克隆基因的表達(dá)課件

第7章克隆基因的原核表達(dá)第7章克隆基因的原核表達(dá)basicprocessofDNArecombinationinvitro

體外DNA重組的基本步驟2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷連接到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（如：抗菌素抗性標(biāo)記）的載體分子上（DNA重組過程，需要各種工具酶的參與）3.重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?。*1.目的基因的獲?。簭膹?fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。

25.目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物basicprocessofDNArecombina原核生物中基因的表達(dá)操縱子↓多順反子mRNA↓多肽轉(zhuǎn)錄翻譯原核生物中基因的表達(dá)操縱子↓多順反子mRNA↓多肽轉(zhuǎn)錄翻譯真核生物中基因的表達(dá)基因↓前體mRNA↓成熟mRNA（單順反子）↓蛋白質(zhì)前體成熟蛋白質(zhì)↓轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)運，翻譯翻譯后加工真核生物中基因的表達(dá)基因↓前體mRNA↓成熟mRNA（單順反表達(dá)體載體宿主第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細(xì)胞表達(dá)體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個體表達(dá)體系的發(fā)展表達(dá)體載體contents1外源基因在原核生物(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、農(nóng)桿菌等)中的表達(dá)2外源基因在真核生物（酵母、植物、動物）中的表達(dá)contents1外源基因在原核生物(大腸桿菌、枯草芽孢桿1外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.1原核生物基因表達(dá)的特點1.2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的幾個必須的結(jié)構(gòu)1.3幾種類型的原核表達(dá)載體1.4提高基因表達(dá)效率的途徑1外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.1原核生物基因表達(dá)的特點1.1原核生物基因表達(dá)的特點①只有一種RNA聚合酶(真核細(xì)胞有三種)：催化所有RNA的合成。②基因的表達(dá)是以操縱子為單位的。③原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。④原核基因一般不含有內(nèi)含子(intron)，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。⑤原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。⑥mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個起始密碼子及同16S核糖體RNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，即SD序列，而真核基因則缺乏此序列。1.1原核生物基因表達(dá)的特點①只有一種RNA聚合酶(真核外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的必要條件

①通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；②

外源基因不能帶有內(nèi)含子，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA；③

必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；④

外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框(openreadingframe，ORF)；⑤

利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的必要條件①通過表達(dá)載體將外源基因大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物*大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)宿主菌。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素*大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能*理想的大腸桿菌表達(dá)載體（1）穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力，在無選擇壓力下能存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。（2）具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。（3）啟動子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控的，抑制時本底轉(zhuǎn)錄水平較低。（4）啟動子的轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止，轉(zhuǎn)錄過程不影響表達(dá)載體的復(fù)制。（5）具備適用于外源基因插入的酶切位點。復(fù)制起始位點、篩選標(biāo)志、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、核糖體結(jié)合位點和多克隆位點是構(gòu)成表達(dá)載體的最基本元件。理想的大腸桿菌表達(dá)載體（1）穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力，在無選1.2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的幾個必須的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄水平翻譯水平啟動子轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)1.2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的幾個必須的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄水平翻Ptac

=3Ptrp=11Plac啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGTPlLTTGACA

GATACTPrecATTGATA

TATAAT1.2.1原核表達(dá)載體常用的啟動子啟動子強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-Tac啟動子是由

trp的–35序列和

lacUV5（抗葡萄糖代謝阻遏的突變型大腸桿菌）的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于

trp和lacUV5啟動子（Ptac

=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

（1）Tac表達(dá)系統(tǒng)Tac啟動子是由trp的–35序列和laLac和Tac表達(dá)系統(tǒng)是最早建立并得到廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株常被選用為Lac、Tac表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。lac、tac啟動子的宿主菌lac、tac啟動子的宿主菌IPTG

（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于誘導(dǎo)

lac、tac啟動子的轉(zhuǎn)錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG

解決方法

lac

和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控（使用阻遏蛋白lacI的溫度敏感突變株lacI（ts）。在較低溫度（30℃）時外源基因表達(dá)受到抑制，在較高溫度（42℃）時則開放。）乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac

和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于誘導(dǎo)laIPTG誘導(dǎo)PGEX系列表達(dá)載體的表達(dá)原核表達(dá)載體PGEX系列帶有一個“tac”強(qiáng)啟動子，載體上還攜帶Laclq基因，編碼Lac抑制因子，當(dāng)無IPTG存在時，Lac阻遏蛋白能抑Ptac轉(zhuǎn)錄，保持低水平表達(dá)。加入誘導(dǎo)物IPTG時它可與Lac阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化，起到去阻遏作用，起動轉(zhuǎn)錄，高效表達(dá)。GST基因IPTG誘導(dǎo)PGEX系列表達(dá)載體的表達(dá)原核表達(dá)載體PGEX以λ噬菌體早期基因轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR

為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

PL、PR

表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)

的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR

啟動子的轉(zhuǎn)錄。（2）PL和PR表達(dá)系統(tǒng)以λ噬菌體早期基因轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR為核心構(gòu)建的表PL

和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問題由于PL和

PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或

PR表達(dá)系統(tǒng)。但在熱脈沖誘導(dǎo)過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果，對重組蛋白表達(dá)量有一定的影響。PL和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問題由于PL和PR表大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的。pET系列載體是這類表達(dá)載體的典型代表。

pET系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)常用宿主細(xì)胞為大腸桿菌菌株BL21（DE3）（因為菌株BL21（DE3）的染色體能表達(dá)T7噬菌體RNA聚合酶）等。

（3）T7表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。

在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。常見的有化學(xué)誘導(dǎo)型、溫度誘導(dǎo)型等。T7表達(dá)系統(tǒng)T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬克隆基因的表達(dá)課件克隆基因的表達(dá)課件（4）其他表達(dá)系統(tǒng)營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型、pH調(diào)控型等（4）其他表達(dá)系統(tǒng)營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型、pH調(diào)控型等外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的RNA混合物。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)。1.2.2轉(zhuǎn)錄終止子目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即R外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）通常在AUG上游3-11bp，長約3-9bp,5’UAAGGAGG3’1.2.3核糖體結(jié)合位點（RBS）外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以

GGAG

四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低mRNA與核糖體的結(jié)合程度一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。

緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。如：對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍SD序列與起始密碼子之間序列的影響SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約7個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低SD序列與起始密碼子之間距離的影響SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的

5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。

目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的。起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。因此對外源基因表達(dá)而言，需選擇宿主細(xì)胞偏愛的密碼子。1.2.4密碼子不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降。1.2.5質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細(xì)1.3幾種類型的原核表達(dá)載體1.3幾種類型的原核表達(dá)載體一種典型的大腸桿菌表達(dá)載體示意圖一種典型的大腸桿菌表達(dá)載體示意圖TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）編碼序列TAATGATAGTTtetrOriRBS大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分核糖體結(jié)合位點（與翻譯有關(guān)）轉(zhuǎn)錄終止子TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAG表達(dá)載體類型非融合型表達(dá)載體：---所表達(dá)的蛋白是天然完整蛋白（具有非常接近于真核細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。但也易被細(xì)菌蛋白酶破壞）融合型表達(dá)載體：----所表達(dá)的蛋白是融合蛋白（穩(wěn)定性大大增加，不易被細(xì)菌蛋白酶降解；也易于分離純化）分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙表達(dá)載體類型非融合型表達(dá)載體：---所表達(dá)的蛋白是天然完整蛋1.3.1非融合型表達(dá)載體為了在原核生物細(xì)胞中表達(dá)出非融合蛋白，可將帶有起始密碼ATG的真核基因插入到原核啟動子和SD序列的下游，組成一個雜合的核糖體結(jié)合區(qū)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯，得到非融合蛋白。*1.3.1非融合型表達(dá)載體為了在原核生物細(xì)胞中表達(dá)出非融PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元件：強(qiáng)啟動子

SD：

ATG：第一個密碼子PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元非融合型表達(dá)載體pKK223-3

Brosius等在哈佛大學(xué)的Gilbert實驗室組建的

在大腸桿菌細(xì)胞中，它能極有效地高水平表達(dá)外源基因

它具有一個強(qiáng)的tac(trp-lac)啟動子。這個啟動子是由trp啟動子的—35區(qū)、lacUV5啟動子的—10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成

非融合型表達(dá)載體pKK223-3Brosius等在哈佛大tac啟動子之后是一個取自pUC8的多克隆位點（MCS）定位在啟動子和S-D序列后

在MCS下游的一段DNA序列中，還包含一個很強(qiáng)的核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子，目的是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)載體的其余部分由pBR322組成。

tac啟動子之后是一個取自pUC8的多克隆位點（MCS）定位1.3.2融合型表達(dá)載體將外源基因與載體自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。表達(dá)融合型蛋白應(yīng)非常注意其閱讀框架，其閱讀框應(yīng)與融合的DNA片段的閱讀框一致，翻譯時才不至于產(chǎn)生移碼突變。在這種結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學(xué)試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合分子中釋放并回收異源蛋白*1.3.2融合型表達(dá)載體將外源基因與載體自身的蛋白質(zhì)編碼基融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建最關(guān)鍵的一點：兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建最關(guān)鍵的一點：兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因常見的用于構(gòu)建融合蛋白的受體蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）：維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA）：維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）：促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫親和層析外膜蛋白（OmpF）：促進(jìn)分泌β-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）：維持良好空間構(gòu)象常見的用于構(gòu)建融合蛋白的受體蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）：融合型蛋白表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)由Pharmacia公司構(gòu)建（已被GE公司收購）由3種載體pGEX-lXT，pGEX-2T和pGEX-3X以及一種用于純化表達(dá)蛋白的親和層析介質(zhì)GlutathioneSepharose4B組成。含有啟動子tac及l(fā)ac操縱基因、SD序列、lacI阻遏蛋白基因等。與其他表達(dá)載體不同之處在于S-D序列下游是谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因，而克隆的外源基因則與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因相連。融合型蛋白表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)由Pharmacia公司構(gòu)建（Ptac：適合IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—方便純化產(chǎn)物切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子融合型載體----pGEX系列Ptac：適合IPTG誘導(dǎo)融合型載體----pGEX系列1.3.3分泌型表達(dá)載體主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：通常位于SD序列下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜1.3.3分泌型表達(dá)載體主要元件：分泌型表達(dá)蛋白優(yōu)點：目的蛋白穩(wěn)定性高：高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的1100倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整：相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去*分泌型表達(dá)蛋白優(yōu)點：*缺點：相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。缺點：分泌型表達(dá)載體pinⅢ系統(tǒng)以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的它帶有大腸桿菌中最強(qiáng)的啟動子之一，即Ipp(脂蛋白基因)啟動子在啟動子的下游裝有l(wèi)acUV5的啟動子及其操縱基因lac阻遏子的基因(1acI)也克隆在這個質(zhì)粒上分泌型表達(dá)載體pinⅢ系統(tǒng)以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的作為分泌克隆表達(dá)載體中關(guān)鍵的編碼信號肽的序列，是取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因)。SS為信號肽序列作為分泌克隆表達(dá)載體中關(guān)鍵的編碼信號肽的序列，是取自于大腸桿1.4提高基因表達(dá)效率的途徑

1、選擇合適載體，提高翻譯水平強(qiáng)啟動子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)（提高其穩(wěn)定性）*1.4提高基因表達(dá)效率的途徑1、選擇合適載體，提高翻譯水2、選擇合適宿主

Lac啟動子----LacI菌

PL/PR--------CI857

溶源菌3、誘導(dǎo)表達(dá)（可減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷）溫度誘導(dǎo)------PLPR/IPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac4、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解2、選擇合適宿主2外源基因在真核生物中表達(dá)宿主：酵母菌、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等。

MCS真核或病毒的啟動子Poly（A）信號終止子外源基因2外源基因在真核生物中表達(dá)宿主：酵母菌、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞2.1外源基因在植物中的表達(dá)見第八章2.1外源基因在植物中的表達(dá)見第八章2.2外源基因在動物中的表達(dá)重組的外源基因動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞卵細(xì)胞藥物、疫苗等轉(zhuǎn)基因動物個體人體細(xì)胞基因治療轉(zhuǎn)染動物遺傳性狀改良藥物篩選評價模型胚胎發(fā)育見第九章2.2外源基因在動物中的表達(dá)重組的外源基因動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的summaryPTac、PLac、PTrp、PL、PR、PT7啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、SD序列、偏愛密碼、融合蛋白、非融合蛋白、分泌型蛋白、GST、大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢和劣勢？提高基因表達(dá)效率的途徑？表達(dá)形式：融合表達(dá)、非融合表達(dá)、分泌型表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)、pET系列表達(dá)載體、pGEX系列表達(dá)載體Tac表達(dá)體系（pGEX）、T7表達(dá)體系（pET）summaryPTac、PLac、PTrp、PL、PR、P第7章克隆基因的原核表達(dá)第7章克隆基因的原核表達(dá)basicprocessofDNArecombinationinvitro

體外DNA重組的基本步驟2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷連接到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（如：抗菌素抗性標(biāo)記）的載體分子上（DNA重組過程，需要各種工具酶的參與）3.重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?。*1.目的基因的獲?。簭膹?fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。

605.目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物basicprocessofDNArecombina原核生物中基因的表達(dá)操縱子↓多順反子mRNA↓多肽轉(zhuǎn)錄翻譯原核生物中基因的表達(dá)操縱子↓多順反子mRNA↓多肽轉(zhuǎn)錄翻譯真核生物中基因的表達(dá)基因↓前體mRNA↓成熟mRNA（單順反子）↓蛋白質(zhì)前體成熟蛋白質(zhì)↓轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)運，翻譯翻譯后加工真核生物中基因的表達(dá)基因↓前體mRNA↓成熟mRNA（單順反表達(dá)體載體宿主第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細(xì)胞表達(dá)體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個體表達(dá)體系的發(fā)展表達(dá)體載體contents1外源基因在原核生物(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、農(nóng)桿菌等)中的表達(dá)2外源基因在真核生物（酵母、植物、動物）中的表達(dá)contents1外源基因在原核生物(大腸桿菌、枯草芽孢桿1外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.1原核生物基因表達(dá)的特點1.2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的幾個必須的結(jié)構(gòu)1.3幾種類型的原核表達(dá)載體1.4提高基因表達(dá)效率的途徑1外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.1原核生物基因表達(dá)的特點1.1原核生物基因表達(dá)的特點①只有一種RNA聚合酶(真核細(xì)胞有三種)：催化所有RNA的合成。②基因的表達(dá)是以操縱子為單位的。③原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。④原核基因一般不含有內(nèi)含子(intron)，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。⑤原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。⑥mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個起始密碼子及同16S核糖體RNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，即SD序列，而真核基因則缺乏此序列。1.1原核生物基因表達(dá)的特點①只有一種RNA聚合酶(真核外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的必要條件

①通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；②

外源基因不能帶有內(nèi)含子，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA；③

必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；④

外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框(openreadingframe，ORF)；⑤

利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的必要條件①通過表達(dá)載體將外源基因大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物*大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)宿主菌。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素*大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能*理想的大腸桿菌表達(dá)載體（1）穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力，在無選擇壓力下能存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。（2）具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。（3）啟動子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控的，抑制時本底轉(zhuǎn)錄水平較低。（4）啟動子的轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止，轉(zhuǎn)錄過程不影響表達(dá)載體的復(fù)制。（5）具備適用于外源基因插入的酶切位點。復(fù)制起始位點、篩選標(biāo)志、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、核糖體結(jié)合位點和多克隆位點是構(gòu)成表達(dá)載體的最基本元件。理想的大腸桿菌表達(dá)載體（1）穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力，在無選1.2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的幾個必須的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄水平翻譯水平啟動子轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)1.2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的幾個必須的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄水平翻Ptac

=3Ptrp=11Plac啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGTPlLTTGACA

GATACTPrecATTGATA

TATAAT1.2.1原核表達(dá)載體常用的啟動子啟動子強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-Tac啟動子是由

trp的–35序列和

lacUV5（抗葡萄糖代謝阻遏的突變型大腸桿菌）的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于

trp和lacUV5啟動子（Ptac

=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

（1）Tac表達(dá)系統(tǒng)Tac啟動子是由trp的–35序列和laLac和Tac表達(dá)系統(tǒng)是最早建立并得到廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株常被選用為Lac、Tac表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。lac、tac啟動子的宿主菌lac、tac啟動子的宿主菌IPTG

（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于誘導(dǎo)

lac、tac啟動子的轉(zhuǎn)錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG

解決方法

lac

和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控（使用阻遏蛋白lacI的溫度敏感突變株lacI（ts）。在較低溫度（30℃）時外源基因表達(dá)受到抑制，在較高溫度（42℃）時則開放。）乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac

和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于誘導(dǎo)laIPTG誘導(dǎo)PGEX系列表達(dá)載體的表達(dá)原核表達(dá)載體PGEX系列帶有一個“tac”強(qiáng)啟動子，載體上還攜帶Laclq基因，編碼Lac抑制因子，當(dāng)無IPTG存在時，Lac阻遏蛋白能抑Ptac轉(zhuǎn)錄，保持低水平表達(dá)。加入誘導(dǎo)物IPTG時它可與Lac阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化，起到去阻遏作用，起動轉(zhuǎn)錄，高效表達(dá)。GST基因IPTG誘導(dǎo)PGEX系列表達(dá)載體的表達(dá)原核表達(dá)載體PGEX以λ噬菌體早期基因轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR

為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

PL、PR

表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)

的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR

啟動子的轉(zhuǎn)錄。（2）PL和PR表達(dá)系統(tǒng)以λ噬菌體早期基因轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR為核心構(gòu)建的表PL

和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問題由于PL和

PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或

PR表達(dá)系統(tǒng)。但在熱脈沖誘導(dǎo)過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果，對重組蛋白表達(dá)量有一定的影響。PL和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問題由于PL和PR表大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的。pET系列載體是這類表達(dá)載體的典型代表。

pET系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)常用宿主細(xì)胞為大腸桿菌菌株BL21（DE3）（因為菌株BL21（DE3）的染色體能表達(dá)T7噬菌體RNA聚合酶）等。

（3）T7表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。

在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。常見的有化學(xué)誘導(dǎo)型、溫度誘導(dǎo)型等。T7表達(dá)系統(tǒng)T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬克隆基因的表達(dá)課件克隆基因的表達(dá)課件（4）其他表達(dá)系統(tǒng)營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型、pH調(diào)控型等（4）其他表達(dá)系統(tǒng)營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型、pH調(diào)控型等外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的RNA混合物。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)。1.2.2轉(zhuǎn)錄終止子目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即R外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）通常在AUG上游3-11bp，長約3-9bp,5’UAAGGAGG3’1.2.3核糖體結(jié)合位點（RBS）外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以

GGAG

四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低mRNA與核糖體的結(jié)合程度一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。

緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。如：對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍SD序列與起始密碼子之間序列的影響SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約7個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低SD序列與起始密碼子之間距離的影響SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的

5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。

目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的。起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。因此對外源基因表達(dá)而言，需選擇宿主細(xì)胞偏愛的密碼子。1.2.4密碼子不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降。1.2.5質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細(xì)1.3幾種類型的原核表達(dá)載體1.3幾種類型的原核表達(dá)載體一種典型的大腸桿菌表達(dá)載體示意圖一種典型的大腸桿菌表達(dá)載體示意圖TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）編碼序列TAATGATAGTTtetrOriRBS大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分核糖體結(jié)合位點（與翻譯有關(guān)）轉(zhuǎn)錄終止子TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAG表達(dá)載體類型非融合型表達(dá)載體：---所表達(dá)的蛋白是天然完整蛋白（具有非常接近于真核細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。但也易被細(xì)菌蛋白酶破壞）融合型表達(dá)載體：----所表達(dá)的蛋白是融合蛋白（穩(wěn)定性大大增加，不易被細(xì)菌蛋白酶降解；也易于分離純化）分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙表達(dá)載體類型非融合型表達(dá)載體：---所表達(dá)的蛋白是天然完整蛋1.3.1非融合型表達(dá)載體為了在原核生物細(xì)胞中表達(dá)出非融合蛋白，可將帶有起始密碼ATG的真核基因插入到原核啟動子和SD序列的下游，組成一個雜合的核糖體結(jié)合區(qū)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯，得到非融合蛋白。*1.3.1非融合型表達(dá)載體為了在原核生物細(xì)胞中表達(dá)出非融PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元件：強(qiáng)啟動子

SD：

ATG：第一個密碼子PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元非融合型表達(dá)載體pKK223-3

Brosius等在哈佛大學(xué)的Gilbert實驗室組建的

在大腸桿菌細(xì)胞中，它能極有效地高水平表達(dá)外源基因

它具有一個強(qiáng)的tac(trp-lac)啟動子。這個啟動子是由trp啟動子的—35區(qū)、lacUV5啟動子的—10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成

非融合型表達(dá)載體pKK223-3Brosius等在哈佛大tac啟動子之后是一個取自pUC8的多克隆位點（MCS）定位在啟動子和S-D序列后

在MCS下游的一段DNA序列中，還包含一個很強(qiáng)的核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子，目的是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)載體的其余部分由pBR322組成。

tac啟動子之后是一個取自pUC8的多克隆位點（MCS）定位1.3.2融合型表達(dá)載體將外源基因與載體自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。表達(dá)融合型蛋白應(yīng)非常注意其閱讀框架，其閱讀框應(yīng)與融合的DNA片段的閱讀框一致，翻譯時才不至于產(chǎn)生移碼突變。在這種結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學(xué)試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合分子中釋放并回收異源蛋白*1.3.2融合型表達(dá)載體將外源基因與載體自身的蛋白質(zhì)編碼基融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建最關(guān)鍵的一點：兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建最關(guān)鍵的一點：兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因常見的用于構(gòu)建融合蛋白的受體蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）：維持良好空間構(gòu)象硫氧化還