蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定(SDS-聚丙烯酷胺凝膠電泳法)

蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）原理用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離鑒定蛋白質(zhì)（protein），主要依賴于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，再與標(biāo)準(zhǔn)樣品對照即可確定各區(qū)帶的成分。要利用凝膠電泳測定某樣品的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，就必須去掉其電荷效應(yīng)，使樣品的蛋白質(zhì)分子的遷移率完全取決于相對分子質(zhì)量。如在電泳體系中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS）。這種陰離子表面活性劑濃度大于1mmol/L時，以1.4eSDS與1g蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，這種負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別、從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)天然電荷差別。巰基乙醇是蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的還原劑，可使多肽組分分成單個亞單位。SDS可打斷蛋白質(zhì)的氫鍵。因此它與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們在水溶液中的形狀近似長橢圓的棒狀。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸改變與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比。所以，各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是按照分子的大小由凝膠的分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離，其有效遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成線性關(guān)系。這樣就可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未知樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料小麥芽。（二）儀器設(shè)備垂直板電泳槽及附件，直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，微量進(jìn)樣器，其他常用用具。（三）試劑（1）下層膠緩沖液：18.17gTris、0.4gSDS，溶于水.用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8，定容至100mL。（2）上層膠緩沖液：6.06gTris，0.4gSDS、溶于水，用1mol/LHCl調(diào)pH至6.8，定容100mL。（3）Acr/Bis貯備液：30gAcr、0.8gBis，溶解后定容至100mL。（4）10%過硫酸銨，用時現(xiàn)配。（5）樣品緩沖液：Tris0.6g、甘油5mL，SDS1g溶于水，用HCl調(diào)pH至8.0，再加溴酚藍(lán)0.1g，巰基乙醇2.5mL，定容至100mL。（6）電極緩沖液：Tris3.03g、Gly14.14g、SDS1.0g，溶于水，用HCL調(diào)pH至8.3，定容至1000mL。（7）染色液的配制：45%甲醇、0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250。（8）脫色液：2.5%甲醇、10%醋酸。（9）1.5%瓊脂：1.5g瓊脂溶于100mL電極緩沖液中，加熱溶解。（10）標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)。三、實驗步驟1.電泳槽的安裝干燥的兩塊玻璃板裝入配套塑料夾套內(nèi)，垂直固定在電泳槽上，周邊用1.5%的瓊脂密封（圖2-28-1）。2.樣品處理將各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測樣品（同實驗27）分別溶于蛋白質(zhì)處理液（濃度為2mg/mL），在沸水中加熱3～4min，待冷卻后作點樣用。3.制膠選擇合適的膠濃度按表2-28-1配制7.5%的分離膠，混合后將其沿長玻瑞板加入兩塊玻璃板之間（小心不要產(chǎn)生氣泡），加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即覆蓋2~3mm水層，靜止聚合約40min左右。膠聚合好的標(biāo)志是膠與水之間形成清晰的界面。吸取分離膠的水分，將配制好的濃縮膠（參照表2-28-1）注入分離膠之上，立即插上有機(jī)玻璃的點樣槽模板，待濃縮膠聚合好備用。4.點樣用微量注射器分別吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品液5gL，按相對分子質(zhì)量（從小到大）的順序注入樣品槽內(nèi)的濃縮膠面上，同時吸取待測樣品液25μL，注入其他樣品槽內(nèi)，在樣品上小心地注入電極緩沖液。5.電泳加樣完畢，兩槽注入電極緩沖液，接通電源（上負(fù)下正），調(diào)節(jié)電流為15mA，當(dāng)指示劑進(jìn)入分離膠后，電流需加大到30mA，電壓恒定在80~100V之間，約3~4h后，指示劑達(dá)到距前沿1~2cm時，可終止電泳（若pH不發(fā)生變化，電極緩沖液可反復(fù)使用，但上、下槽電極液應(yīng)分開貯存，這樣可防止在電泳過程中，剛從膠中遷移下來的鹽離子等物質(zhì)干擾下次電泳）。6.固定膠取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后將膠浸泡在25%異丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白質(zhì)就得到固定了。7.染色取出凝膠板，測定膠長（D1）后，加入染色液染色2h。脫色將膠放在脫色液中脫色0.5h，每隔0.5h換一次脫色液，至少換3次，待藍(lán)色基本脫掉，再放在脫色液里浸泡至蛋白質(zhì)譜帶清晰為止，精確測定膠長（D2）。四、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品遷移率和待測樣品相對分子質(zhì)量的計算精確測量溴酚藍(lán)和各種蛋白質(zhì)遷移距離。把溴酚藍(lán)遷移的距離定為d.，蛋白質(zhì)遷移距離定為d2，并以D1定為凝膠染色前的長度，D2定為凝膠染色后的長度。根據(jù)下面公式計算各種蛋白質(zhì)的遷移率R㎡:以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷