實(shí)驗(yàn)13 地衣酚法測(cè)定RNA含量 - 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院新 …

實(shí)驗(yàn)13地衣酚法測(cè)定RNA含量-華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院新…實(shí)驗(yàn)13地衣酚法測(cè)定RNA含量-華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院新…實(shí)驗(yàn)13地衣酚法測(cè)定RNA含量-華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院新…實(shí)驗(yàn)13地衣酚法測(cè)定RNA含量-華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院新…編制僅供參考審核批準(zhǔn)生效日期地址：電話：傳真:郵編:實(shí)驗(yàn)13地衣酚法測(cè)定RNA含量一、目的學(xué)習(xí)和掌握測(cè)定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技術(shù)。二、原理核糖核酸與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糖醛，后者與3，5—二羥基甲苯（地衣酚）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵或氯化銅作催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收，RNA濃度在20~200微克/毫升范圍內(nèi)，光密度與RNA的濃度成正比關(guān)系，在反應(yīng)液中如混有DNA或其他雜質(zhì)。也能給出類似的顏色。因此測(cè)定RNA時(shí)可先測(cè)定DNA的含量，再計(jì)算RNA的含量。地衣酚法只能測(cè)定RNA中與嘌呤連接的核糖，不同來(lái)源的RNA所含嘌呤與嘧啶的比例各不相同，因此，用所測(cè)得的核糖量來(lái)?yè)Q算各種RNA的含量存在誤差。最好用被測(cè)樣品相同來(lái)源的純化RNA作RNA-核糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后從曲線求得被測(cè)樣品的RNA含量。三、材料、試劑和器具（一）試劑1、RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)溶液（如不溶，可滴加氫氧化銨溶液，調(diào)至pH=）2、樣品溶液：RNA濃度在20~100微克/毫升范圍內(nèi)。（自己提取）3、地衣酚試劑，先配制%三氯化鐵濃鹽酸溶液（A、R）。使用前再用上述溶液為溶劑配成%的地衣酚溶液。（臨用時(shí)配制）（二）器具1、試管及管架2、水浴鍋3、移液管（1，2，5ml）4、可見光分光光度計(jì)四、操作步驟（一）RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支試管，編號(hào)，按下表加入試劑管號(hào)試劑01234567RNA標(biāo)準(zhǔn)液0蒸餾水21..80地衣酚試劑22222222加畢，搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，冷卻，測(cè)值。以值為縱坐標(biāo)，RNA含量（微克/毫升）為橫坐標(biāo)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品的測(cè)定取~毫升樣品液于試管中，加蒸餾水稀釋至2毫升，后加2毫升地衣酚試劑搖勻，于沸水中煮15分鐘，冷卻，測(cè)。根據(jù)測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光密度的RNA的含量，按下式計(jì)算樣品中RNA的百分含量。RNA含量/毫升待測(cè)液=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值×稀釋倍數(shù)RNA產(chǎn)率（%）=含量/毫升×總體積×100新鮮肝重（g）×106五、注意事項(xiàng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，應(yīng)先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)后再測(cè)定。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告附上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并計(jì)算RNA的含量及