噬菌體展示技術(shù)課件

噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay1噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay1

噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡(jiǎn)介噬菌體及淘選過(guò)程?噬菌體展示應(yīng)用?淘選過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay2

噬菌體展示原理噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondis

Smith在1985年首次證實(shí)外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。噬菌體表面展示技術(shù)：是一種將外源多肽或蛋白質(zhì)的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置上,外源基因?qū)㈦S著外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá),從而使多肽或蛋白以與外殼蛋白融合表達(dá)的形式展示在噬菌體表面。

什么是噬菌體表面展示技術(shù)3

Smith在1985年首次證實(shí)外源DNA可以插入絲狀噬菌

根據(jù)噬菌體不同：溫和噬菌體---M13烈性噬菌體---T7根據(jù)文庫(kù)不同：肽庫(kù)CDNA文庫(kù)抗體庫(kù)噬菌體展示系統(tǒng)的分類4

根據(jù)噬菌體不同：噬菌體展示系統(tǒng)的分類4M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有pIII、pVIII兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。5M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13。5M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛細(xì)菌的Tol蛋白復(fù)合體解聚噬菌體的外殼蛋白，ssDNA轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體6M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過(guò)程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性7次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌主要外殼蛋白pVIII每子個(gè)病毒含約2700個(gè)拷貝，約10%能有效地融合外源多肽。以pIII融合子方式表達(dá)的是單價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的則是多價(jià)的。這種多價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而單價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。8主要外殼蛋白pVIII每子個(gè)病毒含約2700個(gè)拷貝，約10pIII展示和pVIII展示的區(qū)別pVIII展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示更大的多肽及蛋白。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在外殼蛋白pIII或pVIII的N端融合表達(dá)外源多肽及蛋白。pVIII展示pIII展示多價(jià)展示單價(jià)展示篩選到的分子親和力相對(duì)低親和力高高拷貝數(shù)增加了抗原性應(yīng)用于肽庫(kù)主要應(yīng)用于抗體庫(kù)9pIII展示和pVIII展示的區(qū)別pVIII展示的多肽比較噬菌體展示技術(shù)流程10噬菌體展示技術(shù)流程10噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建建庫(kù)：[例子]11噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建建庫(kù)：[例子]111212噬菌體質(zhì)粒-phagemid噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，沒(méi)有其他噬菌體基因。有包裝序列信號(hào)。（packingsignal）有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。13噬菌體質(zhì)粒-phagemid噬菌體質(zhì)粒特征：13篩選的方法－親和淘選

直接包被淘選法：直接將靶分子包被在固相表面優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接。缺點(diǎn)：偶爾會(huì)導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相淘選法：將靶蛋白與噬菌體抗體庫(kù)先結(jié)合，之后再親和捕獲靶分子-噬菌體復(fù)合物。優(yōu)點(diǎn)：克服直接包被的出現(xiàn)的問(wèn)題缺點(diǎn)：容易篩到與親和素（或者鏈酶親和素）結(jié)合的克隆。14篩選的方法－親和淘選直接包被淘選法：14噬菌體抗體庫(kù)淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫(kù)與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)，并擴(kuò)增，用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行下一輪篩選三輪淘選后，克隆測(cè)序15噬菌體抗體庫(kù)淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫(kù)與靶分子相互作第一步：生物素化抗體與磁珠結(jié)合

BindtoStreptavidincoatedmagnetic

bead

biotin

-antigen

噬菌體抗體庫(kù)淘選示意圖

液相法16第一步：生物素化抗體與磁珠結(jié)合

BindtoStrep第二步：磁珠生物素化抗原復(fù)合物與抗體庫(kù)結(jié)合17第二步：磁珠生物素化抗原復(fù)合物與抗體庫(kù)結(jié)合17第三步：洗滌—洗去非特異和弱結(jié)合的噬菌體18第三步：洗滌—洗去非特異和弱結(jié)合的噬菌體18第四步：洗脫—將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)19第四步：洗脫—將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)19第五步：擴(kuò)增—將洗脫的噬菌體擴(kuò)增E.coli感染和擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行下一輪篩選后面的篩選逐步加大篩選壓力多克隆和單克隆噬菌體ELISAELISA陽(yáng)性克隆測(cè)序，最終得到特異性結(jié)合的克隆序列20第五步：擴(kuò)增—將洗脫的噬菌體擴(kuò)增E.coli感染擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡(jiǎn)介噬菌體及淘選過(guò)程?噬菌體展示應(yīng)用?淘選過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案21噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay噬菌體展示噬菌體展示的應(yīng)用

抗原表位分析?發(fā)現(xiàn)特異性抗體?新疫苗、多價(jià)疫苗的開(kāi)發(fā)22噬菌體展示的應(yīng)用抗原表位分析22淘選過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案23淘選過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案23謝謝24謝謝24噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay25噬菌體展示系統(tǒng)

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噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡(jiǎn)介噬菌體及淘選過(guò)程?噬菌體展示應(yīng)用?淘選過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案噬菌體展示系統(tǒng)

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噬菌體展示原理噬菌體展示系統(tǒng)

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Smith在1985年首次證實(shí)外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。噬菌體表面展示技術(shù)：是一種將外源多肽或蛋白質(zhì)的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置上,外源基因?qū)㈦S著外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá),從而使多肽或蛋白以與外殼蛋白融合表達(dá)的形式展示在噬菌體表面。

什么是噬菌體表面展示技術(shù)27

Smith在1985年首次證實(shí)外源DNA可以插入絲狀噬菌

根據(jù)噬菌體不同：溫和噬菌體---M13烈性噬菌體---T7根據(jù)文庫(kù)不同：肽庫(kù)CDNA文庫(kù)抗體庫(kù)噬菌體展示系統(tǒng)的分類28

根據(jù)噬菌體不同：噬菌體展示系統(tǒng)的分類4M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有pIII、pVIII兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。29M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13。5M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛細(xì)菌的Tol蛋白復(fù)合體解聚噬菌體的外殼蛋白，ssDNA轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體30M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過(guò)程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性31次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌主要外殼蛋白pVIII每子個(gè)病毒含約2700個(gè)拷貝，約10%能有效地融合外源多肽。以pIII融合子方式表達(dá)的是單價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的則是多價(jià)的。這種多價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而單價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。32主要外殼蛋白pVIII每子個(gè)病毒含約2700個(gè)拷貝，約10pIII展示和pVIII展示的區(qū)別pVIII展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示更大的多肽及蛋白。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在外殼蛋白pIII或pVIII的N端融合表達(dá)外源多肽及蛋白。pVIII展示pIII展示多價(jià)展示單價(jià)展示篩選到的分子親和力相對(duì)低親和力高高拷貝數(shù)增加了抗原性應(yīng)用于肽庫(kù)主要應(yīng)用于抗體庫(kù)33pIII展示和pVIII展示的區(qū)別pVIII展示的多肽比較噬菌體展示技術(shù)流程34噬菌體展示技術(shù)流程10噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建建庫(kù)：[例子]35噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建建庫(kù)：[例子]113612噬菌體質(zhì)粒-phagemid噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，沒(méi)有其他噬菌體基因。有包裝序列信號(hào)。（packingsignal）有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。37噬菌體質(zhì)粒-phagemid噬菌體質(zhì)粒特征：13篩選的方法－親和淘選

直接包被淘選法：直接將靶分子包被在固相表面優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接。缺點(diǎn)：偶爾會(huì)導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相淘選法：將靶蛋白與噬菌體抗體庫(kù)先結(jié)合，之后再親和捕獲靶分子-噬菌體復(fù)合物。優(yōu)點(diǎn)：克服直接包被的出現(xiàn)的問(wèn)題缺點(diǎn)：容易篩到與親和素（或者鏈酶親和素）結(jié)合的克隆。38篩選的方法－親和淘選直接包被淘選法：14噬菌體抗體庫(kù)淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫(kù)與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)，并擴(kuò)增，用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行下一輪篩選三輪淘選后，克隆測(cè)序39噬菌體抗體庫(kù)淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫(kù)與靶分子相互作第一步：生物素化抗體與磁珠結(jié)合

BindtoStreptavidincoatedmagnetic

bead

biotin

-antigen

噬菌體抗體庫(kù)淘選示意圖

液相法40第一步：生物素化抗體與磁珠結(jié)合

BindtoStrep第二步：磁珠生物素化抗原復(fù)合物與抗體庫(kù)結(jié)合41第二步：磁珠生物素化抗原復(fù)合物與抗體庫(kù)結(jié)合17第三步：洗滌—洗去非特異和弱結(jié)合的噬菌體42第三步：洗滌—洗去非特異和弱結(jié)合的噬菌體18第四步：洗脫—將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)43第四步：洗脫—將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)19第五步：擴(kuò)增—將洗脫的噬菌體擴(kuò)增E.coli感染和擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行下一輪篩選后面的篩選逐步加大篩選壓力多克隆和單克隆噬菌體ELISAELISA陽(yáng)性克隆測(cè)序，最終得到特異性結(jié)合的克隆序列44