學位移。F1軸為1JCH偶合的多重峰。21第三節(jié)同核化學位移相關譜一、氫、氫化學位移相關譜

1H-1H-COSY是1H核和1H核之間的化學位移相關譜。在通常的橫軸和縱軸上均設定為1H的化學位移值，兩個坐標軸上則顯示通常的一維1H譜。（1H-1HCorrelationspectroscopy，1H-1HCOSY）在該譜圖中出現(xiàn)了兩種峰，分別為對角峰及相關峰。同一氫核信號將在對角線上相交，相互偶合的兩個/組氫核信號將在相關峰上相交，一般反映的是3J偶合。231H-1HCOSY-900基本脈沖序列： 一般說來，在解析1H-1HCOSY譜時，應首先選擇一個容易識別，有確切歸屬的質(zhì)子，以該質(zhì)子為起點，通過確定各個質(zhì)子間的偶合關系，指定分子中全部或大部分質(zhì)子的歸屬，這就是我們通常所說的“從頭開始”法。24162627ArH-CH3-CH-CH2-CH2-CH2285H5/H2J偶合30二、碳、碳化學位移相關譜這是二維碳骨架直接測定法，是確定碳原子連接順序的實驗，采用一種天然豐度雙量子相干（INADEQUATE）技術進行測定。碳是組成分子骨架，它更能直接反映化學鍵的特征與取代情況。但是由于13C天然豐度僅僅為1.1%，出現(xiàn)相連13C-13C偶合的幾率為0.01％，使1JC-C測試非常困難,信號累加時間達兩天，只在迫不得以才做。兩個偶合的13C核能產(chǎn)生雙量子躍遷，躍遷頻率相等，孤立的碳則不能。31

2DINADEQUATE譜圖有兩種形式，第一種形式，F(xiàn)2軸是13C的化學位移，F(xiàn)1為雙量子躍遷頻率，水平連線表明一對偶合碳具有相同的雙量子躍遷頻率，可以判斷它們是直接相連的碳。另一種形式，F(xiàn)2軸F1軸都是13C的化學位移，相互偶合的碳核作為一對雙峰出現(xiàn)在對角線兩側對稱的位置上。依此類推可以找出化合物中所有13C原子連接順序。32332143567OHHO6-75-64-51-22-33-41423567F2F1346,75,127,118,108,95,1010,116,123513C-13C2DINADEQUATEspectrumofmenthol

F1(δ13C)F2(δ13C)103426185793,43,2422,181516,15,6 76 1,78,9 8,10910

4,8 4,5F2(δ13C)F1(δ13C)36一、13C檢測的異核化學位移相關譜所謂異核化學位移相關譜是兩個不同核的頻率通過標量偶合建立起來的相關譜.應用最廣泛的是1H-13CCOSY。第三節(jié)異核化學位移相關譜

13C-1HCOSY譜圖中F2為13C化學位移，F(xiàn)1為1H化學位移，沒有對角峰，其交叉峰表明C-H相連偶合的信息，季碳不出交叉峰。解析時，可以從一已知的氫核信號，根據(jù)相關關系，即可找到與之相連的13C信號，反之亦然?？梢詮淖V圖中得到1JC-H的結構信息。37385’32D13C-1HCOSYspectrum(1JCHcorrelations)2a2e1’2166’5C1,H1aC1,H1eC2,H2aC2,H2eC1’,H1’C4,H4C2’,H2’ C4’,H4’ C3,H34’2’41’3’

1a 1eδ1Ηδ13CF1F2C5,H5 C6’,H6’ C6,H63940 常規(guī)的13C檢測的異核直接相關譜，靈敏度低，樣品的用量較大，測定時間較長。HMQC（異核多量子相關譜）技術很好地克服了上述缺點，HMQC實驗是通過多量子相干，檢測1H信號而達到間接檢測13C的一種方法二、1H檢測的異核多量子相關譜（HMQC）HMQC(異核多量子相干譜)的優(yōu)點脈沖序列較簡單，參數(shù)設置容易。反式檢測氫維(f2)分辨率較高，靈敏度較高。缺點碳維(f1)分辨率低.—C1

—C2—C3—C4—H1H2H3H441HMQC是將1H信號的振幅及相位分別依13C化學位移及1H間的同核化學偶合信息調(diào)制，并通過直接檢測調(diào)制后的1H信號，獲得13C-1H化學位移相關數(shù)據(jù)。它所提供的信息及譜圖與1H-13CCOSY完全相同。圖上F2坐標是1H的化學位移,F1是13C化學位移，直接相連的13C與1H將在對應的13C化學位移與1H化學位移的交點處給出相關信號。不能得到季碳的結構信息。42HMQC譜434423678945三、1H檢測的異核單量子相關譜（HSQC）HSQC(HeteronuclearSingleQuantumCorrelation)與HMQC相似，也是通過1JCH偶合常數(shù)實現(xiàn)碳氫相關。相干傳遞是通過單量子相干機理。下面是基本的HSQC脈沖序列：1Ht1/2d1t1/213CDec.d2d2d2d2d2=1/41JCHHSQC譜的靈敏度比HMQC高，但HSQC包含較多射頻脈沖，要求實驗參數(shù)精確設置，否則誤差偏大。圖譜形式和解譜方法與HMQC相同。46

HMBC是heteronuclear

multipule

bond

correlation

的縮寫，表示異核遠程（多鍵）相關譜。與HMQC一樣，HMBC的譜圖也是是一種間接檢測實驗，是通過檢測H間接檢測C信號。橫坐標F2代表采樣的H

NMR的化學位移，縱坐標F1代表的是間接檢測的C

NMR的化學位移。相隔2-4個化學鍵相連的C、H原子就會在譜圖上出現(xiàn)交叉峰，即只要有交叉峰的出現(xiàn)，那么交叉峰所對應的H、C原子是通過2-4個化學鍵相連的（4J相連的交叉峰不一定出現(xiàn)）。

四、1H檢測的異核多量子遠程相關譜HMBC47根據(jù)HMBC譜所給出的H、C之間的關系，結合HMQC的譜圖，我們就能夠解決C原子的連接順序問題，這樣我們就能基本上確定有機化合物的骨架結構，基本上一個有機化合物的結構就能夠確定了。HMBC的主要問題在于并不能夠確定相關峰是二鍵、三鍵還是四鍵的耦合(四鍵偶合較少出現(xiàn))。HMBC可高靈敏度地檢測13C-1H遠程偶合，因此可得到有關季碳的結構信息及其被雜原子或季碳切斷的偶合系統(tǒng)之間的結構信息。48C2,C3andC4:QuaternaryorprotonatedcarbonsX:O,NHMQC是通過異核多量子相干把1H核和與其直接相連的13C核關聯(lián)起來，HMBC則是通過異核多量子相干把1H核和遠程偶合的13C核關聯(lián)了起來。HMBC是突出表現(xiàn)相隔2個至4個鍵的碳氫之間的偶合，交叉峰為單峰。但由于技術上的原因，有時不能完全去掉直接相連的碳氫之間的偶合1JCH,交叉峰表現(xiàn)為雙峰或三峰，中心對應δH，解析圖譜時要特別注意。49789654312987623確定H2確定C2-C=OH3與C5五交叉峰503鍵偶合3鍵偶合51HMQC52HMBC53第五節(jié)二維NOE譜一、二維NOESY二維NOE譜簡稱為NOESY，它反映了有機化合物結構中H核與H核之間空間距離的關系，而與二者間相距多少根化學鍵無關。因此對確定有機化合物結構、構型和構象以及生物大分子（如蛋白質(zhì)分子在溶液中的二級結構等）有著重要意義。909090t1tm54NOESY的譜圖與1H-1HCOSY非常相似，它的F2維和F1維上的投影均是氫譜，也有對角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個氫核之間有耦合關系，而是表示兩個氫核之間的空間位置接近。由于NOESY實驗是由COSY實驗發(fā)展而來為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn)COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析時需對照它的1H-1HCOSY譜將J偶合交叉峰扣除。55NOESY(H-3,H-2)交叉峰為J偶合峰5615867CH2NOESY-CH35758

2DNOESYspectrumofailanthoneacbda,cb,d

NOEc bdaNOE59二、二維ROESYNOESY譜是確定化合物立體結構時普遍應用的一種二維技術，但對于中等大小的分子（分子量約為1000-3000），有時NOE的增益為零，從NOESY譜上得不到相關的信息。而旋轉(zhuǎn)坐標系中的NOESY，我們稱之為ROESY譜則有效地克服了上述NOESY譜的不足，是一種解決中等大小化合物立體結構的理想技術，ROESY譜的解析方法和說明的問題與NOESY譜一致。60第六節(jié)一維、二維譜綜合解析一維譜的初步解析：分析一維1H譜，根據(jù)譜圖中化學位移值、耦合常數(shù)值、峰形和峰面積找出一些特征峰，并確定各譜線的大致歸屬和氫分布，確定O,N等雜原子的可能的連接。分析一維C譜，對照13C質(zhì)子噪聲去偶譜以及各個DEPT碳譜，確定各碳原子的級數(shù)和各譜線的大致歸屬，確定O,N等雜原子的可能的連接。一、解析步驟61解析H-HCOSY譜，從一維譜中已經(jīng)確定的氫譜線出發(fā)找到與之相關的其它譜線。解析13C-1HCOSY（HMQC、HSQC）譜，同樣從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關的碳譜線，以此推斷出這些碳譜線的歸屬。解析13C-1H遠程相關譜（HMBC），從已確定的碳譜線出發(fā)，找到與之相關的各氫譜線或從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關的碳譜線，由此完成對一些未知譜線的指認。借助二維核磁共振譜對圖譜作進一步的指認：注意排除一維譜與二維譜中的溶劑峰與雜質(zhì)峰62某化合物的分子式為C6H10O，請根據(jù)下列各譜推斷結構1H2H1H1H1H2H2HU=2二、解析實例63=CH2=CH-CH-CH2-CH2-CH22156436412211234C2-H25435543666/C1-H1H2-H3-H4-H5-H6,H6/H3-C3H4-C4H5-C5C6-H6,H6/或H6,H6/-C6HMQC1H-1H-COSY65

123413244231The1HNMRspectrumof2,3-dihydrofuran(F)showsresonancesat2.6(2H),4.2(2H),4.9(1H),6.2(1H)PPM.The13Cspectrumof(F)containsresonancesat28.5,68.6,98.4and145.0PPM.C4H6OU=2H,HCOSYHMQC661HNMR面積積分1