中藥中黃曲霉毒素的檢測課件

中藥中黃曲霉毒素的測定目錄真菌毒素簡介黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素檢測藥典收載情況藥典檢測方法詳解注意事項及實驗室建議真菌毒素簡介真菌毒素：由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，由真菌菌核產(chǎn)生。Mycotoxin：源于希臘語（Mykes）和拉丁語（Toxicum）真菌毒素監(jiān)控意義真菌毒素對食品安全的危害真菌毒素對種、養(yǎng)殖業(yè)的危害真菌毒素對制藥行業(yè)的危害（中藥）國際貿(mào)易中作為技術(shù)壁壘在國際反恐和戰(zhàn)爭中，真菌毒素可作為大規(guī)模殺傷性生化武器黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)1960年，在英國東南部一些農(nóng)場中，有大約10萬只火雞不明原由地突然死亡。1961年發(fā)現(xiàn)火雞飼料中混有的花生粉能夠使大鼠誘發(fā)肝癌。1962年，研究發(fā)現(xiàn)花生粉中含有一種熒光物質(zhì)是導(dǎo)致?；痣u死亡的病因，這種熒光物質(zhì)被證實為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為“黃曲霉毒素(Aflatoxins)”。存在極其廣泛主要存在于土壤，動植物及各種堅果中。家庭自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。未能及時曬干或儲藏不當(dāng)?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在農(nóng)作物正常的生長期中也可以形成。中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的品種種子、果實、糧谷類中藥材發(fā)酵類中藥材動物類中藥材油性成分多的中藥材含上述種類藥材的中成藥化學(xué)結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)：是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素的衍生化合物目前發(fā)現(xiàn)約20余種，已分離鑒定出12種：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。B1：最常見、毒性及致癌性最強(qiáng)理化性質(zhì)黃曲霉毒素相對分子量312～346難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在pH為1～3的強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在pH為9～10的堿性溶液中分解迅速純品為無色結(jié)晶耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為268℃紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹薄層層析法：靈敏度低，定量困難HPLC-紫外檢測法：不衍生，靈敏度低，采用UPLC可以增強(qiáng)靈敏度HPLC-熒光檢測法：需衍生，靈敏度高高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：不需衍生，靈敏度高，假陽性少，成本高免疫化學(xué)分析方法

?酶聯(lián)免疫吸附法：快速、簡便、單一毒素、假陽多

?免疫親和柱-熒光分光光度法：高效、無毒、假陽多

?微柱篩選法：半定量，測總量

?一步式黃曲霉毒素檢測金標(biāo)試紙法：快速、現(xiàn)場大批量初篩黃曲霉毒素檢測藥典收載情況2005年增補(bǔ)本附錄

第一次增加了黃曲霉毒素測定法2010年版一部

?正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品種項下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查

?附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測定法2015年版四部通則增加中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則?基本原則（中藥中真菌毒素的分類、監(jiān)控品種、測定方法、限值擬定）?基本內(nèi)容（高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法）2015年版四部通則9302中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則中關(guān)于黃曲霉毒素的規(guī)定“由于黃曲霉毒素毒性強(qiáng)，目前國際上不建議設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量，也無最大限量理論值計算公式，限量越低越好”。黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解液相條件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化學(xué)衍生混合對照品溶液的制備：液體標(biāo)液（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3ug/ml）梯度稀釋500倍供試品溶液的制備：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫親和柱純化測定：吸取混合對照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取供試品溶液20-25μl，測定泵流操作架免疫親和柱HPLC-熒光檢測器光化學(xué)衍生器自動固相萃取儀凈化步驟取15ml（離心后的提取液），加水至50ml濾過，取20ml，通過免疫親和柱，流速3ml/min加水洗滌兩次，每次10ml過空氣10秒，將水?dāng)D出柱子分次加甲醇1.5ml，自然洗脫，過空氣，定容至2ml免疫親和柱的原理利用抗原－抗體免疫反應(yīng)的原理，使用大劑量的單克隆抗體，選擇性的將樣品提取液中的黃曲霉毒素吸附，用水將雜質(zhì)洗脫除去，再用甲醇定量將黃曲霉毒素洗脫，達(dá)到分離凈化目的黃曲霉毒素單克隆抗體雜質(zhì)藥典附錄收載的兩種衍生方法

?碘衍生法：碘作為衍生劑，對衍生溫度有要求，試劑對儀器有腐蝕性，需要沖洗

?光化學(xué)衍生法：紫外光燈（254nm）照射，操作簡單，對衍生溫度無要求，不需要其他衍生劑，無需沖洗對黃曲霉毒素B1和G1進(jìn)行衍生，黃曲霉毒素B2和G2不受該衍生步驟的影響AFB1AFG1黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化結(jié)果報告低于檢測限（標(biāo)出檢測限）

報告具體值

未檢出限度內(nèi)限度外報告具體值方法難點痕量分析——ppb級，要求高靈敏度毒性強(qiáng)，具有一定的風(fēng)險性——安全防護(hù)措施基質(zhì)復(fù)雜注意事項取樣的代表性

黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻免疫親和柱的使用

儲存、使用溫度（使用說明書）安全防護(hù)

操作人員專門培訓(xùn)，全程穿工作服佩戴手套注意事項及實驗室建議對照品的使用使用黃曲霉毒素混合對照品，不使用黃曲霉毒素固體純品自行配置

對照品貯備液避光、低溫、密閉保存，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用試驗廢棄物處理