薄層色譜及柱色譜課件

薄層色譜及柱色譜劉雪麗劉菲李喜梅鐘家吉薄層色譜及柱色譜一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握色譜法的基本原理及其應(yīng)用。2、掌握薄層色譜及柱色譜的操作技能。二、色譜法基本原理1.色譜法又稱(chēng)為層析法，是分離，純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一。2.色譜法的基本原理是利用混合物各組分在兩相間（流動(dòng)相和固定相）的吸附或分配（溶解性能）的差異。即當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于固定相對(duì)各組分的吸附或溶解性能的不同，經(jīng)過(guò)兩相間反復(fù)多次的吸附或分配，使吸附較弱或溶解度較小的組分在固定相中移動(dòng)較快，從而使各組分得到分離。3.色譜法的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：（1）分離混合物（2）精致提純化合物（3）鑒定化合物（4）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程

展開(kāi)劑選用9:1的無(wú)水苯－乙酸乙脂偶氮苯蘇丹Ⅲ有關(guān)化合物的物理性質(zhì)：

四、薄層色譜1.薄層板的制備：（1）固定相的選擇：吸附色譜：氧化鋁、硅膠（H——不含黏合劑）分配色譜的支持劑：硅藻土、纖維素（F——含熒光物質(zhì)）（G——含煅石膏2CaSO4·H2O黏合劑)

薄層板的制備點(diǎn)樣展開(kāi)顯色，計(jì)算、分析四、薄層色譜（2）制板：干法和濕法取3g硅膠G與6-7mL0.5%-1%的羧甲基纖維素鈉的水溶液在燒杯中調(diào)成糊狀物平鋪或浸漬室溫晾干后，放入烘箱內(nèi)加熱活化通常用六中染料確定活性四、薄層色譜3.展開(kāi)（2）展開(kāi)操作：a.先在密閉的展開(kāi)槽內(nèi)倒入少量配好的展開(kāi)劑，高度不能超過(guò)1cm。待其蒸氣飽和，以達(dá)到平衡。（約5min）b.將點(diǎn)樣后的薄層板放入展槽中，先不要接觸展開(kāi)劑，讓薄層板吸附蒸氣以達(dá)飽和。（約3min）c.將點(diǎn)樣的一端放入展開(kāi)劑中，墊高薄層板，始終使薄層板浸入展開(kāi)劑為0.5cm，展開(kāi)劑高度絕對(duì)不能浸過(guò)起始線?。ㄕ归_(kāi)劑若高于樣品點(diǎn)，會(huì)使本就少量的樣品溶于展開(kāi)劑，難以隨展開(kāi)劑的展開(kāi)而分離。達(dá)不到分析的目的?。ヾ.待溶劑前沿離頂端1cm左右，就應(yīng)取出薄層板，待展開(kāi)劑揮干后，觀察分析。絕對(duì)不能使展開(kāi)劑漫過(guò)薄層板的端?。?）展開(kāi)劑的選擇：根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素考慮。四、薄層色譜（3）良好的分離，Rf值應(yīng)在0.15-0.75之間，否則應(yīng)更換展開(kāi)劑重做。通常樣品的極性越大，Rf值越小。（4）在一定的操作條件下，即色譜條件一定，比移值（Rf）只與組分性質(zhì)有關(guān)，因此可用來(lái)鑒定化合物。（定性）但是Rf值除了決定于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)外，還與吸附劑的含水量、薄層厚度，展開(kāi)劑純度、溫度等外界因素有關(guān)，因此薄層色譜幾乎不用于定性，常用來(lái)分析樣品中的組分。五、柱色譜在色譜柱中填入表面積很大、經(jīng)過(guò)活化的多孔性粉狀固體吸附劑（硅膠、氧化鋁）。分離的混合物溶液流過(guò)吸附柱時(shí)，各種成分同時(shí)被吸附在柱的上端。當(dāng)洗脫劑流下時(shí)，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，即溶質(zhì)在柱中自上而下按對(duì)吸附劑親和力大小分別形成若干色帶。再用溶劑洗脫時(shí)，已經(jīng)分開(kāi)的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出收集。吸附柱色譜的工作原理：在色譜柱中填入表面積很大、經(jīng)過(guò)活化的多孔性粉狀固體吸附劑（硅膠、氧化鋁）。分離的混合物溶液流過(guò)吸附柱時(shí)，各種成分同時(shí)被吸附在柱的上端。當(dāng)洗脫劑流下時(shí)，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，即溶質(zhì)在柱中自上而下按對(duì)吸附劑親和力大小分別形成若干色帶。再用溶劑洗脫時(shí)，已經(jīng)分開(kāi)的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出收集。吸附劑的選擇：常用的吸附劑：氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭吸附劑要求：

不能與被分離的物質(zhì)和展開(kāi)劑發(fā)生化學(xué)作用；

吸附劑的粒度大小要均勻。粒度小，表面積大，吸附能力強(qiáng)，分離效果好，但流速慢粒度大，表面積小，吸附能力弱，分離效果差，但流速快。酸性（分離酸性物質(zhì)，如有機(jī)酸類(lèi)化合物）

中性（分離中性物質(zhì)，如醛、酮、醌和酯類(lèi)化合物）

堿性（分離堿性物質(zhì)，如碳?xì)浠衔铩⑸飰A、胺等）本實(shí)驗(yàn)吸附劑：中性氧化鋁（150目）氧化鋁對(duì)各種化合物的吸附性大?。核釅A醇胺硫酸酯醛酮芳香族化合物鹵代物醚烯飽和烴1.裝柱：是柱色譜最關(guān)鍵的操作，裝柱的好壞直接影響分離效果。（1）裝柱前，應(yīng)先將玻璃柱洗凈，干燥，垂直固定在鐵架臺(tái)上。在柱底鋪一小塊脫脂棉，再鋪約0.5cm厚的石英砂，然后進(jìn)行裝柱。有濕法和濕法兩種方式，濕法裝柱效果更好。五、柱色譜（2）濕法裝柱：將固定相（如硅膠）用洗脫劑調(diào)成糊狀，在柱內(nèi)先加入約3/4柱高的洗脫劑，再將糊狀物邊震蕩邊倒入柱中，同時(shí)，打開(kāi)下旋塞，用一干凈干燥的燒杯接收洗脫劑。待糊狀物全部裝完后，用接收到的洗脫劑轉(zhuǎn)移殘留的固定相，并將柱壁上的固定相淋洗下去。裝柱過(guò)程中，應(yīng)不斷輕敲色譜柱，以使固定相填充均勻、無(wú)氣泡！整個(gè)裝柱過(guò)程中，柱內(nèi)洗脫劑的高度始終不能低于固定相最上端，否則柱內(nèi)會(huì)出現(xiàn)裂痕和氣泡！五、柱色譜2.展開(kāi)及洗脫：將樣品溶解在最少量的洗脫劑中。滴加前，打開(kāi)下旋塞使洗脫劑流出，恰好下降到固定相表面時(shí)，關(guān)閉旋塞，開(kāi)將樣品迅速全部滴加于柱頂端后，用一事先戳孔的圓形濾蓋住樣品表面，以防加洗脫劑時(shí)攪動(dòng)柱頂表面。樣品加完后，打開(kāi)下旋塞，再立即加入洗脫劑進(jìn)行洗脫。色譜帶的展開(kāi)過(guò)程就是樣品的分離過(guò)程，可按顏色段收集各組分。五、柱色譜洗脫過(guò)程中的注意事項(xiàng)：1.洗脫劑應(yīng)連續(xù)平穩(wěn)地加入，不能中斷。2.洗脫劑流出速度應(yīng)控制在每分鐘5-10滴。下移速度太快，分離效好，太慢，會(huì)造成色譜擴(kuò)散或成分破壞，影響分離效果注：色譜柱裝的好壞，將嚴(yán)重影響分離效果。得色譜柱，不得使吸附劑有裂縫和氣泡，且不得使液面低于吸附劑或砂層表面。3.吸附劑上部再填裝0.5cm厚的石英砂是什么目的？石英砂的作用就是為了整理吸附劑表面，使其成為平面，達(dá)到較好的洗脫效果。4.解釋為什麼熒光黃比亞甲基藍(lán)更易被氧化鋁吸附？熒光黃是極性化合物，它與氧化鋁有三種相互作用力存在：一是熒光黃的羧基與氧化鋁成鹽；二是羥基能與氧化鋁形成氫鍵；三是羰基的極性與氧化鋁的極