分子生物學(xué)的基本操作課件

第一章分子生物學(xué)的基本操作分子生物學(xué)研究從20世紀(jì)中葉開(kāi)始高速發(fā)展的最主要原因——現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來(lái)自任何生物的基因置于毫無(wú)親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力。外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)的過(guò)程.1952年Hershey和Chase證實(shí)噬菌體DNA侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthestructureofDNAFrancisCrick&JamesWatsonConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway知識(shí)回顧——核酸的化學(xué)組成核酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖堿基核糖（RNA）脫氧核糖（DNA）A、G、C、UA、G、C、T堿

基腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤嘌呤核苷如果是存在于DNA中的脫氧核苷則2’位則是H而不是OH。磷酸+戊糖+堿基=核苷酸核苷酸的連接方式核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’限制酶的發(fā)現(xiàn)——細(xì)菌的限制與修飾現(xiàn)象重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的主要工具酶酶

類(lèi)功

能限制性核酸內(nèi)切酶(II型)識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開(kāi)DNADNA連接酶通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來(lái)進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個(gè)切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團(tuán)1972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA分子克隆的載體----具備自主復(fù)制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。表明：

（1）像pSC101這樣的質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來(lái)的一門(mén)重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門(mén)技術(shù)，對(duì)于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱(chēng)為受體菌株。1.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化4.在全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù)。3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。2.Ca2+與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。5.涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱(chēng)寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。1.3基因擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱(chēng)為基因的體外擴(kuò)增法?；驹?/p>

PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由高溫變性—低溫退火—適溫延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，經(jīng)多個(gè)循環(huán)，理論上靶DNA分子將呈現(xiàn)指數(shù)性擴(kuò)增。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的互補(bǔ)

鏈。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR儀1.4

核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性?xún)?nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。

基本原理

一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子同介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過(guò)電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開(kāi)來(lái)。在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱(chēng)為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場(chǎng)當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。大分子量的DNA移動(dòng)的慢小分子量的DNA移動(dòng)的快電泳緩沖液陽(yáng)極陰極DNA加樣孔瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間稱(chēng)樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點(diǎn)樣電泳檢測(cè)結(jié)果檢測(cè):溴化乙錠（ethidiumbromide，簡(jiǎn)稱(chēng)EtBr）染色，紫外觀察。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個(gè)堿基對(duì)到1000個(gè)堿基對(duì)之間凝膠類(lèi)型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類(lèi)型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。1.5

基因工程載體

1.至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。

2.

至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。

3.

至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

4.安全性大腸桿菌載體pBR322結(jié)構(gòu)圖

載體特點(diǎn)基因工程載體是一類(lèi)可供外源DNA插入并攜其進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞且能自主復(fù)制的DNA分子。1.5.1

質(zhì)粒DNA及其分離細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類(lèi)獨(dú)立于染色體并能自主復(fù)制的遺傳成份。絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子，也有線性質(zhì)粒的報(bào)道。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。

E．coli的質(zhì)粒種類(lèi)

1)colE1因子（大腸桿菌素因子）—多數(shù)不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。

2)R因子（抗藥性因子）

可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝嚴(yán)緊型，質(zhì)粒較大，操作不便

3)F因子（性因子）質(zhì)粒載體DNA的分離——堿裂解法堿裂解法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的的。在pH大于12的堿性條件下染色體DNA的氫鍵斷裂雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)pH恢復(fù)至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型保存在溶液中。而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA。1.5.2

重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體1.5.2.1.

pSC101質(zhì)粒載體pSC101是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1～2個(gè)拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr）。

pSC101質(zhì)粒不僅具有可插入外源DNA的多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點(diǎn)，而且還具有四環(huán)素抗性的強(qiáng)選擇記號(hào)，因此，它被選為第一個(gè)真核基因的克隆載體。當(dāng)然，這個(gè)質(zhì)粒載體也有其明顯的缺點(diǎn)，它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA，其產(chǎn)量就要比其它質(zhì)粒載體低得多。1.5.2.2.

ColE1質(zhì)粒載體

ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。在正常生長(zhǎng)條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸被耗盡，或是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。此時(shí)，松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制達(dá)數(shù)小時(shí)之久，使每個(gè)寄主細(xì)胞中所累積的ColE1質(zhì)?？截悢?shù)增加到1000~3000個(gè)之多，質(zhì)粒DNA大約可占細(xì)胞總DNA的50%左右。由此可見(jiàn)，由于質(zhì)?？截悢?shù)高，插入的外源DNA片段的產(chǎn)量也就得到相應(yīng)的提高。

1.5.2.3

pBR322質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒是由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。123第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)：分子量較小，易于純化，操作便利。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。質(zhì)粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應(yīng)，是檢測(cè)重組體質(zhì)粒的一種十分有用的方法。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000~3000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)思考題使用pBR322載體進(jìn)行基因克隆易于造成載體自身連接環(huán)化,為什么?1.5.2.4

pUC質(zhì)粒