油菜籽中脂肪酸的測(cè)定

油菜籽中脂肪酸的測(cè)定一、概述菜籽油主要含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、芥酸等脂肪酸。菜油中芥酸凝固點(diǎn)高，4℃便可硬化，不易被消化吸收，直接影響了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。亞麻酸由于不飽和脂肪酸的含量高，容易發(fā)生氧化作用，油味變劣，不適于食品工業(yè)、烹飪用。而亞油酸對(duì)人類食用是有益的，菜籽油的理想的脂肪酸組成應(yīng)該是降低亞麻酸和芥酸，提高亞油酸以適于人類食用和工業(yè)生產(chǎn)的需要。國(guó)際市場(chǎng)要求食油芥酸含量低于5%，而我國(guó)一般菜籽油中芥酸含量達(dá)40%以上，為了提高菜籽油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，增加出口創(chuàng)匯，培育低芥酸、低硫甙的品種是當(dāng)務(wù)之急。我國(guó)已培育了一批低芥酸品種，開展了油菜脂肪酸組成的分析，這一工作是建立在氣相色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行的。20世紀(jì)60年代初期加拿大等國(guó)開始使用氣相色譜法測(cè)定菜籽油的脂肪酸的組成，后來為了適應(yīng)大量雜種后代的篩選，又采用紙層析法測(cè)定芥酸、亞油酸、亞麻酸的含量，以滿足單項(xiàng)脂肪酸的選育需要，同時(shí)還建立了紙帶層析法、芥酸冰凍法等半定量速測(cè)法與全定量氣液色譜法配合使用。氣相色譜法方法原理：將樣品中脂肪酸轉(zhuǎn)化成甲酯再用氣相色譜法測(cè)定。主要儀器：氣相色譜儀（島津GC-9A）、帶有氫離子化檢測(cè)器（量程103，衰減1）或其他型號(hào)氣相色譜儀。試劑（CH2）11COOCH3標(biāo)準(zhǔn)液。以上各種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)液的濃度均配制成為2mg*mL-1的正己烷溶液。例如配制芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)液稱取芥酸甲酯100mg溶解于正己烷溶液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用正已烷定容。色譜條件色譜柱（注1）。1.5m×3mm（內(nèi)徑）的玻璃柱。擔(dān)體?？寺迥飞巢–hromosorbW）80～100目。固定液。15%丁二酸二乙二醇聚酯（DEGS）。柱溫。195℃，檢測(cè)室溫度250℃，氣化室溫度250℃。載氣。N260mL·min-1。燃?xì)?。H250mL·min-1。空氣。Air500mL/min。操作步驟（1）制作脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣出峰保留時(shí)間。吸取上述各種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)液各1mL分別于10mL容量瓶中，用正己烷稀釋定容。此濃度均為0.2μg/μL。（2）樣品制備和測(cè)定。稱取油菜籽樣品0.3000g左右（100℃烘干，磨碎，過40目）。置于10mL磨口刻度試管中，加入2∶1（石油醚∶乙醚）混合液浸泡18h，連同殘?jiān)谠嚬軆?nèi)，加入0.4mol·L'KOH-甲醇溶液2mL，搖勻，靜置10min使其酯化。然后加入飽和NaCl溶液使油層上升至試管上部，取上層清液1mL至氣相色譜樣品小瓶中，加入2∶1（石油醚∶乙醚）混合液3mL混勻，供色譜進(jìn)樣用。吸取2μL注入色譜儀，與測(cè)定標(biāo)樣液相同條件下得出色譜圖（圖16-4）。結(jié)果計(jì)算按峰面積歸一化法計(jì)算，不考慮校正因子，注釋注1.色譜柱的制備∶①色譜柱的清洗對(duì)于玻璃柱可注入洗液浸泡洗滌2次，然后用自來水沖洗至呈中性，清潔的玻璃柱內(nèi)壁不應(yīng)掛有水珠，烘干后即可使用。對(duì)于不銹鋼柱，則應(yīng)用50g～100g·L-1的熱堿（NaOH）水溶液，抽洗4～5次，以除去管內(nèi)壁的油膩和污物，然后用水沖洗至呈中性，烘干后備用。②固定液的涂漬根據(jù)分析要求，選擇合適的固定液和擔(dān)體，確定固定液與擔(dān)體的質(zhì)量比，一般選擇在5∶100～30∶100之間。本實(shí)驗(yàn)液擔(dān)比為15∶100。涂漬的一般方法是取一定量的固定液溶解到適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中（丁二酸二乙二醇聚酯可溶于乙醚、丙酮、苯等溶劑中），溶劑量剛好浸沒所取擔(dān)體。待完全溶解后，將一定量的經(jīng)預(yù)處理和篩分過的擔(dān)體倒入溶液中，使溶劑慢慢地均勻地?fù)]發(fā)，在擔(dān)體表面形成一層薄而均勻的液膜，然后在通風(fēng)櫥中或紅外燈下除去溶劑，待溶劑完全揮發(fā)后即涂漬完畢。固定液量的確定應(yīng)先量出色譜柱內(nèi)容積并稱出該容積時(shí)擔(dān)體的質(zhì)量（實(shí)際應(yīng)取稍大于此量）由此計(jì)算出在選定液擔(dān)比下的固定液質(zhì)量。市售擔(dān)體有的已經(jīng)處理，過篩后即可使用。涂漬前把擔(dān)體放在100℃烘箱中烘4～6h，除去吸附在表面的水蒸氣。③固定相的填充∶將已洗凈烘干的色譜柱的一端塞上玻璃棉，包以紗布，接于真空泵上，在不斷抽氣下，在色譜柱的另一端通過小漏斗加入已涂漬好的固定相。在裝填同時(shí)，不斷輕輕敲振管壁，使固定相均勻而緊密地填入，直至固定相填滿不再進(jìn)柱為止（圖16-5）。④色譜柱老化填充好的色譜柱經(jīng)老化后才能使用。通過老化徹底除去固定相中殘剩的溶劑及其他易揮發(fā)雜質(zhì)，并促進(jìn)固定液均勻地、牢固地分布在擔(dān)體表面。老化的方法是將色譜柱直接接入氣路，載氣應(yīng)與裝柱時(shí)氣流同向，但不要接檢測(cè)器，以免檢測(cè)器沾污。通入載氣的流量一般為5～10mL·min~L。在稍高于操作時(shí)的柱溫5～10℃，但又不能超過固定液最高使用溫度的條件下，加熱4~8h。然后，接上檢測(cè)器，如基線平直，即可用于測(cè)定。薄層色譜法分離種子中主要不飽和脂肪酸目前定量脂肪酸大都采用氣相色譜儀或者薄層掃描儀配合進(jìn)行。由于儀器昂貴，難以推廣。國(guó)內(nèi)研究采用硅藻土G薄層板，選擇合適的展開劑、顯色劑及層析條件，可將種子中亞麻酸、亞油酸、油酸、花生烯酸、芥酸等5種不飽和脂肪酸的甲酯很好地分離開。此法簡(jiǎn)易、快速、斑點(diǎn)清晰，不用紫外檢測(cè)儀，在室內(nèi)光線下，憑肉眼就可以檢測(cè)色斑，并可初步進(jìn)行定量。方法原理根據(jù)不飽和脂肪酸碳原子數(shù)不同，極性不同，雙鍵數(shù)目不同，極性也不相同及反相色譜原理，在適宜的薄層上和展開劑中將主要的幾種不飽和脂肪酸分離開。薄層板上噴熒光素溶液后與溴作用轉(zhuǎn)變成不顯熒光的曙紅。若薄層上的斑點(diǎn)中有含乙烯基的化合物時(shí)，則溴與它作用，而不與熒光素作用，在長(zhǎng)波長(zhǎng)下顯示熒光。不飽和脂肪酸是含乙烯基的化合物，所以當(dāng)薄層上的斑點(diǎn)中有不飽和脂肪酸時(shí)可在粉紅色背景上出現(xiàn)黃綠色熒光斑點(diǎn)，而飽和脂肪酸沒有相當(dāng)于乙烯基的雙鍵，就沒有這種反應(yīng)。主要儀器涂布臺(tái)、涂布器、10cm×20cm玻璃板、玻璃研缽（直徑為7～8cm）、量筒；點(diǎn)樣臺(tái)、微量進(jìn)樣器、吹風(fēng)機(jī)、有蓋玻璃層析缸、玻璃噴霧器、玻璃干燥器（直徑為22cm）。試劑苯一石油醚（沸程30～60℃或60~90℃均可使用）（1∶1V/V）溶液。（2）0.4mol·L-’KOH—甲醇溶液。（3）硅藻土G。（4）1∶10液體石蠟一石油醚（沸程30～60℃）溶液。（5）展開劑。液體石蠟飽和的乙腈溶劑（注1）。（6）顯色劑，熒光素乙醇溶液。取熒光素0.06g溶于3.6mL0.1mol·LKOH溶液和180mL乙醇中。（7）150gL-1溴的四氯化碳溶液或者溴水均可。操作步驟（1）硅藻土G薄層板制備。取硅藻土G加適量水?dāng)噭?，再均勻涂?0cm×20cm的玻璃板上（厚0.2mm左右），風(fēng)干二天，經(jīng)10%液體石蠟一石油醚溶液中浸漬，再風(fēng)干。（2）樣品中脂肪酸提取與甲酯化稱取粉碎的樣品0.5～1.000g，加入苯-石油醚溶液2ml浸泡6h以上或者放置過夜提取脂肪酸，并加入0.4mol·L-KOH——甲醇溶液2mL，混勻，放置20min，再加入少量蒸餾水，待分層。（3）點(diǎn)樣、層析、顯色。用微量進(jìn)樣器吸取甲酯化的樣品液5～20μL，在制備好的玻璃薄板上點(diǎn)樣，放在液體石蠟飽和的乙腈溶劑中上行法展開10cm后（一般為16~22min）（*2），取出