生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件

第十三章DNA的生物合成第十三章DNA的生物合成DNA的生物合成復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。反轉(zhuǎn)錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導(dǎo)合成作用，見于RNA病毒。修復(fù)合成：當(dāng)各種因素引起DNA損傷時(shí)，損傷DNA可修復(fù)合成，校正錯(cuò)誤，完成正確合成，以保持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和遺傳信息的準(zhǔn)確性。DNA的重組與克隆DNA的生物合成復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將細(xì)胞、個(gè)體及物種的遺傳特性要在代代相傳中得到維持，有賴于遺傳物質(zhì)的完整、準(zhǔn)確的復(fù)制并分配至子代細(xì)胞。細(xì)胞、個(gè)體及物種的遺傳特性要在代代相傳中得到維持，有

現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)——在生命有機(jī)體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠(yuǎn)存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動遵循著中心法則。現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)——在生13.1DNA的復(fù)制親本DNA雙螺旋解開，兩條鏈分別作為模板，合成子代DNA分子的過程DNA復(fù)制過程的研究一般采用三類系統(tǒng)

ΦX174DNA或質(zhì)粒DNA及其完成復(fù)制所必需的酶、蛋白質(zhì)及其因子構(gòu)成的體外系統(tǒng)以E.coli為模式生物，研究原核生物的復(fù)制以酵母和動物病毒為模式生物研究真核生物的DNA復(fù)制13.1DNA的復(fù)制親本DNA雙螺旋解開，兩條鏈分別作為模13.1.1DNA的半保留復(fù)制即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制13.1.1DNA的半保留復(fù)制即新的雙鏈DNA中，一股鏈來生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.1.2DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)大多數(shù)原核生物染色體DNA的復(fù)制是雙向，形成復(fù)制眼，單向復(fù)制的特殊形式，稱為滾動環(huán)式真核生物染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子。13.1.2DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件DNA復(fù)制的特點(diǎn)與條件（1）半保留復(fù)制（2）有一定的復(fù)制起始點(diǎn)（3）需要引物（4）雙向復(fù)制（5）半不連續(xù)復(fù)制（6）復(fù)制方向5′→3′DNA復(fù)制的特點(diǎn)與條件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)（termination,，ter）oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA13.2原核生物DNA的復(fù)制原料：dNTP，Mg2+，雙鏈DNA模板引物：小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3′-OH。引物酶：用于合成復(fù)制所必需的RNA引物解螺旋酶：DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（OriC）上解開雙螺旋。單鏈結(jié)合蛋白：穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶：解DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的超螺旋現(xiàn)象。DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈缺口DNA聚合酶：復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯(cuò)13.2原核生物DNA的復(fù)制原料：dNTP，Mg2+，13.2.1參與原核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)13.2.1參與原核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolIII不同種類亞基數(shù)目1≥7≥10每個(gè)細(xì)胞的分子數(shù)40020生物學(xué)活性10.05155′→3′聚合酶活性＋＋＋3′→5′外切酶活性＋＋＋5′→3′外切酶活性＋－－聚合速度（核苷酸/S）16~2040250~1000連續(xù)合成能力（核苷酸）3~2001500≥5000功能

校正，去除RNA引物應(yīng)急修復(fù)主要酶（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolI（A）5′→3′聚合酶催化磷酸二酯鍵生成，延長子鏈（B）3′→5′外切酶切除子鏈3’端一個(gè)錯(cuò)配的堿基，即時(shí)校讀（C）5′→3′外切酶切除子鏈5’端一段序列，包括引物和突變的片段（A）5′→3′聚合酶①

DNA聚合酶Ⅰ:

單體酶，多肽鏈內(nèi)含一個(gè)鋅離子，多功能酶，用于切除引物RNA，并填補(bǔ)留下的空隙

53聚合酶功能（對脫氧核苷酸的選擇）；35外切酶活性（對雙鏈無作用，校對功能；但在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈）

53外切酶活性（雙鏈有效，主要是對DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時(shí)RNA引物切除及其空隙的填補(bǔ)）

在DNA鏈的3形成焦磷酸解（生理意義不大）；無機(jī)焦磷酸鹽與dNTP之間的焦磷酸基交換。①DNA聚合酶Ⅰ:酶催化新加入的脫氧核苷酸單位的α-磷酸基與引物的3′-OH共價(jià)結(jié)合，并從新加入的脫氧核苷三磷酸分子上釋放焦磷酸，因此合成的方向是從5′端到3′端。所產(chǎn)生的焦磷酸隨即被細(xì)胞中的焦磷酸酶分解產(chǎn)生無機(jī)磷酸，推動聚合反應(yīng)的完成酶催化新加入的脫氧核苷酸單位的α-磷酸基與引物的3′Klenow片段，含DNA聚合酶和3′→5′核酸外切酶活性Klenow片段，含DNA聚合酶和3′→5′核酸外切②

DNA聚合酶Ⅱ：

多亞基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3′5′外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。③

DNA聚合酶Ⅲ：

原核生物DNA復(fù)制的主要聚合酶，該酶由10種亞基組成，其中、、形成全酶的核心酶。

具有5′3′DNA聚合酶活性（亞基，速率高）；

具有3′5′外切酶（亞基）的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性；

具有53外切酶活性（單鏈有效，其意義未知）。④DNA聚合酶IV和V：1999年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生。②DNA聚合酶Ⅱ：β-滑動夾子將正在復(fù)制的DNA固定在夾子中心，并能隨DNA復(fù)制沿著模板DNA鏈滑動使DNA聚合酶不易從模板脫離，有利于DNA的連續(xù)復(fù)制β-滑動夾子（2）參與原核生物DNA復(fù)制的其他酶和蛋白質(zhì)（2）參與原核生物DNA復(fù)制的其他酶和蛋白質(zhì)①

引物合成酶（引發(fā)酶）

此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。②DNA連接酶

若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3′-OH，另一端是5′-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能在模板鏈上連接DNA和DNA鏈之間的切口，而且能連接無單鏈粘性末端的平頭雙鏈DNA。①引物合成酶（引發(fā)酶）大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接連接酶的反應(yīng)機(jī)制

酶+NAD+（ATP）?酶-AMP+煙酰胺單核苷酸（PPi）

酶-AMP+P-5′-DNA?酶+AMP-P-5′-DNADNA-3′-OH+AMP-P-5′-DNA?DNA-3′-O-P-5′-DNA+AMPDNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用作用連接酶的反應(yīng)機(jī)制③拓?fù)洚悩?gòu)酶催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其他轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體，引起拓?fù)洚悩?gòu)體反應(yīng)的酶稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶。拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負(fù)超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。連環(huán)數(shù)：在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)。③拓?fù)洚悩?gòu)酶108局部解鏈后改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈108局部解鏈后改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件④解螺旋酶（解鏈酶）：通過水解ATP將DNA兩條鏈打開。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2個(gè)ATP分子。rep蛋白沿3′→5′移動，而解螺旋酶I、II、III沿5′→3′移動。⑤其它蛋白因子

單鏈結(jié)合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）引發(fā)前體④解螺旋酶（解鏈酶）：單鏈結(jié)合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）

穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。引發(fā)前體

它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n′、n′′和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。

引發(fā)體可以沿模板鏈5′3′方向移動，具有識別合成起始位點(diǎn)的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。

移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，n′蛋白具有ATP酶的活力。引發(fā)體的移動與復(fù)制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。單鏈結(jié)合蛋白（SSB-single-strandbindi生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件岡崎片段

在DNA復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈能連續(xù)合成，而隨后鏈只能是斷續(xù)的合成5′3′的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為岡崎片段。

岡崎片段：真核生物中100-200個(gè)核苷酸（核小體的DNA單位）。原核生物中1000-2000個(gè)核苷酸（相當(dāng)于一個(gè)順反子）。岡崎片段13.2.2大腸桿菌DNA復(fù)制的起始大腸桿菌的復(fù)制的起始點(diǎn)稱OriC由DnaB（解螺旋酶）在DnaA和DnaC協(xié)助下解鏈，形成復(fù)制叉（replicationfork），SSB結(jié)合并穩(wěn)定解開的單股DNA鏈；

引物酶（DnaG）與上述因子、酶構(gòu)成引發(fā)體（primosome），并合成RNA引物。

解鏈造成的超螺旋，由拓?fù)洚悩?gòu)酶實(shí)現(xiàn)超螺旋的轉(zhuǎn)型，即把正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣趶?fù)制的負(fù)超螺旋。13.2.2大腸桿菌DNA復(fù)制的起始大腸桿菌的復(fù)制的起始點(diǎn)DnaA辨認(rèn)結(jié)合于AT區(qū)，AT區(qū)DNA解鏈。DnaB在DnaC協(xié)同下，結(jié)合于解鏈區(qū)，沿5′→3′移動，解開DNA雙鏈，SSBP參與，形成復(fù)制叉。DnaA辨認(rèn)結(jié)合于AT區(qū)，AT區(qū)DNA解鏈。Dna復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)及參與復(fù)制的酶與因子復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)及參與復(fù)制的酶與因子13.2.3大腸桿菌DNA鏈的延長這個(gè)過程由DNA聚合酶III催化，它是主要的復(fù)制酶。前導(dǎo)鏈：為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈?zhǔn)?′→3′鏈。后隨鏈：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎(chǔ)上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA鏈?zhǔn)?′→5′鏈。13.2.3大腸桿菌DNA鏈的延長這個(gè)過程由DNA聚合酶I生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件復(fù)制時(shí)，從一個(gè)固定的起點(diǎn)（origin）開始復(fù)制，此時(shí)雙鏈DNA解開形成兩條單鏈，分別作為模板進(jìn)行復(fù)制，由此形成的結(jié)構(gòu)很像叉子，被形象地稱作復(fù)制叉（replicationfork）復(fù)制時(shí)，從一個(gè)固定的起點(diǎn)（origin）開始復(fù)制，此隨從鏈的合成隨從鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.2.4大腸桿菌DNA復(fù)制的終止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來當(dāng)一個(gè)復(fù)制叉先期到達(dá)終止區(qū)時(shí)，其復(fù)制會停止，待另一個(gè)復(fù)制叉到達(dá)同一位置，兩個(gè)復(fù)制叉相遇，即完成了整個(gè)DNA的復(fù)制過程13.2.4大腸桿菌DNA復(fù)制的終止由DNA聚合酶I完成切生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.3真核生物DNA的復(fù)制真核生物DNA復(fù)制的基本過程與原核生物相似，但參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)與原核生物不同，復(fù)制起始的調(diào)控更加復(fù)雜。13.3真核生物DNA的復(fù)制真核生物DNA復(fù)制的基本過程與13.3.1參與真核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)真核生物DNA聚合酶主要有5種α（Ⅰ），β（Ⅳ），γ（M），δ（Ⅲ），ε（Ⅱ）真核生物DNA聚合酶的酶促反應(yīng)與原核生物DNA聚合酶相似，均以4種dNTP為底物，需要Mg2+激活，要求有模板和引物，鏈的延伸方向?yàn)?′→3′，也按半不連續(xù)的機(jī)制分別合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈13.3.1參與真核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)真核生物DNA聚DNA聚合酶的類型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相對分子質(zhì)量/103100~2204560122亞基數(shù)4123~54聚合酶活性5′→3′＋＋＋＋＋外切（校正）酶活性3′→5′－－＋＋＋引物（合成）酶活性＋－－－－持續(xù)合成能力中高高有PCNA時(shí)高高對抑制劑敏感蚜腸霉素雙脫氧TTP雙脫氧TTP蚜腸霉素蚜腸霉素細(xì)胞定位核核線粒體核核DNA聚合酶的類型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相13.3.2真核生物DNA復(fù)制的起始細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。13.3.2真核生物DNA復(fù)制的起始細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)復(fù)制的起始真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與，還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子（replicationfactor，RF）。增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen,PCNA）在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。復(fù)制的起始復(fù)制的延長復(fù)制的終止染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。復(fù)制的延長生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（1）SV40DNA的復(fù)制①2分子由SV40基因組編碼的T抗原六聚體作為起始蛋白（相當(dāng)于E．coli的DnaB蛋白），在ATP的存在下與SV40復(fù)制起始區(qū)結(jié)合，使起始區(qū)的DNA解鏈。②復(fù)制蛋白A（replicationproteinA，RPA）作為SSB與單鏈區(qū)結(jié)合，進(jìn)一步提高T抗原的解旋酶活性，致使解鏈區(qū)不斷擴(kuò)大，但真核生物的RPA與單鏈DNA結(jié)合沒有協(xié)同效應(yīng)。③DNApolα-引物酶復(fù)合物與T抗原/RPA復(fù)合物結(jié)合，合成前導(dǎo)鏈約10nt的RNA引物，和約30nt的DNA。（1）SV40DNA的復(fù)制④復(fù)制因子(replicationfactor，RFC)先與新合成的DNA3′端結(jié)合，隨后PCNA取代polα-引物酶結(jié)合到DNA模板上，前導(dǎo)鏈的合成暫時(shí)中斷。⑤polδ結(jié)合到PCNA-RFC復(fù)合物上，由于polδ具有校對能力，PCNA與模板DNA結(jié)合牢固，該復(fù)合物可以持續(xù)地、準(zhǔn)確地合成前導(dǎo)鏈。同時(shí)，polα-引物酶結(jié)合到后隨鏈的模板上，開始后隨鏈的合成。后隨鏈的進(jìn)一步延伸，也需要用PCNA-polδ或PCNA-polδ取代polα-引物酶⑥FEN-1-RNaseHl負(fù)責(zé)切除RNA引物，DNA連接酶I負(fù)責(zé)連接相鄰的岡崎片段，拓?fù)洚悩?gòu)酶I負(fù)責(zé)清除復(fù)制叉移動形成的正超螺旋，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱa和Ⅱb則負(fù)責(zé)解開連環(huán)體，促進(jìn)最后的2個(gè)以共價(jià)鍵相連的連環(huán)體DNA分開④復(fù)制因子(replicationfactor生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（2）酵母DNA的復(fù)制酵母DNA復(fù)制的起點(diǎn)稱自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationgsequence，ARS）酵母DNA復(fù)制的起始需要起點(diǎn)識別復(fù)合物（originrecognizingcomplex，ORC）參與，該復(fù)合體由6個(gè)亞基組成。相當(dāng)于原核生物的DnaA。（2）酵母DNA的復(fù)制生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.3.3真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)原核生物和真核生物DNA復(fù)制的基本過程是相似的，但也有一些明顯的差別共同點(diǎn)①均為半保留復(fù)制；②均為半不連續(xù)復(fù)制；③均需要解旋酶解開雙螺旋，并由SSB同單鏈區(qū)結(jié)合；④均需要拓?fù)洚悩?gòu)酶消除解螺旋形成的扭曲張力；⑤均需要RNA引物；⑥新鏈合成均有校對機(jī)制13.3.3真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)原核生物和真核生物DN不同點(diǎn)①原核生物為單起點(diǎn)復(fù)制，真核生物為多起點(diǎn)復(fù)制。原核生物的復(fù)制子大而少，真核生物的復(fù)制子小而多。②原核生物復(fù)制叉移動的速度為900nt/s，真核生物復(fù)制叉移動的速度為50nt/s。③原核生物岡崎片段的大小為1000～2000nt，真核生物岡崎片段的大小為100～200nt。④真核細(xì)胞的DNA聚合酶和蛋白質(zhì)因子的種類比原核細(xì)胞多，引物酶活性由DNApolα的兩個(gè)小亞基承擔(dān)。⑤原核細(xì)胞在第一輪復(fù)制還沒有結(jié)束的時(shí)候，就可以在復(fù)制起始區(qū)啟動第二輪復(fù)制。真核細(xì)胞的復(fù)制有復(fù)制許可因子控制，復(fù)制周期不可重疊。

⑥原核生物的DNA為環(huán)形分子，DNA復(fù)制時(shí)不存在末端會縮短的問題。真核生物的DNA為線形分子，DNA復(fù)制肘末端會縮短，需要端粒酶解決線形DNA的末端復(fù)制問題。不同點(diǎn)DNA復(fù)制與核小體組裝真核生物的染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其DNA與組蛋白構(gòu)成核小體，DNA纏繞于組蛋白核心外，每個(gè)核小體上的DNA相當(dāng)于兩個(gè)負(fù)超螺旋。復(fù)制時(shí)的岡崎片段長約200bp，恰好相當(dāng)于一個(gè)核小體DNA的長度。DNA復(fù)制時(shí)，組蛋白需同步合成，并與DNA組裝成核小體。DNA復(fù)制與核小體組裝原核生物和真核生物DNA復(fù)制調(diào)控的比較原核生物DNA復(fù)制的速率與其生長環(huán)境有關(guān)，迅速增殖的細(xì)胞通常在一次復(fù)制尚未完成的情況下，即可開始另一次復(fù)制，但復(fù)制叉上DNA鏈的延伸速度基本恒定。真核生物DNA復(fù)制的調(diào)控至少有3個(gè)層次，其一是細(xì)胞周期水平的調(diào)控；其二是染色體水平的調(diào)控；其三是復(fù)制子水平的調(diào)控。原核生物和真核生物DNA復(fù)制調(diào)控的比較端粒DNA的復(fù)制真核生物線性染色體的兩個(gè)末端具有特殊的結(jié)構(gòu)，稱為端粒，它是由許多成串的重復(fù)序列所組成。

端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，它以自身的RNA鏈為模板合成DNA端粒結(jié)構(gòu)。一條鏈?zhǔn)怯芍貜?fù)序列TTTTGGGG組成的，稱TG鏈

另一條鏈?zhǔn)怯芍貜?fù)序列AAAACCCC組成的，稱AC鏈端粒在決定細(xì)胞的壽命中起重要作用，體細(xì)胞隨著分化而失去端粒酶的活性，端?？s短。這些重復(fù)序列的少量丟失，不會傷及基因的結(jié)構(gòu)，如果短到一定程度就引起細(xì)胞停止生長或凋亡。端粒DNA的復(fù)制生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件分裂旺盛的細(xì)胞存在端粒酶（telomerase），這種酶是蛋白質(zhì)和RNA組成的復(fù)合物，其蛋白質(zhì)部分能以其RNA為模板催化合成DNA鏈。分裂旺盛的細(xì)胞存在端粒酶（telomerase），這13.4逆轉(zhuǎn)錄作用逆轉(zhuǎn)錄也稱反轉(zhuǎn)錄，是以RNA為模板合成DNA的特殊復(fù)制方式（在某些生物如雞的肉瘤病毒、HIV等）它們的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。因此，在感染細(xì)胞時(shí)，首先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄作用成為雙鏈DNA，才能整合到宿主基因組中去。13.4逆轉(zhuǎn)錄作用逆轉(zhuǎn)錄也稱反轉(zhuǎn)錄，是以RNA為模板合成D生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性（1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（2）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（3）核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5′→3′和3′→5′兩個(gè)方向起核酸外切酶的作用。cDNA

幾乎所有真核生物mRNA分子的3′末端都有一段polyA,當(dāng)加入寡聚dT作為引物時(shí)，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與其互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性13.5DNA的損傷與修復(fù)DNA的損傷DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。從而影響DNA的復(fù)制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著變化，因而表現(xiàn)出異常的特征（生物突變）。DNA損傷的修復(fù)四種修復(fù)途徑：直接修復(fù)（光復(fù)活）、切除修復(fù)、復(fù)組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)（暗修復(fù)）。13.5DNA的損傷與修復(fù)DNA的損傷13.5.1DNA損傷的產(chǎn)生DNA復(fù)制具有高度精確性，在大腸桿菌的細(xì)胞DNA復(fù)制中其錯(cuò)誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個(gè)核苷酸才出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤DNA的損傷（突變）大多數(shù)是自發(fā)的，是進(jìn)化與分化的基礎(chǔ)外界環(huán)境因素，包括化學(xué)誘變劑和物理因子以及代謝過程中產(chǎn)生的自由基等影響13.5.1DNA損傷的產(chǎn)生DNA復(fù)制具有高度精確性，在大UV物理因素：紫外線（ultraviolet，UV）、各種輻射UV物理因素：紫外線（ultraviolet，UV）、化學(xué)因素化學(xué)因素突變的分子改變類型：

錯(cuò)配、缺失、插入、重排（1）錯(cuò)配：DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變。

轉(zhuǎn)換：發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

顛換：發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。突變的分子改變類型：生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（2）缺失、插入和框移缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變?？蛞仆蛔儯褐溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C（2）缺失、插入和框移谷酪（3）重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型（3）重排由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型13.5.2DNA損傷的修復(fù)是對已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)修復(fù)的主要類型光修復(fù)（lightrepairing）切除修復(fù)（excisionrepairing）重組修復(fù)（recombinationrepairing）SOS修復(fù)13.5.2DNA損傷的修復(fù)是對已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，直接修復(fù)：如光復(fù)活酶,可以把嘧啶二聚體恢復(fù)正常狀態(tài)。切除修復(fù)：找出損傷位置并切除，進(jìn)行修復(fù)合成并連接。重組修復(fù)：先復(fù)制再修復(fù)。子代鏈在對應(yīng)模板鏈的損傷處留下缺口，先將同源母鏈DNA上相應(yīng)的核苷酸片段轉(zhuǎn)移替補(bǔ)，然后再合成一段序列填充缺口。SOS系統(tǒng)：復(fù)雜的應(yīng)急反應(yīng)。既有避免差錯(cuò)的修復(fù)又有引起差錯(cuò)的修復(fù)，后者有高變異率但也增加了生存機(jī)會。直接修復(fù)：生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（a）DNA糖基化酶切除損傷的堿基產(chǎn)生無堿基酸（b）無堿基核酸內(nèi)切酶在無堿基酸處切開產(chǎn)生切口。（c）DNA聚合酶Ⅰ將無堿基酸切除并填補(bǔ)缺口。（d）DNA連接酶連接切口。（a）DNA糖基化酶切除損傷的堿基產(chǎn)生無堿基酸生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.6DNA的重組與克隆DNA的重組高等生物在細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體之間可以進(jìn)行DNA片段的交換，病毒、噬菌體或質(zhì)粒DNA插入（整合到）宿主的染色體DNA的克隆就是獲得遺傳背景完全相同的分子或個(gè)體的“拷貝”13.6DNA的重組與克隆DNA的重組13.6.1DNA的重組同源重組發(fā)生在同源序列之間、非特異性重組交換區(qū)具有相同或相似的序列兩個(gè)DNA分子相同的部位、不同部位（異位重組）位點(diǎn)特異性重組可以將兩個(gè)短的DNA特定序列（即特異位點(diǎn)）之間的基因從染色體上切除或組合到染色體另一個(gè)特定位點(diǎn)13.6.1DNA的重組同源重組生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.6.2DNA的克隆在體外利用酶學(xué)方法將感興趣的物種來源的DNA片段轉(zhuǎn)移到能自主復(fù)制的載體,形成重組的DNA分子,并在宿主細(xì)胞中增殖。這種復(fù)制基因或DNA片段以產(chǎn)生相同DNA分子“拷貝”的技術(shù)，稱為重組DNA技術(shù)或DNA克隆。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合，獲取同一拷貝的過程稱為克隆化（cloning），即無性繁殖。13.6.2DNA的克隆在體外利用酶學(xué)方法將感興趣的物種來PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

概念：一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。

原理：DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

應(yīng)用：遺傳病和疑難病的診斷、孕婦的產(chǎn)前檢查、病原體檢查、法醫(yī)和刑偵鑒定、基因探針的制備、基因組測序、染色體步查、cDNA庫的構(gòu)建、基因的定點(diǎn)誘變、基因突變的分析、基因的分離和克隆等PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件基因克隆的基本條件

工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等

目的基因：cDNA或基因組DNA

載體：質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體、病毒和人工染色體等

宿主細(xì)胞：大腸桿菌、酵母、動物細(xì)胞基因克隆的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶

存在于細(xì)菌體內(nèi)，能夠識別和切割雙鏈DNA內(nèi)部特定核苷酸序列的一類核酸酶。常用的是II類限制性內(nèi)切酶，許多限制性核酸內(nèi)切酶II的識別序列為回文結(jié)構(gòu)配伍末端（compatibleend）：不同限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的相同粘性末端DNA聚合酶

大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段（Klenow酶）、T4DNA聚合酶以及Taq酶等DNA連接酶T4連接酶：可用于粘端與平端的連接限制性核酸內(nèi)切酶基因組DNA（genomicDNA）

代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列，稱為基因組DNA。cDNA（complementaryDNA）

指體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的，與RNA（常指mRNA）互補(bǔ)的單鏈DNA,單鏈cDNA進(jìn)而合成雙鏈cDNA。質(zhì)粒（plasmid）

存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，在細(xì)胞中可以獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制并在細(xì)胞分裂時(shí)恒定地傳給子代細(xì)胞?；蚪MDNA（genomicDNA）基因工程基本過程1、目的基因的提?。悍蛛x或合成外源基因2、體外重組：外源基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子3、轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染）：重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞4、篩選與鑒定5、擴(kuò)增該克隆DNA6、基因表達(dá)：控制適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)7、獲得表達(dá)產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物DNA重組技術(shù)基因工程基本過程DNA重組技術(shù)生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊

美國轉(zhuǎn)基因豬，其體內(nèi)含有人類的基因，乳汁含有人體蛋白fatorⅧ。只需300～600只這樣的母豬就能滿足全世界對這種蛋白的需求。乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊美國轉(zhuǎn)基因豬，其體內(nèi)含乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出抗病毒的甜椒。甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培通過研究“基因異?！钡暮淖訉椭芯咳祟惖陌┌Y、糖尿病和高血壓等慢性疾病與遺傳的關(guān)系。通過研究“基因異?！钡暮淖訉椭芯咳祟惖陌┌Y、糖尿在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健康活潑的小猴“安迪”。

通過對“安迪”的研究我們可以簡單地引進(jìn)如老年性癡呆病的基因、帕金森病基因等，加快針對這類疾病疫苗的開發(fā)研究。在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健人類醫(yī)學(xué)史上第一次通過基因治療在阿尚蒂身上創(chuàng)造的奇跡般的成功，是一場醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的革命，這次臨床試驗(yàn)正式標(biāo)記著基因治療的解禁的開始隨后，世界范圍內(nèi)掀起了一股基因治療研究的熱潮，基因治療得到了令人意想不到的發(fā)展，已經(jīng)成為生物科學(xué)和臨床科學(xué)領(lǐng)域的熱門課題。人類醫(yī)學(xué)史上第一次通過基因治療在阿尚蒂身上創(chuàng)造的奇跡通常一種細(xì)菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育成功的“超級細(xì)菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。有的還能吞食轉(zhuǎn)化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質(zhì)。通常一種細(xì)菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育第十三章DNA的生物合成第十三章DNA的生物合成DNA的生物合成復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。反轉(zhuǎn)錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導(dǎo)合成作用，見于RNA病毒。修復(fù)合成：當(dāng)各種因素引起DNA損傷時(shí)，損傷DNA可修復(fù)合成，校正錯(cuò)誤，完成正確合成，以保持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和遺傳信息的準(zhǔn)確性。DNA的重組與克隆DNA的生物合成復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將細(xì)胞、個(gè)體及物種的遺傳特性要在代代相傳中得到維持，有賴于遺傳物質(zhì)的完整、準(zhǔn)確的復(fù)制并分配至子代細(xì)胞。細(xì)胞、個(gè)體及物種的遺傳特性要在代代相傳中得到維持，有

現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)——在生命有機(jī)體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠(yuǎn)存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動遵循著中心法則?，F(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)——在生13.1DNA的復(fù)制親本DNA雙螺旋解開，兩條鏈分別作為模板，合成子代DNA分子的過程DNA復(fù)制過程的研究一般采用三類系統(tǒng)

ΦX174DNA或質(zhì)粒DNA及其完成復(fù)制所必需的酶、蛋白質(zhì)及其因子構(gòu)成的體外系統(tǒng)以E.coli為模式生物，研究原核生物的復(fù)制以酵母和動物病毒為模式生物研究真核生物的DNA復(fù)制13.1DNA的復(fù)制親本DNA雙螺旋解開，兩條鏈分別作為模13.1.1DNA的半保留復(fù)制即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制13.1.1DNA的半保留復(fù)制即新的雙鏈DNA中，一股鏈來生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.1.2DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)大多數(shù)原核生物染色體DNA的復(fù)制是雙向，形成復(fù)制眼，單向復(fù)制的特殊形式，稱為滾動環(huán)式真核生物染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子。13.1.2DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件DNA復(fù)制的特點(diǎn)與條件（1）半保留復(fù)制（2）有一定的復(fù)制起始點(diǎn)（3）需要引物（4）雙向復(fù)制（5）半不連續(xù)復(fù)制（6）復(fù)制方向5′→3′DNA復(fù)制的特點(diǎn)與條件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)（termination,，ter）oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA13.2原核生物DNA的復(fù)制原料：dNTP，Mg2+，雙鏈DNA模板引物：小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3′-OH。引物酶：用于合成復(fù)制所必需的RNA引物解螺旋酶：DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（OriC）上解開雙螺旋。單鏈結(jié)合蛋白：穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶：解DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的超螺旋現(xiàn)象。DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈缺口DNA聚合酶：復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯(cuò)13.2原核生物DNA的復(fù)制原料：dNTP，Mg2+，13.2.1參與原核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)13.2.1參與原核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolIII不同種類亞基數(shù)目1≥7≥10每個(gè)細(xì)胞的分子數(shù)40020生物學(xué)活性10.05155′→3′聚合酶活性＋＋＋3′→5′外切酶活性＋＋＋5′→3′外切酶活性＋－－聚合速度（核苷酸/S）16~2040250~1000連續(xù)合成能力（核苷酸）3~2001500≥5000功能

校正，去除RNA引物應(yīng)急修復(fù)主要酶（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolI（A）5′→3′聚合酶催化磷酸二酯鍵生成，延長子鏈（B）3′→5′外切酶切除子鏈3’端一個(gè)錯(cuò)配的堿基，即時(shí)校讀（C）5′→3′外切酶切除子鏈5’端一段序列，包括引物和突變的片段（A）5′→3′聚合酶①

DNA聚合酶Ⅰ:

單體酶，多肽鏈內(nèi)含一個(gè)鋅離子，多功能酶，用于切除引物RNA，并填補(bǔ)留下的空隙

53聚合酶功能（對脫氧核苷酸的選擇）；35外切酶活性（對雙鏈無作用，校對功能；但在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈）

53外切酶活性（雙鏈有效，主要是對DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時(shí)RNA引物切除及其空隙的填補(bǔ)）

在DNA鏈的3形成焦磷酸解（生理意義不大）；無機(jī)焦磷酸鹽與dNTP之間的焦磷酸基交換。①DNA聚合酶Ⅰ:酶催化新加入的脫氧核苷酸單位的α-磷酸基與引物的3′-OH共價(jià)結(jié)合，并從新加入的脫氧核苷三磷酸分子上釋放焦磷酸，因此合成的方向是從5′端到3′端。所產(chǎn)生的焦磷酸隨即被細(xì)胞中的焦磷酸酶分解產(chǎn)生無機(jī)磷酸，推動聚合反應(yīng)的完成酶催化新加入的脫氧核苷酸單位的α-磷酸基與引物的3′Klenow片段，含DNA聚合酶和3′→5′核酸外切酶活性Klenow片段，含DNA聚合酶和3′→5′核酸外切②

DNA聚合酶Ⅱ：

多亞基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3′5′外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。③

DNA聚合酶Ⅲ：

原核生物DNA復(fù)制的主要聚合酶，該酶由10種亞基組成，其中、、形成全酶的核心酶。

具有5′3′DNA聚合酶活性（亞基，速率高）；

具有3′5′外切酶（亞基）的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性；

具有53外切酶活性（單鏈有效，其意義未知）。④DNA聚合酶IV和V：1999年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生。②DNA聚合酶Ⅱ：β-滑動夾子將正在復(fù)制的DNA固定在夾子中心，并能隨DNA復(fù)制沿著模板DNA鏈滑動使DNA聚合酶不易從模板脫離，有利于DNA的連續(xù)復(fù)制β-滑動夾子（2）參與原核生物DNA復(fù)制的其他酶和蛋白質(zhì)（2）參與原核生物DNA復(fù)制的其他酶和蛋白質(zhì)①

引物合成酶（引發(fā)酶）

此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。②DNA連接酶

若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3′-OH，另一端是5′-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能在模板鏈上連接DNA和DNA鏈之間的切口，而且能連接無單鏈粘性末端的平頭雙鏈DNA。①引物合成酶（引發(fā)酶）大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接連接酶的反應(yīng)機(jī)制

酶+NAD+（ATP）?酶-AMP+煙酰胺單核苷酸（PPi）

酶-AMP+P-5′-DNA?酶+AMP-P-5′-DNADNA-3′-OH+AMP-P-5′-DNA?DNA-3′-O-P-5′-DNA+AMPDNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用作用連接酶的反應(yīng)機(jī)制③拓?fù)洚悩?gòu)酶催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其他轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體，引起拓?fù)洚悩?gòu)體反應(yīng)的酶稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶。拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負(fù)超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。連環(huán)數(shù)：在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)。③拓?fù)洚悩?gòu)酶108局部解鏈后改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈108局部解鏈后改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件④解螺旋酶（解鏈酶）：通過水解ATP將DNA兩條鏈打開。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2個(gè)ATP分子。rep蛋白沿3′→5′移動，而解螺旋酶I、II、III沿5′→3′移動。⑤其它蛋白因子

單鏈結(jié)合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）引發(fā)前體④解螺旋酶（解鏈酶）：單鏈結(jié)合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）

穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。引發(fā)前體

它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n′、n′′和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。

引發(fā)體可以沿模板鏈5′3′方向移動，具有識別合成起始位點(diǎn)的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。

移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，n′蛋白具有ATP酶的活力。引發(fā)體的移動與復(fù)制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。單鏈結(jié)合蛋白（SSB-single-strandbindi生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件岡崎片段

在DNA復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈能連續(xù)合成，而隨后鏈只能是斷續(xù)的合成5′3′的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為岡崎片段。

岡崎片段：真核生物中100-200個(gè)核苷酸（核小體的DNA單位）。原核生物中1000-2000個(gè)核苷酸（相當(dāng)于一個(gè)順反子）。岡崎片段13.2.2大腸桿菌DNA復(fù)制的起始大腸桿菌的復(fù)制的起始點(diǎn)稱OriC由DnaB（解螺旋酶）在DnaA和DnaC協(xié)助下解鏈，形成復(fù)制叉（replicationfork），SSB結(jié)合并穩(wěn)定解開的單股DNA鏈；

引物酶（DnaG）與上述因子、酶構(gòu)成引發(fā)體（primosome），并合成RNA引物。

解鏈造成的超螺旋，由拓?fù)洚悩?gòu)酶實(shí)現(xiàn)超螺旋的轉(zhuǎn)型，即把正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣趶?fù)制的負(fù)超螺旋。13.2.2大腸桿菌DNA復(fù)制的起始大腸桿菌的復(fù)制的起始點(diǎn)DnaA辨認(rèn)結(jié)合于AT區(qū)，AT區(qū)DNA解鏈。DnaB在DnaC協(xié)同下，結(jié)合于解鏈區(qū)，沿5′→3′移動，解開DNA雙鏈，SSBP參與，形成復(fù)制叉。DnaA辨認(rèn)結(jié)合于AT區(qū)，AT區(qū)DNA解鏈。Dna復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)及參與復(fù)制的酶與因子復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)及參與復(fù)制的酶與因子13.2.3大腸桿菌DNA鏈的延長這個(gè)過程由DNA聚合酶III催化，它是主要的復(fù)制酶。前導(dǎo)鏈：為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈?zhǔn)?′→3′鏈。后隨鏈：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎(chǔ)上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA鏈?zhǔn)?′→5′鏈。13.2.3大腸桿菌DNA鏈的延長這個(gè)過程由DNA聚合酶I生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件復(fù)制時(shí)，從一個(gè)固定的起點(diǎn)（origin）開始復(fù)制，此時(shí)雙鏈DNA解開形成兩條單鏈，分別作為模板進(jìn)行復(fù)制，由此形成的結(jié)構(gòu)很像叉子，被形象地稱作復(fù)制叉（replicationfork）復(fù)制時(shí)，從一個(gè)固定的起點(diǎn)（origin）開始復(fù)制，此隨從鏈的合成隨從鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.2.4大腸桿菌DNA復(fù)制的終止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來當(dāng)一個(gè)復(fù)制叉先期到達(dá)終止區(qū)時(shí)，其復(fù)制會停止，待另一個(gè)復(fù)制叉到達(dá)同一位置，兩個(gè)復(fù)制叉相遇，即完成了整個(gè)DNA的復(fù)制過程13.2.4大腸桿菌DNA復(fù)制的終止由DNA聚合酶I完成切生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.3真核生物DNA的復(fù)制真核生物DNA復(fù)制的基本過程與原核生物相似，但參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)與原核生物不同，復(fù)制起始的調(diào)控更加復(fù)雜。13.3真核生物DNA的復(fù)制真核生物DNA復(fù)制的基本過程與13.3.1參與真核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)真核生物DNA聚合酶主要有5種α（Ⅰ），β（Ⅳ），γ（M），δ（Ⅲ），ε（Ⅱ）真核生物DNA聚合酶的酶促反應(yīng)與原核生物DNA聚合酶相似，均以4種dNTP為底物，需要Mg2+激活，要求有模板和引物，鏈的延伸方向?yàn)?′→3′，也按半不連續(xù)的機(jī)制分別合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈13.3.1參與真核DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)真核生物DNA聚DNA聚合酶的類型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相對分子質(zhì)量/103100~2204560122亞基數(shù)4123~54聚合酶活性5′→3′＋＋＋＋＋外切（校正）酶活性3′→5′－－＋＋＋引物（合成）酶活性＋－－－－持續(xù)合成能力中高高有PCNA時(shí)高高對抑制劑敏感蚜腸霉素雙脫氧TTP雙脫氧TTP蚜腸霉素蚜腸霉素細(xì)胞定位核核線粒體核核DNA聚合酶的類型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相13.3.2真核生物DNA復(fù)制的起始細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。13.3.2真核生物DNA復(fù)制的起始細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)復(fù)制的起始真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與，還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子（replicationfactor，RF）。增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen,PCNA）在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。復(fù)制的起始復(fù)制的延長復(fù)制的終止染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。復(fù)制的延長生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（1）SV40DNA的復(fù)制①2分子由SV40基因組編碼的T抗原六聚體作為起始蛋白（相當(dāng)于E．coli的DnaB蛋白），在ATP的存在下與SV40復(fù)制起始區(qū)結(jié)合，使起始區(qū)的DNA解鏈。②復(fù)制蛋白A（replicationproteinA，RPA）作為SSB與單鏈區(qū)結(jié)合，進(jìn)一步提高T抗原的解旋酶活性，致使解鏈區(qū)不斷擴(kuò)大，但真核生物的RPA與單鏈DNA結(jié)合沒有協(xié)同效應(yīng)。③DNApolα-引物酶復(fù)合物與T抗原/RPA復(fù)合物結(jié)合，合成前導(dǎo)鏈約10nt的RNA引物，和約30nt的DNA。（1）SV40DNA的復(fù)制④復(fù)制因子(replicationfactor，RFC)先與新合成的DNA3′端結(jié)合，隨后PCNA取代polα-引物酶結(jié)合到DNA模板上，前導(dǎo)鏈的合成暫時(shí)中斷。⑤polδ結(jié)合到PCNA-RFC復(fù)合物上，由于polδ具有校對能力，PCNA與模板DNA結(jié)合牢固，該復(fù)合物可以持續(xù)地、準(zhǔn)確地合成前導(dǎo)鏈。同時(shí)，polα-引物酶結(jié)合到后隨鏈的模板上，開始后隨鏈的合成。后隨鏈的進(jìn)一步延伸，也需要用PCNA-polδ或PCNA-polδ取代polα-引物酶⑥FEN-1-RNaseHl負(fù)責(zé)切除RNA引物，DNA連接酶I負(fù)責(zé)連接相鄰的岡崎片段，拓?fù)洚悩?gòu)酶I負(fù)責(zé)清除復(fù)制叉移動形成的正超螺旋，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱa和Ⅱb則負(fù)責(zé)解開連環(huán)體，促進(jìn)最后的2個(gè)以共價(jià)鍵相連的連環(huán)體DNA分開④復(fù)制因子(replicationfactor生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（2）酵母DNA的復(fù)制酵母DNA復(fù)制的起點(diǎn)稱自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationgsequence，ARS）酵母DNA復(fù)制的起始需要起點(diǎn)識別復(fù)合物（originrecognizingcomplex，ORC）參與，該復(fù)合體由6個(gè)亞基組成。相當(dāng)于原核生物的DnaA。（2）酵母DNA的復(fù)制生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件13.3.3真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)原核生物和真核生物DNA復(fù)制的基本過程是相似的，但也有一些明顯的差別共同點(diǎn)①均為半保留復(fù)制；②均為半不連續(xù)復(fù)制；③均需要解旋酶解開雙螺旋，并由SSB同單鏈區(qū)結(jié)合；④均需要拓?fù)洚悩?gòu)酶消除解螺旋形成的扭曲張力；⑤均需要RNA引物；⑥新鏈合成均有校對機(jī)制13.3.3真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)原核生物和真核生物DN不同點(diǎn)①原核生物為單起點(diǎn)復(fù)制，真核生物為多起點(diǎn)復(fù)制。原核生物的復(fù)制子大而少，真核生物的復(fù)制子小而多。②原核生物復(fù)制叉移動的速度為900nt/s，真核生物復(fù)制叉移動的速度為50nt/s。③原核生物岡崎片段的大小為1000～2000nt，真核生物岡崎片段的大小為100～200nt。④真核細(xì)胞的DNA聚合酶和蛋白質(zhì)因子的種類比原核細(xì)胞多，引物酶活性由DNApolα的兩個(gè)小亞基承擔(dān)。⑤原核細(xì)胞在第一輪復(fù)制還沒有結(jié)束的時(shí)候，就可以在復(fù)制起始區(qū)啟動第二輪復(fù)制。真核細(xì)胞的復(fù)制有復(fù)制許可因子控制，復(fù)制周期不可重疊。

⑥原核生物的DNA為環(huán)形分子，DNA復(fù)制時(shí)不存在末端會縮短的問題。真核生物的DNA為線形分子，DNA復(fù)制肘末端會縮短，需要端粒酶解決線形DNA的末端復(fù)制問題。不同點(diǎn)DNA復(fù)制與核小體組裝真核生物的染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其DNA與組蛋白構(gòu)成核小體，DNA纏繞于組蛋白核心外，每個(gè)核小體上的DNA相當(dāng)于兩個(gè)負(fù)超螺旋。復(fù)制時(shí)的岡崎片段長約200bp，恰好相當(dāng)于一個(gè)核小體DNA的長度。DNA復(fù)制時(shí)，組蛋白需同步合成，并與DNA組裝成核小體。DNA復(fù)制與核小體組裝原核生物和真核生物DNA復(fù)制調(diào)控的比較原核生物DNA復(fù)制的速率與其生長環(huán)境有關(guān)，迅速增殖的細(xì)胞通常在一次復(fù)制尚未完成的情況下，即可開始另一次復(fù)制，但復(fù)制叉上DNA鏈的延伸速度基本恒定。真核生物DNA復(fù)制的調(diào)控至少有3個(gè)層次，其一是細(xì)胞周期水平的調(diào)控；其二是染色體水平的調(diào)控；其三是復(fù)制子水平的調(diào)控。原核生物和真核生物DNA復(fù)制調(diào)控的比較端粒DNA的復(fù)制真核生物線性染色體的兩個(gè)末端具有特殊的結(jié)構(gòu)，稱為端粒，它是由許多成串的重復(fù)序列所組成。

端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，它以自身的RNA鏈為模板合成DNA端粒結(jié)構(gòu)。一條鏈?zhǔn)怯芍貜?fù)序列TTTTGGGG組成的，稱TG鏈

另一條鏈?zhǔn)怯芍貜?fù)序列AAAACCCC組成的，稱AC鏈端粒在決定細(xì)胞的壽命中起重要作用，體細(xì)胞隨著分化而失去端粒酶的活性，端?？s短。這些重復(fù)序列的少量丟失，不會傷及基因的結(jié)構(gòu)，如果短到一定程度就引起細(xì)胞停止生長或凋亡。端粒DNA的復(fù)制生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件分裂旺盛的細(xì)胞存在端粒酶（telomerase），這種酶是蛋白質(zhì)和RNA組成的復(fù)合物，其蛋白質(zhì)部分能以其RNA為模板催化合成DNA鏈。分裂旺盛的細(xì)胞存在端粒酶（telomerase），這13.4逆轉(zhuǎn)錄作用逆轉(zhuǎn)錄也稱反轉(zhuǎn)錄，是以RNA為模板合成DNA的特殊復(fù)制方式（在某些生物如雞的肉瘤病毒、HIV等）它們的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。因此，在感染細(xì)胞時(shí)，首先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄作用成為雙鏈DNA，才能整合到宿主基因組中去。13.4逆轉(zhuǎn)錄作用逆轉(zhuǎn)錄也稱反轉(zhuǎn)錄，是以RNA為模板合成D生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性（1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（2）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（3）核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5′→3′和3′→5′兩個(gè)方向起核酸外切酶的作用。cDNA

幾乎所有真核生物mRNA分子的3′末端都有一段polyA,當(dāng)加入寡聚dT作為引物時(shí)，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與其互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性13.5DNA的損傷與修復(fù)DNA的損傷DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。從而影響DNA的復(fù)制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著變化，因而表現(xiàn)出異常的特征（生物突變）。DNA損傷的修復(fù)四種修復(fù)途徑：直接修復(fù)（光復(fù)活）、切除修復(fù)、復(fù)組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)（暗修復(fù)）。13.5DNA的損傷與修復(fù)DNA的損傷13.5.1DNA損傷的產(chǎn)生DNA復(fù)制具有高度精確性，在大腸桿菌的細(xì)胞DNA復(fù)制中其錯(cuò)誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個(gè)核苷酸才出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤DNA的損傷（突變）大多數(shù)是自發(fā)的，是進(jìn)化與分化的基礎(chǔ)外界環(huán)境因素，包括化學(xué)誘變劑和物理因子以及代謝過程中產(chǎn)生的自由基等影響13.5.1DNA損傷的產(chǎn)生DNA復(fù)制具有高度精確性，在大UV物理因素：紫外線（ultraviolet，UV）、各種輻射UV物理因素：紫外線（ultraviolet，UV）、化學(xué)因素化學(xué)因素突變的分子改變類型：

錯(cuò)配、缺失、插入、重排（1）錯(cuò)配：DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變。

轉(zhuǎn)換：發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

顛換：發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。突變的分子改變類型：生物化學(xué)簡明教程第十三章DNA的生物合成課件（2）缺失、插入和框移缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變。框移突變：指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C（2）缺失、插入和框移谷酪（3）重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型（3）重排由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型13.5.2DNA損傷的修復(fù)是對已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)修復(fù)的主要類型光修復(fù)（lightrepairing）切除修復(fù)（excisionrepairing）重組修復(fù)（recombinationrepairing）SOS修復(fù)13.5.2DNA損傷的修復(fù)是對已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，直接修復(fù)：如光復(fù)活酶,可以把嘧啶二聚體恢復(fù)正常狀態(tài)。切除修復(fù)：找出損傷位置并切除，進(jìn)行修復(fù)合成并連接。重組修復(fù)：先復(fù)制再修復(fù)。子代鏈在對應(yīng)模板鏈的損傷處留下缺口，先將同源母鏈DN