植物細胞工程課件

細胞工程動物細胞工程制藥一概述二動物細胞的形態(tài)和生理特性三生產(chǎn)動物細胞的要求和獲得四動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基五動物細胞培養(yǎng)的基本方法六動物細胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式七動物細胞生物反應器八動物細胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求九動物細胞產(chǎn)品的制造實例十動物細胞制藥的前景與展望植物細胞工程制藥一基本概念二植物細胞工程發(fā)展簡史三植物細胞的形態(tài)及生理特性四植物細胞培養(yǎng)的基本技術五影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素六植物細胞培養(yǎng)的生物反應器七進展與展望細胞工程動物細胞工程制藥植物細胞工程制藥1第五章植物細胞工程第五章植物細胞工程2第一節(jié)基本概念1.植物細胞的全能性2.植物組織和器官培養(yǎng)3.植物的分化4.脫分化5.再分化6.植物無菌培養(yǎng)7.細胞培養(yǎng)8.分生組織培養(yǎng)9.外植體10.無性繁殖系11.突變體12.繼代培養(yǎng)13.次級代謝作用和次級代謝產(chǎn)物第一節(jié)基本概念1.植物細胞的全能性3植物細胞全能性在離體培養(yǎng)下，植物的體細胞或性細胞被誘導產(chǎn)生器官分化和再生，成為具有與母體植株相同遺傳信息的植株的能力。植物細胞全能性的相對性不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應；動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯差異。細胞全能性并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。植物細胞全能性在離體培養(yǎng)下，植物的體細胞或性細胞被誘導產(chǎn)生器4植物細胞分化基因的差異性表達，即為細胞分化；具體表現(xiàn)為內(nèi)部生理變化和外部形態(tài)變化。細胞分化使細胞功能趨于專門化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是進化的表現(xiàn),越高級的植物類群,分化水平越高,細胞分工越細,機體代謝水平也越高。植物細胞分化基因的差異性表達，即為細胞分化；具體表現(xiàn)為內(nèi)部生5細胞脫分化（dedifferentiation)是指失去已分化細胞的典型特征，或消除了細胞分工，使之回復到分生組織狀態(tài)，或胚性細胞狀態(tài)。細胞脫分化階段 啟動階段，表現(xiàn)為細胞質(zhì)增生，并開始向細胞中央伸出細胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)； 演變階段，此時細胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體； 脫分化終結(jié)期，細胞回復到分生細胞狀態(tài)，細胞分裂即將開始。一個植物細胞向分生狀態(tài)回復過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)。細胞脫分化（dedifferentiation)6細胞再分化（redifferentiation)：脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在特定的條件下，重新恢復細胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進一步發(fā)育成完整植物體的過程。極性：是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構以及生理生化上的梯度差異。

在很多情況下，細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志。細胞再分化（redifferentiation)：7愈傷組織(callus)：脫分化后的細胞，往往經(jīng)過細胞分裂形成一團無特定結(jié)構和功能的松散的薄壁細胞團。外植體：用于植物組織（細胞）培養(yǎng)的器官或組織。愈傷組織(callus)：脫分化后的細胞，往往經(jīng)過細胞分裂形8第二節(jié)植物細胞工程發(fā)展簡史（了解）第二節(jié)植物細胞工程發(fā)展簡史（了解）9第三節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性一植物細胞的形態(tài)二植物細胞的結(jié)構特征三植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分四植物培養(yǎng)細胞的生理特性第三節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性一植物細胞的形態(tài)10一植物細胞的形態(tài)一植物細胞的形態(tài)11植物細胞的亞顯微結(jié)構

（質(zhì)膜）洋蔥表皮細胞顯微結(jié)構細胞壁細胞核液泡細胞質(zhì)二植物細胞的結(jié)構特征植物細胞的亞顯微結(jié)構（質(zhì)膜）洋蔥表皮細胞顯微結(jié)構細胞壁細胞12模式植物細胞構造

細胞壁胞間層初生壁次生壁后含物

原生質(zhì)體貯藏物質(zhì)晶體細胞膜細胞質(zhì)細胞器細胞核模式植物細胞模式植物細胞是由細胞壁、原生質(zhì)體、后含物三大部分組成質(zhì)體線粒體液泡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體高爾基體模式植物細胞構造細胞壁胞間層后含物原生質(zhì)體貯藏物質(zhì)細胞膜模13動植物細胞區(qū)別細胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細胞特有的結(jié)構，動物細胞沒有動植物細胞區(qū)別細胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細胞特14三植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分1生理活性物質(zhì)A酶B維生素C植物激素D抗生素和植物殺菌素2其他成分A生物堿B糖苷類C揮發(fā)油D有機酸三植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分1生理活性物質(zhì)15四植物培養(yǎng)細胞的生理特性延遲期：細胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快加速期：最大生長期，最大細胞濃度對數(shù)期：細胞數(shù)呈對數(shù)增加穩(wěn)定期：細胞高液泡化，非常脆弱四植物培養(yǎng)細胞的生理特性延遲期：細胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合16植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的細胞的全能性細胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細胞株、細胞系快速繁殖、培育無病毒植株、制造人工種子獲得細胞或細胞分泌蛋白植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞17第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的基本技術一植物材料的準備二培養(yǎng)基及其組成三培養(yǎng)方法第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的基本技術一植物材料的準備18最重要的是無菌。植物組織培養(yǎng)的外植體必須是無雜菌材料。植物組織培養(yǎng)時表面處理的常用滅菌劑（表5-5）不同器官的滅菌方式不同（表5-6）一植物材料的準備最重要的是無菌。一植物材料的準備191無機鹽：大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等2碳源：糖類，肌醇等直接通過光合作用吸收CO2二培養(yǎng)基及其組成1無機鹽：二培養(yǎng)基及其組成203.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

（1）生長素類:

(例）在離體條件下胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程,每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)，通常所用的生長素是2,4-D,濃度范圍0.5～1mg/L。在這樣一種培養(yǎng)上,愈傷組織的若干部位分化形成分生細胞團,稱作“胚性細胞團”。在增殖培養(yǎng)基上反復繼代,胚性細胞團的數(shù)量不斷增加,但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而,如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)上,它們就能發(fā)育為成熟的胚。

另：吲哚乙酸3.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

（1）生長素類:

(例）在離體條件下胡21(2)細胞分裂素類:

既或促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生,這主要取決于植物的種類及其基因型。一般而言,細胞分裂素對于促進體細胞胚的成熟有顯著作用,特別有利于子葉的發(fā)育。另外有研究表明,不同的外植體對于細胞分裂素的需要可能具有不同的專一性,如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn),雖然激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用,但濃度為0.1μM的玉米素卻能促進這個過程,而6-BA對胡蘿卜則是促進其愈傷組織的增殖,但不形成胚性愈傷組織。植物組織的生長主要取決于生長素和分裂素。(2)細胞分裂素類:

既或促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生,這主要224.氮源氮源有還原態(tài)氮(NH4+)和氧化態(tài)氮(NO3-)兩種在以KNO3為唯一氮源(如White培養(yǎng)基)的培養(yǎng)上建立起來的愈傷組織,去掉生長素以后不能形成胚。5.維生素4.氮源23三培養(yǎng)方法按培養(yǎng)基類型分為：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)1.分批培養(yǎng)法2.半連續(xù)培養(yǎng)法3.連續(xù)培養(yǎng)法4.固定化培養(yǎng)法三培養(yǎng)方法按培養(yǎng)基類型分為：24植物組織培養(yǎng)技術的流程植物組織培養(yǎng)技術的流程25第五節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素一外植體選擇二培養(yǎng)條件的影響第五節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素一外植體選擇26一外植體選擇不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累積時間各異。一外植體選擇不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物27二培養(yǎng)條件的影響1.內(nèi)在因素（菌種和營養(yǎng)條件）接種和誘導，培養(yǎng)基2.外在因素（環(huán)境條件）溫度，攪拌，容器，光3.兩步法培養(yǎng)二培養(yǎng)條件的影響1.內(nèi)在因素（菌種和營養(yǎng)條件）28影響因子外因內(nèi)因遺傳性狀生理狀態(tài)營養(yǎng)條件環(huán)境條件無機鹽有機物激素天然復合物滲透壓酸堿度濕度溫度光照影響因子外因內(nèi)因遺傳性狀生理狀態(tài)營養(yǎng)條件環(huán)境條件無機鹽有機物29第六節(jié)植物細胞培養(yǎng)的生物反應器一機械攪拌式生物反應器二鼓泡塔生物反應器三氣升式生物反應器四轉(zhuǎn)鼓式生物反應器五固定化細胞生物反應器六各種生物反應器性能比較第六節(jié)植物細胞培養(yǎng)的生物反應器一機械攪拌式生物反應器30第七節(jié)進展與展望一誘導子在植物細胞工程研究中的應用二前體飼喂三兩相法培養(yǎng)四轉(zhuǎn)基因技術在次級代謝產(chǎn)物中的應用五植物生物轉(zhuǎn)化技術與生物制藥第七節(jié)進展與展望一誘導子在植物細胞工程研究中的應用31細胞工程動物細胞工程制藥一概述二動物細胞的形態(tài)和生理特性三生產(chǎn)動物細胞的要求和獲得四動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基五動物細胞培養(yǎng)的基本方法六動物細胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式七動物細胞生物反應器八動物細胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求九動物細胞產(chǎn)品的制造實例十動物細胞制藥的前景與展望植物細胞工程制藥一基本概念二植物細胞工程發(fā)展簡史三植物細胞的形態(tài)及生理特性四植物細胞培養(yǎng)的基本技術五影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素六植物細胞培養(yǎng)的生物反應器七進展與展望細胞工程動物細胞工程制藥植物細胞工程制藥32第五章植物細胞工程第五章植物細胞工程33第一節(jié)基本概念1.植物細胞的全能性2.植物組織和器官培養(yǎng)3.植物的分化4.脫分化5.再分化6.植物無菌培養(yǎng)7.細胞培養(yǎng)8.分生組織培養(yǎng)9.外植體10.無性繁殖系11.突變體12.繼代培養(yǎng)13.次級代謝作用和次級代謝產(chǎn)物第一節(jié)基本概念1.植物細胞的全能性34植物細胞全能性在離體培養(yǎng)下，植物的體細胞或性細胞被誘導產(chǎn)生器官分化和再生，成為具有與母體植株相同遺傳信息的植株的能力。植物細胞全能性的相對性不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應；動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯差異。細胞全能性并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。植物細胞全能性在離體培養(yǎng)下，植物的體細胞或性細胞被誘導產(chǎn)生器35植物細胞分化基因的差異性表達，即為細胞分化；具體表現(xiàn)為內(nèi)部生理變化和外部形態(tài)變化。細胞分化使細胞功能趨于專門化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是進化的表現(xiàn),越高級的植物類群,分化水平越高,細胞分工越細,機體代謝水平也越高。植物細胞分化基因的差異性表達，即為細胞分化；具體表現(xiàn)為內(nèi)部生36細胞脫分化（dedifferentiation)是指失去已分化細胞的典型特征，或消除了細胞分工，使之回復到分生組織狀態(tài)，或胚性細胞狀態(tài)。細胞脫分化階段 啟動階段，表現(xiàn)為細胞質(zhì)增生，并開始向細胞中央伸出細胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)； 演變階段，此時細胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體； 脫分化終結(jié)期，細胞回復到分生細胞狀態(tài)，細胞分裂即將開始。一個植物細胞向分生狀態(tài)回復過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)。細胞脫分化（dedifferentiation)37細胞再分化（redifferentiation)：脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在特定的條件下，重新恢復細胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進一步發(fā)育成完整植物體的過程。極性：是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構以及生理生化上的梯度差異。

在很多情況下，細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志。細胞再分化（redifferentiation)：38愈傷組織(callus)：脫分化后的細胞，往往經(jīng)過細胞分裂形成一團無特定結(jié)構和功能的松散的薄壁細胞團。外植體：用于植物組織（細胞）培養(yǎng)的器官或組織。愈傷組織(callus)：脫分化后的細胞，往往經(jīng)過細胞分裂形39第二節(jié)植物細胞工程發(fā)展簡史（了解）第二節(jié)植物細胞工程發(fā)展簡史（了解）40第三節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性一植物細胞的形態(tài)二植物細胞的結(jié)構特征三植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分四植物培養(yǎng)細胞的生理特性第三節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性一植物細胞的形態(tài)41一植物細胞的形態(tài)一植物細胞的形態(tài)42植物細胞的亞顯微結(jié)構

（質(zhì)膜）洋蔥表皮細胞顯微結(jié)構細胞壁細胞核液泡細胞質(zhì)二植物細胞的結(jié)構特征植物細胞的亞顯微結(jié)構（質(zhì)膜）洋蔥表皮細胞顯微結(jié)構細胞壁細胞43模式植物細胞構造

細胞壁胞間層初生壁次生壁后含物

原生質(zhì)體貯藏物質(zhì)晶體細胞膜細胞質(zhì)細胞器細胞核模式植物細胞模式植物細胞是由細胞壁、原生質(zhì)體、后含物三大部分組成質(zhì)體線粒體液泡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體高爾基體模式植物細胞構造細胞壁胞間層后含物原生質(zhì)體貯藏物質(zhì)細胞膜模44動植物細胞區(qū)別細胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細胞特有的結(jié)構，動物細胞沒有動植物細胞區(qū)別細胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細胞特45三植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分1生理活性物質(zhì)A酶B維生素C植物激素D抗生素和植物殺菌素2其他成分A生物堿B糖苷類C揮發(fā)油D有機酸三植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分1生理活性物質(zhì)46四植物培養(yǎng)細胞的生理特性延遲期：細胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快加速期：最大生長期，最大細胞濃度對數(shù)期：細胞數(shù)呈對數(shù)增加穩(wěn)定期：細胞高液泡化，非常脆弱四植物培養(yǎng)細胞的生理特性延遲期：細胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合47植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的細胞的全能性細胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細胞株、細胞系快速繁殖、培育無病毒植株、制造人工種子獲得細胞或細胞分泌蛋白植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞48第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的基本技術一植物材料的準備二培養(yǎng)基及其組成三培養(yǎng)方法第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的基本技術一植物材料的準備49最重要的是無菌。植物組織培養(yǎng)的外植體必須是無雜菌材料。植物組織培養(yǎng)時表面處理的常用滅菌劑（表5-5）不同器官的滅菌方式不同（表5-6）一植物材料的準備最重要的是無菌。一植物材料的準備501無機鹽：大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等2碳源：糖類，肌醇等直接通過光合作用吸收CO2二培養(yǎng)基及其組成1無機鹽：二培養(yǎng)基及其組成513.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

（1）生長素類:

(例）在離體條件下胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程,每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)，通常所用的生長素是2,4-D,濃度范圍0.5～1mg/L。在這樣一種培養(yǎng)上,愈傷組織的若干部位分化形成分生細胞團,稱作“胚性細胞團”。在增殖培養(yǎng)基上反復繼代,胚性細胞團的數(shù)量不斷增加,但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而,如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)上,它們就能發(fā)育為成熟的胚。

另：吲哚乙酸3.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

（1）生長素類:

(例）在離體條件下胡52(2)細胞分裂素類:

既或促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生,這主要取決于植物的種類及其基因型。一般而言,細胞分裂素對于促進體細胞胚的成熟有顯著作用,特別有利于子葉的發(fā)育。另外有研究表明,不同的外植體對于細胞分裂素的需要可能具有不同的專一性,如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn),雖然激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用,但濃度為0.1μM的玉米素卻能促進這個過程,而6-BA對胡蘿卜則是促進其愈傷組織的增殖,但不形成胚性愈傷組織。植物組織的生長主要取決于生長素和分裂素。(2)細胞分裂素類:

既或促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生,這主