雜交瘤細胞單克隆抗體的生產(chǎn)方法

雜交瘤細胞單克隆抗體的生產(chǎn)方法獲得穩(wěn)定的雜交瘤細胞系后，即可根據(jù)需要大量生產(chǎn)單抗，以用于不同目的。1、單抗的大規(guī)模制備目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統(tǒng)，一是動物體內(nèi)生產(chǎn)法，這是國內(nèi)外實驗室所廣泛采用；另一是體外培養(yǎng)法。（1）

動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法迄今為止，通常情況下均采用動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法，鑒于絕大多數(shù)動物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞與同品系的脾細胞融合而得，因此使用的動物當然首選BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。可見該法操作簡便、經(jīng)濟，不過，腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白（包括Ig），因此在很多情況下要提純后才能使用，而且還有污染動物病毒的危險，故而最好用SPF級小鼠。A.材料：a.

成年BALB/c小鼠。b.

降植烷（Pristane）或液體石蠟。c.

處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞。B.方法：a.

腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。b.

7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5×105/0.2ml。c.

間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；d.

將腹水離心（2000r/min5分鐘），除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?，或凍干保存。?）

體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的方法總體上講，雜交瘤細胞系并不是嚴格的貼壁依賴細胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以進行單層細胞培養(yǎng)，又可以進行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細胞的單層細胞培養(yǎng)法是各個實驗室最常用的手段，即將雜交瘤細胞加入培養(yǎng)瓶中，以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用于單抗的大規(guī)模生產(chǎn)。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細胞數(shù)量越多，細胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產(chǎn)量就越大。目前在雜交瘤細胞的大量培養(yǎng)中，主要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，采用轉瓶或發(fā)酵罐式的生物反應器，其中包括使用微載體；其二是細胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。A.懸浮培養(yǎng)法：目前小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉瓶培養(yǎng)，通過攪拌使細胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應器，美國、加拿大、法國和德國等幾家公司生產(chǎn)這類反應器，其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半連續(xù)式和連續(xù)式。B.微載體培養(yǎng)法：微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細胞生長的載體，在攪拌作用下微載體懸浮于培養(yǎng)液中，細胞則在固體顆粒表面生長成單層?？捎米骷毎罅颗囵B(yǎng)的微載體主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質的產(chǎn)品，其中以CytodexI，Biosilon和Superbeads為好。微載體培養(yǎng)的基本方法上與懸浮培養(yǎng)相同。近來的研究表明，該法是雜交瘤細胞大量培養(yǎng)的理想途徑之一。C.中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)由中空纖維生物反應器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵等組成。用于細胞培養(yǎng)的中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯－丙烯復合物、多聚碳酸硅等材料制成，外徑一般為100-500um，壁厚25-75um，壁呈海綿狀，上面有許多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，其孔徑只允許營養(yǎng)物質和代謝廢物出入，而對細胞和大分子物質（如單抗等）有滯留作用。目前使用的中空纖維生物反應器分為柱式、板框式和中心灌流式。盡管該培養(yǎng)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)單抗時成本較低，并可獲得高產(chǎn)量高純度的抗體，由于設備價格昂貴，限制了其使用范圍。D.微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)是先將雜交瘤細胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，一定時間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗?？傊?，上述四種體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的方法仍處在發(fā)展之中；隨著研究的不斷深入和技術的完善，它們將會在單抗生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化進程中發(fā)揮越來越大的作用。（3）

雜交瘤細胞的無血清培養(yǎng)雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)絕大多數(shù)應用DMEM或RPMI-1640為基礎培養(yǎng)基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。基礎培養(yǎng)基主要提供各種氨基酸、維生素、葡萄糖、無機鹽、各種合成核酸和脂質的前體物質。而血清主要供給雜交瘤細胞等各種營養(yǎng)成分，血清中的激素可刺激細胞生長，其中的許多蛋白質能結合有毒性的離子和熱源質而起解毒作用，同時這些蛋白質對激素、維生素和脂類有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。但是，血清中含有上百種的蛋白質，這給單抗的純化帶來很大麻煩，而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動物治療可誘發(fā)變態(tài)反應；加之，血清來源有限；每批血清之間質量差異較大，直接影響結果的穩(wěn)定性，同時血清是雜交瘤細胞發(fā)生支原體污染的最主要來源之一，而且價格較貴，為了克服血清的這些缺點，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞越來越受到廣泛重視。無血清培養(yǎng)的實質就是用各種不同的添加劑來代替血清，然后進行雜交瘤細胞的培養(yǎng)。目前已報道的各類無血清培養(yǎng)基有含有大豆類脂的、含有酪蛋白的、化學限定性的、無蛋白的、含有血清低分子量成分的無血清培養(yǎng)基，其中一部分已有產(chǎn)品出售。綜合這些無血清培養(yǎng)基，約有幾十種不同的添加劑可用于無血清培養(yǎng)基，在其中至少必須添加胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鈉這四種成分，才能起到類似血清的作用，其他較重要的添加劑包括白蛋白、亞油酸和油酸、抗壞血酸以及錳等一些微量元素。采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞制備單抗，有利于單抗的純化，有助于大規(guī)模生產(chǎn)，可減少細胞污染的機會，且成本較低。但無血清培養(yǎng)細胞的生產(chǎn)率低、細胞密度小，影響了單抗的產(chǎn)量；同時無血清培養(yǎng)基還缺少血清中保護細胞免受環(huán)境中蛋白酶損傷的抑制因子等。盡管如此，無血清培養(yǎng)基終究會成為雜交瘤細胞培養(yǎng)的理想的培養(yǎng)基。2、單抗的純化（1）腹水型單抗的純化在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。A.二氧化硅吸附法：新鮮采集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min15分鐘，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa2+）稀釋；然后以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。B.過濾離心法：用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g15分鐘高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。C.混合法：即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。（2）單抗的粗提A.硫酸銨沉淀法a.

飽和硫酸銨溶液的配制：500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/LNaOH調(diào)PH至7.8。b.

鹽析：吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘；10000r/min離心15分鐘；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鐘，同法離心；重復前一步1-2次；沉淀物溶于1.5mlPBS（0.01mol/LPH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。c.脫鹽：常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過SephadexG-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鐘1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2%NaHCO3，1mmol/LEDTA溶液中煮10分鐘，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鐘，冷至室溫即可使用（并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解后，再加20%NaOH50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。a.

蛋白質含量的測定：（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數(shù)；或（Pr）=OD280×稀釋倍數(shù)/1.3b.

分裝凍存?zhèn)溆谩.辛酸－硫酸銨沉淀法該法簡單易行，適合于提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸緩沖液，用1mol/LHCl調(diào)PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH調(diào)PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鐘，靜置1小時；10000g離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS（含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量后，分裝，凍存?zhèn)溆?。C.優(yōu)球蛋白沉淀法該法適用于IgG3和IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高于90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產(chǎn)生