放射醫(yī)學(xué)所中國煙草科教網(wǎng)

朱茂祥軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所2004.06中式卷煙的生物醫(yī)學(xué)評價(jià)技術(shù)報(bào)告內(nèi)容發(fā)展中式卷煙的意義

——從吸煙與健康談起中式卷煙的生物醫(yī)學(xué)評價(jià)技術(shù)

——技術(shù)原理與方法代表性中式卷煙的安全性評價(jià)舉例

——煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害——使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害

吸煙與健康

——事實(shí)與問題全世界1/3的成年男性吸煙，香煙銷售量約1.51010支/d（約1.0107支/min）未成年人中有近1/5的吸煙者，而且每天還以8~10萬人的速度增加（近一半在亞洲）發(fā)達(dá)國家吸煙人數(shù)呈下降趨勢，但女性吸煙者增多。目前美國吸煙的女性約2200萬人，韓國女性吸煙比例從1989年的3.9%上升到1998年的6.7%，增加了近2倍；在日本，最近十年中女性吸煙者的比例也達(dá)到近10%在中國，香煙消費(fèi)量占全世界1/3，每年消耗的香煙數(shù)約1.71012支（每分鐘3.0106支），吸煙人數(shù)3.2億，比整個(gè)美國人口還多，成年人中，約67%的男性和4%的女性吸煙，未成年人中，約1/3的男性和8%的女性吸煙

——WHO：2004年公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)字事實(shí)1965~1998年間美國大于18歲公民中吸煙者的比例（按性別）（CDC，MMWR,2000，Vol49,No.39）

事實(shí)1964USSurgeonGeneral報(bào)告吸煙對健康的不良影響196541%的美國成年人吸煙1967煙盒上標(biāo)示“吸煙有害健康”1970電視上禁止煙草廣告2000美國只有25%的成年人吸煙1900~1998年間美國成年人年均吸煙量煙草中含有大量碳水化合物（占40%~50%），羧酸，色素，萜烯類，鏈烷烴，類脂物質(zhì)，以及一些生長必需的營養(yǎng)物（如硝酸鹽等）和某些污染物（如農(nóng)藥、重金屬等）吸煙是不完全燃燒過程，煙草經(jīng)一系列熱分解與熱合成反應(yīng)，產(chǎn)生大量化學(xué)物質(zhì)。據(jù)分析，煙氣中化學(xué)成分共5068種，除煙草中存在的1172種外，3896種是吸煙過程中產(chǎn)生的新的化學(xué)物質(zhì)——Roberts，1988TobaccoReporter事實(shí)卷煙煙氣的粒相物（如脂肪烴、芳香烴、萜類、羰基化合物、酚類、有機(jī)酸、氮雜環(huán)、亞硝胺、金屬）和氣相物（如氮、氧、CO2、CO、氫、揮發(fā)性烴類、酯類、呋喃類、腈類）中包含多種有害成分，如氣相中的CO、氮氧化物、丙烯醛、揮發(fā)性芳香烴、氫氰酸，粒相中的稠環(huán)芳烴、酚類、煙堿、亞硝胺、雜環(huán)化合物及微量放射性元素，以及氣相與粒相中都存在的自由基等Hoffmannlist：卷煙煙氣存在44種有害成分69種致癌物中（包括一些促癌劑或輔致癌物）NNK最受關(guān)注——HoffmannD：ChemResToxicol2001;14(7):767-9040年吸煙（40支/天）的累積NNK量可致癌——HoffmannD：PrevMed1997;26(4):427-34事實(shí)幾乎所有的機(jī)體組織、器官或系統(tǒng)均可受到吸煙的影響，其中，最敏感的部位是呼吸系統(tǒng)（肺、氣管、咽喉）、循環(huán)系統(tǒng)（心臟、血管），神經(jīng)系統(tǒng)（腦），免疫和抗氧系統(tǒng)也是近年來研究較多的問題。孕婦、未成年人（特別是嬰育兒）對吸煙的敏感性尤為值得關(guān)注吸煙可造成40種致命疾病，包括口腔癌、食道癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、膽囊癌、子宮內(nèi)膜癌及其他非常罕見的疾病等。長期吸煙者肺癌發(fā)病率比不吸煙者高10~20倍，喉癌發(fā)病率高6~10倍，冠心病發(fā)病率高2~3倍。循環(huán)系統(tǒng)發(fā)病率高3倍，氣管炎發(fā)病率高2~8倍英國牛津拉德克里夫醫(yī)院ICRF癌癥研究中心醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)與流行病學(xué)教授RichardPeto世界衛(wèi)生組織煙草與衛(wèi)生規(guī)劃署研究員AlanD.Lopez《1950~2000年期間發(fā)達(dá)國家的吸煙死亡率》事實(shí)全世界每年死于與吸煙有關(guān)的疾病人數(shù)達(dá)400萬，相當(dāng)于每8秒就有1人死亡。預(yù)計(jì)這一數(shù)字在2020年會(huì)上升到1000萬在中國，平均每天約有3000人死于吸煙——世界衛(wèi)生組織煙草與衛(wèi)生規(guī)劃署《煙草與衛(wèi)生：全球狀況報(bào)告》在美國，因吸煙引起的死亡，包括母親吸煙所致嬰兒早熟及被動(dòng)吸煙等間接的影響在內(nèi)，每年估計(jì)超過400000人，約為全部死亡數(shù)的1/5，由此花費(fèi)的醫(yī)療和保健費(fèi)用約1500億美元

美國每年死于與吸煙有關(guān)的疾病人數(shù)（430,000人）(引自：CDC,MMWR1999;48;131-38)

(1990~1994年間年平均值)事實(shí)1994年美國與吸煙有關(guān)的疾病死亡情況（引自：CDC，MMWR1997,Vol.48,No.43;993-996）疾病男性女性合并癌癥

肺癌81,17935,741116,920食道癌1,0551,9453,000其他癌癥21,6599,74331,402合計(jì)103,89347,429151,322心血管疾病

高血壓3,2332,1515,450心臟病88,64445,591134,235中風(fēng)14,9788,30323,281其他心血管疾病11,6825,17216,854合計(jì)118,60361,117

179,820呼吸器官疾病

肺炎11,292

7,881

19,173支氣管炎/肺氣腫9,2345,541

14,865慢性阻塞性肺障礙30,38518,579

48,982其他呼吸疾病

787

6681,455合計(jì)

51,788

32,689

84,475嬰兒患病數(shù)1,006705

1,711火災(zāi)死亡人數(shù)

863499

1,362總數(shù)

276,153142,537418,6901995年英國國因吸吸煙的的疾病病死亡亡人數(shù)數(shù)統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)據(jù)據(jù)(引自：：HealthEducationAuthority,1998)在英國國，估計(jì)每每年有有28.4萬人人因吸吸煙引引起的的疾病病住院院治療療，其其中死死亡人人數(shù)約約12萬人。。據(jù)估估計(jì)，，1950~2000年年間，，英國國有600萬人死死于與與吸煙煙有關(guān)關(guān)的疾疾病，，平均均每年年死于于吸煙煙的人人數(shù)是是二戰(zhàn)戰(zhàn)前的的12倍。1995年年，英英國死死于吸吸煙的的人數(shù)數(shù)為12.31萬人，，是交交通事事故(3444人)、吸毒毒(2663)、犯罪罪謀殺殺(503)、自殺殺(4379)、愛滋滋病(195)以及其其他意意外死死亡(8986)的總和和（20170））的6倍疾病

死亡百分比死亡人數(shù)男性女性男性女性合并癌癥

肺癌907321,1009,50030,600咽喉癌74471,5004001,900食管癌71622,9001,6004,500膀胱癌48171,7003002,000腎癌415700100800胃癌35101,7003002,000胰癌21256008001,500其他癌癥3472,4005003,000白血病1910200100300合計(jì)

46,600心血管疾病

心臟病231118,7007,60026,400主動(dòng)脈瘤62484,0001,8005,800心肌退化2410300300600動(dòng)脈硬化癥175100100200中風(fēng)1393,4003,9007,300合計(jì)

40,300其他疾病

支氣管炎和肺氣腫867915,1009,30024,400肺炎25115,8004,1009,900胃和十二指腸潰瘍4741100010001,900總計(jì)

81,30041,700123,100吸煙避免死亡

巴金森氏癥

9003001,200子宮肌瘤

100100合計(jì)

9004001,300總數(shù)

80,40041,300121,800問題如果不不進(jìn)行行劑量量分析析和評評價(jià)，，單憑憑卷煙煙煙氣氣中存存在的的有害害成分分，就就認(rèn)定定其對對健康康有不不良影影響，，是不不科學(xué)學(xué)的“所有有的物物質(zhì)本本身并并非毒毒物，，劑量量才使使一種種物質(zhì)質(zhì)變成成毒物物”“毒物物和藥藥物之之間的的區(qū)別別在于于正確確的劑劑量””——16世世紀(jì)著著名醫(yī)醫(yī)學(xué)家家Paracelsus與城市市空氣氣污染染比較較，人人類接接觸有有害環(huán)環(huán)境因因素中中，來來自于于卷煙煙煙氣氣，相相對來來說是是較少少的目前，，“吸吸煙有有害健健康””的““證據(jù)據(jù)”主主要來來自于于流行行病學(xué)學(xué)調(diào)查查和動(dòng)動(dòng)物實(shí)實(shí)驗(yàn)研研究的的結(jié)果果，存存在商商榷之之處吸煙者者的““誤區(qū)區(qū)”停止吸吸煙會(huì)會(huì)導(dǎo)致致體重重增加加沒有直直接證證據(jù)表表明吸吸煙能能導(dǎo)致致癌癥癥肺癌是是多因因素疾疾病絕大多多數(shù)人人都吸吸煙吸煙的的危害害遠(yuǎn)沒沒有政政府宣宣傳和和倡導(dǎo)導(dǎo)的那那么嚴(yán)嚴(yán)重許多重重度吸吸煙者者并沒沒有得得病，，且壽壽命很很長目前市市場是是的煙煙焦油油量都都較低低，每每天吸吸煙少少于20支支應(yīng)該該說是是安全全的環(huán)境煙煙草煙煙氣對對不吸吸煙者者并沒沒有嚴(yán)嚴(yán)重的的影響響問題中式卷卷煙的的生物醫(yī)醫(yī)學(xué)評評價(jià)技技術(shù)——技技術(shù)原原理與與方法法篩選對對煙氣氣敏感感的細(xì)細(xì)胞系系：用于實(shí)實(shí)驗(yàn)研研究的的細(xì)胞胞系有有數(shù)百百種，，其中中人支支氣管管上皮皮細(xì)胞胞(BEAS-2B)富富含P450酶酶，在在無需需代謝謝活化化因子子S9時(shí)能能轉(zhuǎn)化化利用用NNK等等煙氣氣中主主要有有害物物質(zhì)研制中中的細(xì)細(xì)胞氣氣體中中毒裝裝置：細(xì)胞在在培養(yǎng)養(yǎng)液中中染毒毒，與與人類類吸煙煙實(shí)際際情況況有差差別，，研制制細(xì)胞胞氣體體中毒毒裝置置對煙煙氣評評價(jià)意意義重重大卷煙煙煙氣毒毒理學(xué)學(xué)評價(jià)價(jià)動(dòng)物吸吸煙中中毒實(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)ＤＰ徒ńⅲ海簞?dòng)物在在恒氧氧、恒恒壓、、恒濕濕、恒恒溫和和煙氣氣均勻勻條件件下自自由吸吸入卷卷煙煙煙氣動(dòng)物吸吸煙試試驗(yàn)煙氣細(xì)細(xì)胞中中毒試試驗(yàn)急性毒毒性評價(jià)方方案急性毒毒性慢性毒毒性蓄積毒毒性生殖毒毒性免疫毒毒性增殖死死亡氧化損損傷膜損傷傷致突致致畸致致癌基因毒毒性煙草煙煙氣中中有數(shù)數(shù)千種種物質(zhì)質(zhì)，單單一或或數(shù)種種有害害成分分的分分析難難以全全面真真實(shí)客客觀地地反映映吸煙煙的健健康影影響。。卷煙煙煙氣氣毒理理學(xué)評評價(jià)是是以吸吸煙產(chǎn)產(chǎn)生的的煙氣氣做為為整體體，通通過動(dòng)動(dòng)物和和細(xì)胞胞中毒毒試驗(yàn)驗(yàn)，用用毒理理學(xué)的的方法法，對對卷煙煙煙氣氣的健健康影影響進(jìn)進(jìn)行評評價(jià)。。通過過與同同品質(zhì)質(zhì)對照照煙比比較，，檢驗(yàn)驗(yàn)降焦焦減害害技術(shù)術(shù)應(yīng)用用于卷卷煙中中提高高卷煙煙安全全性的的效果果。其他功功能檢檢測第一級級，動(dòng)動(dòng)物要要求2種，，雌雄雄各半半，細(xì)細(xì)胞至至少2種，，代表表人和和動(dòng)物物來源源的支支氣管管和成成纖維維細(xì)胞胞各1種。。最好好是2種染染毒途途徑。。如果果兩種種卷煙煙（一一般是是試驗(yàn)驗(yàn)樣品品煙和和對照照煙））的急急性毒毒性差差異明明顯，，則無無需進(jìn)進(jìn)行進(jìn)進(jìn)一步步的評評價(jià)，，否則則需進(jìn)進(jìn)行第第二級級和第第三級級，甚甚至其其他評評價(jià)實(shí)實(shí)驗(yàn)分級評評價(jià)方方案動(dòng)物實(shí)驗(yàn)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一級急性毒性試驗(yàn)細(xì)胞存活試驗(yàn)二級亞慢毒試驗(yàn)細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞膜損傷試驗(yàn)三級三致（致突、致畸和致癌）試驗(yàn)基因突變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)其他實(shí)驗(yàn)免疫和抗氧化功能損傷，呼吸道損傷，心血管系統(tǒng)檢查等基因與蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)動(dòng)物及及其吸吸煙染染毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)動(dòng)物昆明小小鼠和和Wistar大鼠鼠是我我國““新藥藥審批批辦法法”推推薦使使用的的動(dòng)物物。動(dòng)動(dòng)物到到達(dá)后后，按按SOPA034的的要求求接收收。每每籠5只，，飼養(yǎng)養(yǎng)在二二級動(dòng)動(dòng)物房房內(nèi)，，溫度度30±1℃，，濕度度60±5%。。由獲獲得資資格認(rèn)認(rèn)可的的人員員飼養(yǎng)養(yǎng)。所所有動(dòng)動(dòng)物按按SOPA035要要求檢檢疫觀觀察1-3天，，在此此時(shí)間間內(nèi)觀觀察動(dòng)動(dòng)物的的疾病病和死死亡指指征，，出現(xiàn)現(xiàn)異常?，F(xiàn)象象需向向?qū)ｎ}題負(fù)責(zé)責(zé)人和和臨床床獸醫(yī)醫(yī)報(bào)告告。由由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)動(dòng)物物中心心提供供標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)飼料料。從從動(dòng)物物到達(dá)達(dá)至研研究結(jié)結(jié)束自自由攝攝食。。用飲飲水瓶瓶供應(yīng)應(yīng)消毒毒自來來水，，由動(dòng)動(dòng)物自自由飲飲用。。每日日沖洗洗飲水水瓶吸煙煙染染毒毒用吸吸煙煙器器吸吸煙煙，，將將煙煙氣氣導(dǎo)導(dǎo)入入中中毒毒室室（（有有機(jī)機(jī)玻玻璃璃盒盒）），，動(dòng)動(dòng)物物在在恒恒氧氧、、恒恒壓壓、、恒恒濕濕、、恒恒溫溫和和煙煙氣氣均均勻勻的的條條件件下下自自由由吸吸入入卷卷煙煙煙煙氣氣，，造造成成動(dòng)動(dòng)物物吸吸煙煙中中毒毒的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)?zāi)ＤＰ托陀糜谟趯?shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)研研究究的的靶靶細(xì)細(xì)胞胞主主要要有有鼠或人來源源的的成纖纖維維細(xì)細(xì)胞胞和上皮皮細(xì)細(xì)胞胞四大大類類敘利利亞亞地地鼠鼠胚胚胎胎細(xì)細(xì)胞胞（SHE））優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：：易獲獲得得，，易易培培養(yǎng)養(yǎng)，，穩(wěn)穩(wěn)定定，，經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)缺點(diǎn)點(diǎn)：：敏感感性性較較差差，，結(jié)結(jié)果果難難以以外外推推到到人人人支支氣氣管管上上皮皮細(xì)細(xì)胞胞（BEAS-2B））優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：敏敏感感性性好好，，與與人人類類接接近近缺點(diǎn)點(diǎn)：：難培培養(yǎng)養(yǎng)，，費(fèi)費(fèi)用用高高將吸吸煙煙器器抽抽煙煙的的煙煙氣氣，，分分別別經(jīng)經(jīng)過過有有機(jī)機(jī)相相（（乙乙酸酸乙乙酯酯））和和無無機(jī)機(jī)相相（（基基本本培培養(yǎng)養(yǎng)液液））收收集集。。將將有有機(jī)機(jī)溶溶劑劑揮揮發(fā)發(fā)后后，，與與培培養(yǎng)養(yǎng)液液混混合合，，并并將將煙煙氣氣濃濃度度調(diào)調(diào)整整為為1支支煙煙/ml，，加加入入細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)液液中中培培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)細(xì)胞胞，，造造成成細(xì)細(xì)胞胞煙煙氣氣中中毒毒的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)?zāi)ＤＰ托图?xì)胞胞系系及及其其暴暴露露卷卷煙煙煙煙氣氣染染毒毒通常常急急性性毒毒性性是是指指動(dòng)動(dòng)物物1d內(nèi)內(nèi)單單次次或或多多次次染染毒毒后后在在7~14d中中連連續(xù)續(xù)觀觀察察動(dòng)動(dòng)物物產(chǎn)產(chǎn)生生的的毒毒性性反反應(yīng)應(yīng)及及死死亡亡情情況況。?？伎紤]慮到到吸吸煙煙的的實(shí)實(shí)際際情情況況，，在在吸吸煙煙的的急急性性毒毒性性實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中中，，我我們們采采用用所所有有動(dòng)動(dòng)物物同同時(shí)時(shí)開開始始吸吸煙煙，，連連續(xù)續(xù)染染毒毒，，直直至至全全部部動(dòng)動(dòng)物物死死亡亡為為止止，，觀觀察察動(dòng)動(dòng)物物吸吸煙煙的的反反應(yīng)應(yīng)，，準(zhǔn)準(zhǔn)確確記記錄錄每每只只動(dòng)動(dòng)物物的的死死亡亡時(shí)時(shí)間間和和吸吸煙煙量量，，計(jì)計(jì)算算平平均均活活存存時(shí)時(shí)間間和和平平均均致致死死吸吸煙煙量量，，提提供供以以下下實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)結(jié)果果：：第一一只只動(dòng)動(dòng)物物和和最最后后一一只只動(dòng)動(dòng)物物死死亡亡的的時(shí)時(shí)間間和和致致死死吸吸煙煙量量（（即即死死亡亡時(shí)時(shí)間間和和劑劑量量的的范范圍圍））一半半動(dòng)動(dòng)物物發(fā)發(fā)生生死死亡亡的的時(shí)時(shí)間間和和吸吸煙煙量量（（T1/2和LD50）對照照煙煙動(dòng)動(dòng)物物全全部部死死亡亡時(shí)時(shí)，，實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)煙煙動(dòng)動(dòng)物物的的活活存存率率必要要時(shí)時(shí)，，需需對對急急性性致致死死動(dòng)動(dòng)物物的的進(jìn)進(jìn)行行病病理理觀觀察察動(dòng)物物暴暴露露卷卷煙煙煙煙氣氣的的急急性性毒毒性性試試驗(yàn)驗(yàn)細(xì)胞胞存存活活試試驗(yàn)驗(yàn)細(xì)胞胞在在正正常常情情況況下下按按一一定定生生長長速速度度倍倍增增，，當(dāng)當(dāng)受受到到有有害害因因素素作作用用時(shí)時(shí)，，細(xì)細(xì)胞胞周周期期發(fā)發(fā)生生紊紊亂亂，，表表現(xiàn)現(xiàn)出出直直接接死死亡亡或或增增殖殖性性死死亡亡接種種效效率率試試驗(yàn)驗(yàn)細(xì)胞胞在在低低密密度度接接種種條條件件下下，，受受損損傷傷細(xì)細(xì)胞胞不不能能存存活活，，而而正正常常細(xì)細(xì)胞胞在在一一定定時(shí)時(shí)間間后后形形成成集集落落（（克克隆?。?，，通通過過計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)克克隆隆數(shù)數(shù)，，可可以以計(jì)計(jì)算算活活存存細(xì)細(xì)胞胞百百分分?jǐn)?shù)數(shù)MTT試試驗(yàn)驗(yàn)噻唑唑蘭蘭（（MTT））是是一一種種細(xì)細(xì)胞胞染染料料，，能能被被活活細(xì)細(xì)胞胞在在生生長長過過程程中中利利用用并并在在細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)沉沉積積，，因因此此，，MTT試試驗(yàn)驗(yàn)可可用用來來檢檢測測細(xì)細(xì)胞胞增增殖殖死死亡亡率率，，評評價(jià)價(jià)有有害害物物質(zhì)質(zhì)對對細(xì)細(xì)胞胞的的毒毒性性作作用用細(xì)胞胞氧氧化化損損傷傷————活活性性氧氧檢檢測測幾乎乎所所有有的的環(huán)環(huán)境境有有害害因因素素均均能能通通過過直直接接或或間間接接作作用用，，誘誘發(fā)發(fā)細(xì)細(xì)胞胞產(chǎn)產(chǎn)生生包包括括活活性性氧氧在在內(nèi)內(nèi)的的自自由由基基，，這這一一方方面面是是由由于于外外源源性性化化合合物物的的代代謝謝活活化化，，并并與與其其細(xì)細(xì)胞胞或或基基因因毒毒性性密密切切相相關(guān)關(guān)；；另另一一方方面面是是細(xì)細(xì)胞胞應(yīng)應(yīng)激激性性啟啟動(dòng)動(dòng)抗抗氧氧化化防防御御機(jī)機(jī)制制以以對對抗抗外外源源性性有有害害因因素素可可能能導(dǎo)導(dǎo)致致的的細(xì)細(xì)胞胞損損傷傷。。細(xì)細(xì)胞胞活活性性氧氧水水平平反反應(yīng)應(yīng)了了細(xì)細(xì)胞胞對對外外源源性性有有害害因因素素作作用用時(shí)時(shí)的的毒毒性性應(yīng)應(yīng)答答，，也也就就是是外外源源性性化化合合物物的的毒毒性性細(xì)胞內(nèi)活性氧氧水平細(xì)細(xì)胞中，分子探針針DCFH-DA和HE可分別與H2O2和O2.—反應(yīng)，生成二二氯熒光黃（DCF）和溴乙錠（EB），并產(chǎn)生綠色和紅色熒光，通過測測定細(xì)胞內(nèi)DCF和/或或EB的熒光光強(qiáng)度，即可可相對定量細(xì)細(xì)胞內(nèi)H2O2和O2.—水平細(xì)胞外活性含含量過氧化氫（H2O2）用辣根過氧化物物酶和酚紅捕獲，通過標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行行定量；超氧陰離子（（O2.—）用細(xì)胞色素C捕獲，通過測測定吸光度改改變進(jìn)行定量量；羥自由基（.OH）用番紅花紅捕獲，通過測測定吸光度改改變進(jìn)行定量量過氧化氫細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界界的屏蔽，具具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與物質(zhì)交換的重要功能。。有人提出膜膜損傷是疾病病發(fā)生甚至癌癌變的標(biāo)志。。細(xì)胞膜損傷傷可從以下幾幾個(gè)方面進(jìn)行行評價(jià)：膜的通透性乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中的一一種常見酶，，通常情況下下不能透過細(xì)細(xì)胞膜外逸，，因此，通過過檢測細(xì)胞外外LDH的活性，可以以評價(jià)膜通透性的改變膜的結(jié)構(gòu)與功功能腺苷三磷酸酶酶（ATPase）是細(xì)胞膜上的的一種重要酶酶，負(fù)責(zé)重要要離子的主動(dòng)動(dòng)跨膜運(yùn)輸。。通過檢測細(xì)細(xì)胞膜ATPase的活性，可可以評價(jià)膜功能性的改變膜的流動(dòng)性性采用熒光偏偏振法，細(xì)細(xì)胞經(jīng)DPH熒光探探針標(biāo)記后后，用熒光光分光光度度計(jì)測熒光光偏振度。。Kex362nm,Kem432nm,狹縫10nm,測溫25℃細(xì)胞膜損傷傷長期毒性（（也稱為亞亞急性毒性性、亞慢性性毒性、慢慢性毒性或或終生毒性性）是指動(dòng)動(dòng)物反復(fù)多多次染毒的的毒性反應(yīng)應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)時(shí)，動(dòng)物每每天固定時(shí)時(shí)間吸煙1次，按實(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要要求控制吸吸煙時(shí)間和和吸煙量，，持續(xù)3個(gè)個(gè)月后活殺殺一批，余余下動(dòng)物繼繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月進(jìn)行行恢復(fù)期觀觀察。分別別在吸煙前前、吸煙期期間的1個(gè)個(gè)月和2個(gè)個(gè)月、停止止吸煙時(shí)（（吸煙后3個(gè)月）、、停止吸煙煙后1個(gè)月月（吸煙后后4個(gè)月））觀察動(dòng)物物體重變化化、血液學(xué)學(xué)參數(shù)。實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后后，全部處處死動(dòng)物，，進(jìn)行肺組組織病理學(xué)學(xué)觀察。觀觀察指標(biāo)包包括一般觀察外觀體征和和行為活動(dòng)動(dòng)（如神態(tài)態(tài)萎靡、倦倦縮不動(dòng)或或過度興奮奮、躁動(dòng)驚驚跳、肌肉肉麻痹或震震顫、步態(tài)態(tài)異常等）），皮毛帖帖身或稀疏疏豎散，糞糞便性狀、、顏色，食食量及體重重變化等血液學(xué)指標(biāo)標(biāo)紅細(xì)胞或網(wǎng)網(wǎng)織紅細(xì)胞胞細(xì)胞數(shù)，，血紅蛋白白含量，白白細(xì)胞及其其分類細(xì)胞胞數(shù)，血小小板計(jì)數(shù)，，凝血時(shí)間間等血液生化指指標(biāo)天氡氨酸氨氨基轉(zhuǎn)換酶酶（AST）、丙氨氨酸氨基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換酶（ALT）、、堿性磷酸酸酶（ALP）、尿尿素氮（BUN）、、總蛋白（（TP）、、白蛋白（（ALB））、血糖（（GLU））、總膽紅紅素（TBIL）、、肝酐（CREA））、總膽固固醇（TCH）、鈣鈣濃度（CA）等病檢器官心、肝、脾脾、肺、腎腎、腎上腺腺、甲狀腺腺、胸腺、、睪丸(子子宮)、腦腦、交列腺腺等的重量量及其系數(shù)數(shù)，以及部部分器官的的病理學(xué)檢檢查動(dòng)物暴露卷卷煙煙氣的的慢性毒性性試驗(yàn)細(xì)菌回復(fù)突突變試驗(yàn)即Ames試驗(yàn)。實(shí)實(shí)驗(yàn)用菌株株為鼠傷寒寒沙門氏菌菌不同組氨氨酸缺陷型型突變株，，根據(jù)致突突變物能靈靈敏而特異異地使組氨氨酸缺陷型型突變株回回變成原型型的特點(diǎn)，，故在缺乏乏組氨酸的的培養(yǎng)基上上，只有少少數(shù)自發(fā)回回變菌落生生長，而能能誘發(fā)細(xì)菌菌回變的致致突變物可可使細(xì)菌生生長增多，，從而可判判斷被試物物是否具有有致突變性性染色體畸變變分析染色體數(shù)目目畸變非整倍體（（亞二倍體體和超二倍倍體）、多多倍體和內(nèi)內(nèi)復(fù)制染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)畸變裂隙、斷裂裂、斷片、、著絲粒環(huán)環(huán)和無著絲絲粒環(huán)等姐妹染色體體交換微核試驗(yàn)致突變試驗(yàn)驗(yàn)Hchr11分帶AL細(xì)胞(××400)AL細(xì)胞染色體體核型次黃嘌呤磷磷酸核糖基基轉(zhuǎn)移酶（（HPRT）主要參與嘌嘌呤核苷酸酸的補(bǔ)救合合途徑，正正常細(xì)胞能能從頭合成成DNA，，因此HPRT酶對對細(xì)胞存活活繁殖是非非必需的，，HPRT基因突變變后仍能較較長期活存存。利用正正常細(xì)胞中中HPRT酶活性，，加入毒性性嘌呤類似似物6-巰巰基鳥嘌呤呤（6-TG）培養(yǎng)，細(xì)細(xì)胞死亡，，而HPRT基因突突變的細(xì)胞胞對6-TG有抗性性而活存，，并形成克克隆，以此此可以檢測測HPRT基因突變變?nèi)祟?1號(hào)號(hào)染色體基基因突變分分析用人-中國國倉鼠卵巢巢雜交細(xì)胞胞（AL細(xì)胞）檢測人類11號(hào)號(hào)染色體（Hchr11））基因突變變是近幾年年發(fā)展起來來的一種快快速、簡便便、經(jīng)濟(jì)、、靈敏的檢檢測基因突突變的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)方法基因突變細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是是是細(xì)胞失失去原有正正常形態(tài)和和功能的表表型特征，，是細(xì)胞癌癌前病變的的重要標(biāo)志志，表現(xiàn)在在細(xì)胞增殖殖速度加快快（倍增時(shí)時(shí)間縮短）），細(xì)胞間間接觸抑制制消失（疊疊層生長）），并具有有異種組織織的浸潤性性（轉(zhuǎn)移））。檢測細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能能力是評價(jià)價(jià)外源性化化合物致癌癌性的基本本方法動(dòng)物致癌試試驗(yàn)選擇腫瘤易易感性高和和腫瘤自然然發(fā)生率低低的純品系系動(dòng)物，常常用小鼠和和大鼠。年年齡以剛斷斷乳為宜，，因它們的的易感性較較高，同時(shí)時(shí)也可具有有較長的實(shí)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)時(shí)間。計(jì)算算癌瘤發(fā)生生率，一般般以病理組組織診斷為為依據(jù)，并并與對照組組相比較，，以確定致致癌的顯著著性。確定定誘癌潛伏伏期的長短短以第一例例癌瘤發(fā)現(xiàn)現(xiàn)時(shí)間或平平均癌瘤發(fā)發(fā)現(xiàn)時(shí)間計(jì)計(jì)。判定癌癌瘤多發(fā)性性，應(yīng)計(jì)數(shù)數(shù)包括同一一機(jī)體內(nèi)發(fā)發(fā)生兩種或或兩種以上上類型的腫腫瘤，或同同一臟器、、同一系統(tǒng)統(tǒng)中出現(xiàn)多多個(gè)同類型型的癌瘤致癌試驗(yàn)生殖毒性試試驗(yàn)雄性生殖毒毒性檢測方方法精子活動(dòng)度度和精子計(jì)計(jì)數(shù)分析精子形態(tài)學(xué)學(xué)試驗(yàn)親代雄鼠睪睪丸(附睪睪)重量系系數(shù)系列交配與與擴(kuò)展交配配試驗(yàn)雌性生殖毒毒性檢測方方法一代繁殖試試驗(yàn)多代繁殖試試驗(yàn)其它輔助試試驗(yàn)（如雌性動(dòng)動(dòng)物動(dòng)情周周期觀察、、性激素水水平的測定定等）胚胎毒性評評定方法胚胎死亡率率生長遲緩率率功能不全率率畸形率免疫功能評評價(jià)體液免疫血對胸腺依依賴抗原SRBC的的抗體空斑斑反應(yīng)(PFC)血清抗體滴滴度(血凝凝法、ELISA法法)有絲分裂原原LPS刺刺激淋巴細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞免疫T細(xì)胞數(shù)(ANAE染色法)遲發(fā)性變態(tài)態(tài)反應(yīng)(DTH)有絲分裂原原PHA、、ConA刺激淋巴巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化化非特異免疫疫自然殺傷細(xì)細(xì)胞單核細(xì)胞及及T、B淋淋巴細(xì)胞標(biāo)標(biāo)記腹腔巨噬細(xì)細(xì)胞對CRBC的吞吞噬作用單核細(xì)胞對對炭粒的廓廓清代表性中式式卷煙安全性評價(jià)價(jià)舉例——煙絲添添加神農(nóng)液液降低卷煙煙危害——使用SRM生物物濾嘴降低低卷煙危害害煙絲添加神神農(nóng)液降低卷煙危危害的生物物醫(yī)學(xué)評價(jià)價(jià)——五葉神神卷煙試驗(yàn)樣品五葉神品牌牌卷煙煙絲中添加加2.5‰神農(nóng)萃取液液制成的卷卷煙(編號(hào)號(hào)205#)同品牌對照照煙未使用神農(nóng)農(nóng)萃取液的的空白煙煙絲添加神神農(nóng)液降低低卷煙危害害對照煙五葉神煙動(dòng)物數(shù)(只)3030動(dòng)物體重(g)20.072.63

19.922.67

死亡時(shí)間(min)76.25~224.50

211.60~263.93

平均活存時(shí)間(min)180.0142.22

233.0611.57平均致死吸煙量(支)41.249.19

55.232.50

與同品質(zhì)對對照煙比較較，吸五葉葉神煙組，，小鼠的平平均活存時(shí)時(shí)間和平均均致死吸煙煙量分別增增加了29.4%和34.1%吸煙210min，五葉神神煙組小鼠鼠100%存活，而而對照煙組組小鼠存活活率僅為40%，當(dāng)對照煙煙組小鼠全全都死亡時(shí)時(shí)，五葉神神煙組小鼠鼠的存活率率為高達(dá)86.7%小鼠吸煙急急性致死毒毒性試驗(yàn)空白煙五葉神淋巴細(xì)胞浸潤1.830.581.000.71*肺泡壁增厚2.500.672.110.60出血2.250.452.780.67*氣管上皮變溥2.170.941.440.73肺囊泡1.920.671.110.78*管周水腫2.170.391.890.60肺損傷總分值

12.831.7510.331.00**n=6,與與空白煙煙比較，*p<0.05,**p<0.005吸煙急性致致死小鼠肺肺組織病理理改變空白煙五葉神淋巴細(xì)胞浸潤3.400.552.800.45肺泡壁增厚2.200.451.800.45出血2.600.552.000.00*氣管上皮變溥3.200.841.600.55*肺囊泡2.600.551.600.55*管周水腫3.800.452.800.45*肺損傷總分值

17.800.4512.601.34***n=6,與與空白煙煙比較，*p<0.05,***p<0.001吸煙急性致致死大鼠肺肺組織病理理改變小鼠大鼠正常肺組織織對照煙五葉神吸煙急性致致死動(dòng)物肺肺組織病理理形態(tài)改變變肺組織病理理觀察結(jié)果果表明，同同為吸煙急急性致死動(dòng)動(dòng)物，五葉葉神煙組肺肺損傷程度度明顯減輕輕，表現(xiàn)在在淋巴細(xì)胞浸浸潤、肺泡泡壁增厚、、出血、氣氣管擴(kuò)張、、上皮變薄薄、肺囊泡泡和管周水水腫等多項(xiàng)病理理損傷指標(biāo)標(biāo)均明顯好好于對照煙煙組五葉神及其其對照煙的的細(xì)胞毒性比較五葉神煙誘誘發(fā)SHE和BEAS-2B細(xì)胞增殖殖的半數(shù)致致死劑量分分別是對照照煙的1.7倍和4倍。提示：：五葉神煙的的細(xì)胞毒性性明顯降低低不同細(xì)胞系系對卷煙煙煙氣敏感性性不同BEAS-2B細(xì)胞胞對空白煙煙的敏感性性約是SHE細(xì)胞的的11.5倍；而對五五葉神煙的的敏感性僅僅為SHE細(xì)胞的4.5倍：提示：：五葉神卷煙煙煙氣中能能被P450酶活化化的有害物物質(zhì)降低？？過氧化氫（H2O2）超氧陰離子子（O2.-）五葉神及其其對照煙誘誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS增高五葉神卷煙煙誘發(fā)細(xì)胞胞內(nèi)過氧經(jīng)經(jīng)氫和超氧氧陰離子增增高的能力力分別僅為為對照煙的的65%和60%。提示五葉葉神卷煙對對細(xì)胞的氧氧化損傷顯顯著降低。。不同種類活活性氧對煙煙氣的敏感感性不同：：超氧陰離子子的增高為為過氧化氫氫的2.3倍五葉神煙誘誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)產(chǎn)生的過氧化氫和超氧陰離子子含量含量增增高分別僅僅為同品質(zhì)質(zhì)對照煙的的40%和29%，羥自由基含量不僅明明顯低于同同品質(zhì)對照照煙，而且且觀察到對對羥自由基的清除(?)作用。表明明五葉神卷卷煙對細(xì)胞胞的氧化損損傷顯著降降低。五葉神及其其對照煙誘誘發(fā)細(xì)胞外ROS含量增高五葉神及其其對照煙對對膜通透性影響乳酸脫氫酶酶（LDH））是胞漿中一一種常見酶酶，通常情情況下不能能透過細(xì)胞胞膜外逸，，因此通過過檢測細(xì)胞胞外LDH的活性，可可以評價(jià)膜通透性的改變五葉神卷煙煙誘發(fā)細(xì)胞胞釋放的LDH活性增高僅為同同品質(zhì)對照照煙的36%，表明五葉葉神卷煙對對細(xì)胞膜損損傷顯著降降低。五葉神及其其對照煙對對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)構(gòu)和功能影響腺苷三磷酸酸酶（ATPase）是細(xì)胞膜上上的一種重重要酶，負(fù)負(fù)責(zé)重要離離子的主動(dòng)動(dòng)跨膜運(yùn)輸輸。通過檢檢測細(xì)胞膜膜ATPase的活性，可可以評價(jià)膜功能性的改變對照煙誘發(fā)發(fā)細(xì)胞膜ATP酶活性的降低程度度為五葉神神煙的1.5倍，表明五五葉神卷煙煙對細(xì)胞膜膜損傷明顯顯減輕?？侫TPase活活性五葉神及其其對照煙對對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)構(gòu)和功能影響不同ATP酶活性鈉/鉀-ATP酶酶鎂-ATP酶酶鈣-ATP酶酶鈣/鎂-ATP酶酶鈣、鎂-ATP酶是對煙氣敏敏感的指標(biāo)標(biāo)除鈣-ATP酶外，五葉神神煙對其他他ATP酶酶的損傷作作用明顯輕輕于對照煙煙神農(nóng)萃取液液含有活化鈉鈉/鉀-ATP酶的的活性成分分(?)五葉神及其其對照煙對對Hchr11基因因突變的影響人類11號(hào)號(hào)染色體(Hchr11)對包含單拷拷貝Hchr11的人-中中國倉鼠卵卵巢雜交細(xì)細(xì)胞(AL細(xì)胞)的存活無明明顯影響。。利用Hchr11表達(dá)CD59表表面抗原的的特性，用用CD59抗體可以以篩選Hchr11基因突突變的AL突變細(xì)胞胞，從而檢檢測Hchr11基因突變變率。五葉神卷煙煙誘發(fā)Hchr11基因突突變率明顯顯低于同品品質(zhì)對照煙煙，提示五五葉神煙具具有較低的的基因毒作作用。五葉神及其其對照煙對對HPRT基基因突變的影響次黃嘌呤磷磷酸核糖基基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）對正常細(xì)胞胞DNA合合成是非必必需的，而而HPRT基因突變變體對基因因毒物6-巰基鳥鳥嘌呤具有抗性，，以此可檢檢測HPRT基因突突變。低劑量時(shí)，，五葉神卷卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率率與對照煙煙無明顯差差異高劑量時(shí)，，五葉神卷卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率率明顯低于同同品質(zhì)對照照煙五葉神及其其對照煙誘誘發(fā)SHE細(xì)胞胞轉(zhuǎn)化的比較細(xì)胞轉(zhuǎn)化是細(xì)胞失去去原有正常常形態(tài)和功功能的表型型特征，是是細(xì)胞癌前前病變的重重要標(biāo)志。。檢測細(xì)胞胞轉(zhuǎn)化能力力是評價(jià)外外源性化合合物致癌性性的基本方方法。五葉神有2個(gè)連續(xù)劑量量組（0.008和0.010））轉(zhuǎn)化率明顯顯增高，對對照煙有3個(gè)連續(xù)劑量量組（0.006、0.008和0.010）轉(zhuǎn)化率明顯顯增高。相同劑量下下五葉神誘誘發(fā)的細(xì)胞胞轉(zhuǎn)化率明明顯低于對對照煙，誘誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率增高高的能力比比對照煙減減少50%。組別咳嗽次數(shù)(次)P值對照煙3支/d14.7±1.6五葉神煙1支/d14.0±1.7>0.052支/d13.2±2.4>0.053支/d12.3±2.2<0.05復(fù)方甘草合劑20ml/kg/d9.1±1.7<0.001減少氨水刺刺激小鼠致致咳反應(yīng)（治咳）延長喘息性性抽搐潛伏伏期（平喘）組別潛伏期(min)P值對照煙3支/d39.6±5.8五葉神煙1支/d41.3±6.6>0.052支/d45.2±9.8>0.053支/d50.6±11.0<0.05陽性對照藥102.7±19.4<0.001組別酚紅排泌量P值對照煙3支/d0.59±0.027五葉神煙1支/d0.60±0.061>0.052支/d0.63±0.045>0.053支/d0.67±0.065<0.05淑芬氏劑20ml/kg/d0.98±0.18<0.001增加離體氣氣管酚紅排排泌量（祛痰）改善瘀血組組織的血液液流動(dòng)性組別全血粘度(CP)低切(20S)中切(60S)高切(120S)正常組10.62±1.897.59±1.045.96±0.65對照煙3支/d15.82±1.5610.32±0.728.06±0.71五葉神煙1支/d15.78±1.4110.14±0.657.82±0.392支/d14.09±2.039.30±1.167.20±0.873支/d13.55±2.219.29±1.287.12±0.85水20ml/kg/d13.12±1.719.15±1.107.16±0.90降低吸煙所所致細(xì)胞染染色單體交交換（SCE）率組別SCE數(shù)范圍/細(xì)胞平均SCE數(shù)/細(xì)胞空白對照0~84.16±1.50溶劑對照2~94.28±1.60對照煙4~116.84±1.57五葉神煙3~95.50±1.73某外煙5~2011.42±3.15組別觀察細(xì)胞數(shù)微核數(shù)微核率空白對照組10000171.7‰對照煙組10136403.95‰實(shí)驗(yàn)煙組10075252.48‰陽性對照組1019423523.05‰抑制吸煙所所致細(xì)胞微微核形成神農(nóng)萃取液液應(yīng)用于卷卷煙中，使使小鼠和大大鼠吸煙急急性死亡的的時(shí)間和致致死吸煙量量分別增加加了約60%和30%；特別是當(dāng)當(dāng)吸對照煙煙組動(dòng)物全全部死亡時(shí)時(shí)，五葉神神煙組動(dòng)物物存活率高高達(dá)85%以上同為吸吸煙急急性致致死動(dòng)動(dòng)物，，五葉葉神煙煙組肺肺損傷傷程度度明顯顯減輕輕，表表現(xiàn)在在淋巴細(xì)細(xì)胞浸浸潤、、肺泡泡壁增增厚、、出血血、氣氣管擴(kuò)擴(kuò)張、、上皮皮變薄薄、肺肺囊泡泡和管管周水水腫等等多項(xiàng)項(xiàng)病理理損傷傷指標(biāo)均均明顯顯好于于對照照煙組組。與同品品質(zhì)對對照煙煙比較較，五五葉神神卷煙煙的細(xì)細(xì)胞毒毒性降降低了了約2~4倍，誘誘發(fā)的的細(xì)胞氧氧化損損傷、、膜損損傷、、染色色體基基因突突變和和細(xì)胞胞轉(zhuǎn)化化等細(xì)胞胞生物物學(xué)改改變均均明顯顯減輕輕與同品品質(zhì)對對照煙煙比較較，五五葉神神卷煙煙減少動(dòng)動(dòng)物的的刺激激性咳咳嗽反反應(yīng)，，延長長喘息息性抽抽搐的的潛伏伏期，，增加加離體體氣管管酚紅紅排泌泌量，，改善善瘀血血的血血液流流動(dòng)性性，降降低了了吸煙煙所致致染色色單體體交換換率，，抑制制吸煙煙所致致微核核形成成結(jié)論使用SRM生物物濾嘴嘴降低卷卷煙危危害的的生物物醫(yī)學(xué)學(xué)評價(jià)價(jià)——5mg中南南?；旎旌闲托途頍煙烻RM降低低卷煙煙煙氣氣自由由基的的效果果及穩(wěn)穩(wěn)定性性實(shí)驗(yàn)樣樣品1#煙煙普普通香香煙2#煙煙5mg中中南南海香香煙4#煙煙5mg中中南南海SRM低自自由基基香煙煙(以上上樣品品均由由北京京卷煙煙廠提提供)細(xì)胞毒毒作用用小鼠急急性毒毒性雄性小小鼠吸吸煙1個(gè)月月后