蛋白質(zhì)工程課件

親和標(biāo)記是根據(jù)酶和底物的親和性，修飾劑不僅具有對(duì)被作用基團(tuán)的專(zhuān)一性，而且具有對(duì)被作用部位的專(zhuān)一性，即試劑作用于被作用部位的某一基團(tuán),而不與被作用部位以外的同類(lèi)基團(tuán)發(fā)生作用。這類(lèi)修飾劑也稱(chēng)為位點(diǎn)專(zhuān)一性抑制劑。8.6親和標(biāo)記親和標(biāo)記是根據(jù)酶和底物的親和性，修飾劑不僅具有對(duì)被作用基團(tuán)的1親和標(biāo)記設(shè)計(jì)要滿(mǎn)足兩個(gè)條件：親和試劑必須含有能與某些氨基酸殘基起反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)親和試劑應(yīng)當(dāng)對(duì)活性部位專(zhuān)一性結(jié)合

蛋白質(zhì)的正常配位體、底物和抑制劑的結(jié)構(gòu)都可以作為設(shè)計(jì)親和試劑的參考。親和標(biāo)記設(shè)計(jì)要滿(mǎn)足兩個(gè)條件：2第9章蛋白質(zhì)工程課件3光親和試劑是一類(lèi)特殊的親和試劑它在結(jié)構(gòu)上除了有一般親和試劑的特點(diǎn)外，還具有一個(gè)光反應(yīng)基團(tuán)。先與酶活性部位在暗條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后被光照激活后，產(chǎn)生一個(gè)活潑的功能基團(tuán)，能與它們附近基團(tuán)反應(yīng)，形成一個(gè)共價(jià)的標(biāo)記物。光親和試劑4555酶分子化學(xué)修飾的應(yīng)用

活性中心的研究化學(xué)修飾法、X-光晶體衍射法、核磁共振。酶的空間結(jié)構(gòu)研究

采用具有熒光特性的修飾劑，可借助熒光光譜研究，分析各基團(tuán)在酶分子中的空間分布情況。采用巰基修飾劑，可了解酶分子中半胱氨酸的數(shù)目及分布情況，確定肽鏈的數(shù)目和二硫鍵的數(shù)目。酶的作用機(jī)制研究

了解各種殘基及側(cè)鏈基團(tuán)在酶催化過(guò)程中的作用。

酶分子化學(xué)修飾的應(yīng)用活性中心的研究6二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用7例：大分子修飾提高超氧物歧化酶的穩(wěn)定性該酶能保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜，使它們免遭超氧負(fù)離子的破壞例：大分子修飾提高超氧物歧化酶的穩(wěn)定性該酶能保護(hù)DNA、蛋白83.應(yīng)用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血類(lèi)蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）PEG－天門(mén)冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、過(guò)氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。3.應(yīng)用：9化學(xué)修飾方法的局限性擴(kuò)散速度受限生物活性降低修飾劑呈現(xiàn)多種聚合度，選擇性不高化學(xué)修飾方法的局限性擴(kuò)散速度受限10提高酶性能的方法：1）從自然界篩選或誘導(dǎo)變異具有不同性質(zhì)的突變體

不能保證在獲得一種有利的突變時(shí)不會(huì)損害另一優(yōu)良性能。2）蛋白質(zhì)化學(xué)修飾

不夠?qū)Ｒ?，?duì)分子內(nèi)部的一些疏水氨基酸的側(cè)鏈也無(wú)法予以修飾。3）化學(xué)合成

對(duì)于分子量大于1萬(wàn)道爾頓的蛋白質(zhì)，從經(jīng)濟(jì)和技術(shù)上不能滿(mǎn)足工業(yè)用酶或蛋白質(zhì)的要求。第九章酶的蛋白質(zhì)工程提高酶性能的方法：第九章酶的蛋白質(zhì)工程11途徑方法優(yōu)點(diǎn)不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)蛋白質(zhì)水平化學(xué)修飾適應(yīng)所有酶，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)修飾過(guò)程破壞酶分子劑型固定化適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良穩(wěn)定劑簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)工作量大反應(yīng)介質(zhì)適用于特殊反應(yīng)體系和酶類(lèi)適合的酶類(lèi)還不普遍途徑方法優(yōu)點(diǎn)不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分12一、蛋白質(zhì)工程概念：根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其功能的關(guān)系，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以生產(chǎn)出性能更加優(yōu)良的新型酶分子。是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造。一、蛋白質(zhì)工程概念：13基因工程與蛋白質(zhì)工程：

基因工程指用人為的方法將所需要的某一供體生物的DNA提取出來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下用適當(dāng)?shù)拿盖懈詈?，把它與載體DNA分子連接起來(lái)形成具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子，并將它轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。基因工程可以使在人類(lèi)控制的條件下生產(chǎn)任何自然界中已存在的蛋白質(zhì)以滿(mǎn)足人類(lèi)的需要。蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)可使人類(lèi)可以生產(chǎn)自然界根本不存在的,但其性質(zhì)又是人類(lèi)所期望的新型蛋白質(zhì)。因此蛋白質(zhì)工程又稱(chēng)為第二代基因工程。

基因工程與蛋白質(zhì)工程：基因工程指用人為的方法將所需要的某14第9章蛋白質(zhì)工程課件15第9章蛋白質(zhì)工程課件16第9章蛋白質(zhì)工程課件17二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其所含的氨基酸序列,而氨基酸的序列又由其編碼基因的核苷酸序列所決定。因此按預(yù)定方案通過(guò)對(duì)編碼該蛋白質(zhì)基因的改造應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以獲得新型的蛋白質(zhì)分子。二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)18蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：直接法：直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來(lái)推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：X-射線(xiàn)晶體衍射——研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定19

X-射線(xiàn)衍射技術(shù)：用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。X-射線(xiàn)衍射技術(shù)：20三、蛋白質(zhì)工程的主要手段蛋白質(zhì)工程的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)是創(chuàng)造人類(lèi)所需要的各種性能優(yōu)越的人造蛋白質(zhì)。但目前主要是通過(guò)基因突變手段以制取天然蛋白質(zhì)的各種人工突變產(chǎn)物。

以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。位點(diǎn)特異性突變—基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)基因突變隨機(jī)突變——基于高通量篩選法基因內(nèi)部的剪接基因剪接5‘或3’端的剪接三、蛋白質(zhì)工程的主要手段21定點(diǎn)誘變(site-directedmutagenesis)在體外使DNA分子內(nèi)部的特異部位發(fā)生突變的過(guò)程。最常用的方法是合成一條序列有變異的寡核苷酸，使其與靶DNA分子雜交/退火，再合成完整的DNA。定點(diǎn)誘變(site-directedmutagenesi22定點(diǎn)突變的方法定點(diǎn)突變的方法23產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法：化學(xué)誘變，錯(cuò)摻誘變，盒式誘變。高通量篩選法：從巨大數(shù)目的突變體庫(kù)中篩選到具有期望功能的突變體。篩選方法：表型觀察篩選，當(dāng)篩選的蛋白可以產(chǎn)生可見(jiàn)信號(hào)時(shí)，用簡(jiǎn)單的表型觀察和篩選被廣泛應(yīng)用。

目前，蛋白質(zhì)突變體庫(kù)篩選一般是固態(tài)（瓊脂糖和濾膜）或者液態(tài)（微量滴定孔板）條件下通過(guò)表型選擇和篩選而完成的。高通量篩選蛋白質(zhì)突變體庫(kù)的方法：噬菌體展示技術(shù)（phagedisplay)。產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法：24適用范圍：抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物的開(kāi)發(fā)研究方面適用范圍：抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物的開(kāi)發(fā)25第9章蛋白質(zhì)工程課件26第9章蛋白質(zhì)工程課件27基因內(nèi)部剪接在編碼基因的內(nèi)部插入或剪去特定的序列、結(jié)構(gòu)原件或結(jié)構(gòu)域。5’或3’端的剪接融合基因可以用于在體外產(chǎn)生不同基因或基因片段之間的融合，產(chǎn)生融合蛋白。避免目的蛋白在表達(dá)時(shí)被降解增加分泌性（信號(hào)肽）提高溶解性（硫氧化還原蛋白）基因內(nèi)部剪接28重組酶的高效表達(dá)

一、細(xì)菌表達(dá)體系

二、酵母系統(tǒng)中的表達(dá)

三、絲狀真菌中的表達(dá)

重組酶的高效表達(dá)

291.用大腸桿菌表達(dá)體系生產(chǎn)重組酶常用宿主菌株的基因型DH5：supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1JM109:supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1

?(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZ?M151.用大腸桿菌表達(dá)常用宿主菌株的基因型30大腸桿菌表達(dá)載體必備元件：大腸桿菌表達(dá)載體必備元件：31

目前在原核系統(tǒng)中使用得最普遍的強(qiáng)啟動(dòng)子主要有5個(gè)：①大腸桿菌的lac啟動(dòng)子：②大腸桿菌的trp操縱子的啟動(dòng)子：③將lac啟動(dòng)子的一10區(qū)和trp啟動(dòng)子的一35區(qū)融合起來(lái)的tac啟動(dòng)子；④T7噬菌體中基因10的啟動(dòng)子；⑤l噬菌體中的左向啟動(dòng)子PL。這些啟動(dòng)子都是通過(guò)和阻遏蛋白的相互作用，來(lái)控制基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和停止的。

目前在原核系統(tǒng)中使用得最普遍的強(qiáng)啟動(dòng)子主要有5個(gè)：32

lac/tac/trc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控Plac+1rbsFG Terminator

mRNAIPTG阻遏蛋白

lac/tac/trc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控Plac+133二、酵母表達(dá)系統(tǒng)例1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是重要的醫(yī)用酶。大腸桿菌表達(dá)體系能將N端的甲硫氨酸除去，但不能將第二個(gè)氨基酸(Ala)乙酰化。需用真核系統(tǒng)表達(dá)！

基因源：人的Cu/Zn-SODcDNA基因 質(zhì)粒載體：釀酒酵母2mm質(zhì)粒 啟動(dòng)子：酵母甘油醛磷酸脫氫酶(GAPD)啟動(dòng)子 附加：轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、poly(A)信號(hào)。 宿主細(xì)胞：Leu缺陷型的釀酒酵母。二、酵母表達(dá)系統(tǒng)例1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Z34釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒35釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：表達(dá)水平偏低表達(dá)質(zhì)粒易丟失重組蛋白常發(fā)生超糖基化分泌效率差釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：36嗜甲醇的酵母(Pichiapastoris)優(yōu)點(diǎn)：能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)。

乙醇氧化酶基因aoxl的啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，甲醇誘導(dǎo)時(shí)，酶產(chǎn)量可達(dá)總蛋白的30％。

畢赤酵母載體包括自主復(fù)制的游離載體和整合型載體，由于沒(méi)有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型質(zhì)粒作為外源基因的表達(dá)載體。 宿主細(xì)胞為組氨酸脫氫酶缺陷型(HIS4一)嗜甲醇的酵母(Pichiapastoris)優(yōu)點(diǎn)：37第9章蛋白質(zhì)工程課件38牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表達(dá)

牛溶菌酶作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，具有抗蛋白酶的功能?？捎米鳛榇龠M(jìn)反芻動(dòng)物消化的飼料添加劑。 牛溶菌酶前體經(jīng)P．pastoris正確修飾后分泌到培養(yǎng)基中，分泌的蛋白與天然溶菌酶活性相當(dāng)，在10L發(fā)酵罐發(fā)酵200h，產(chǎn)量達(dá)2g/L。第9章蛋白質(zhì)工程課件39絲狀真菌牛溶菌酶基因表達(dá)質(zhì)粒牛溶菌酶基因表達(dá)質(zhì)粒40三、絲狀真菌表達(dá)體系得到發(fā)展主要理由是?絲狀真菌的發(fā)酵技術(shù)成熟，有利于重組蛋白生產(chǎn) 的工業(yè)化；?絲狀真菌具有很強(qiáng)的分泌能力，有望提高重組蛋 白的生產(chǎn)效率；?新表達(dá)系統(tǒng)的建立可避開(kāi)大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白 的專(zhuān)利限制；?米曲霉和黑曲霉等絲狀真菌被FDA和世衛(wèi)組織認(rèn) 定安全。三、絲狀真菌表達(dá)體系得到發(fā)展主要理由是41質(zhì)粒載體元件質(zhì)粒載體元件42在絲狀真菌中的選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)標(biāo)記：ade(腺嘌呤)、trp等很多。優(yōu)點(diǎn)：載體質(zhì)?？蛇M(jìn)行同源整合，易于篩選；缺點(diǎn)：大多數(shù)絲狀真菌難獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型。b.顯性標(biāo)記：包括藥物抗性標(biāo)記，如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌靈抗性等c.細(xì)菌的報(bào)告基因：在絲狀真菌啟動(dòng)子帶動(dòng)下的表達(dá)，也可作為選擇標(biāo)記，如GUS等。在絲狀真菌中的選擇標(biāo)記：43表達(dá)水平： 與多種因素有關(guān)，包括選用的啟動(dòng)子及其他調(diào)控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷貝數(shù)和受體菌株等。穩(wěn)定性： 轉(zhuǎn)化子在有絲分裂過(guò)程中，多數(shù)經(jīng)過(guò)幾十代的有絲分裂。但經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂表現(xiàn)出高度的不穩(wěn)定。表達(dá)水平：44第三節(jié)蛋白質(zhì)工程成果及應(yīng)用

一.蛋白質(zhì)工程的成果在十幾年里,蛋白質(zhì)工程已取得鼓舞人心成果。

1.基礎(chǔ)研究方面:酪氨酰tRNA合成酶是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究得比較深入的酶之一。該酶在ATP存在的條件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸轉(zhuǎn)移到tRNA的3'末端形成酪氨酰tRNA。第三節(jié)蛋白質(zhì)工程成果及應(yīng)用一.蛋白質(zhì)工程的成果45

研究表明該酶與其底物之間能形成11對(duì)氫鍵,其中8對(duì)氫鍵的形成來(lái)源于酶的氨基酸側(cè)鏈。1989年,Eersht等人應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)這8個(gè)側(cè)鏈殘基進(jìn)行系統(tǒng)突變以揭示側(cè)鏈在整個(gè)酶促反應(yīng)中的作用以及對(duì)決定酶與底物結(jié)合專(zhuān)一性方面的影響。他們還發(fā)現(xiàn)酶與過(guò)渡態(tài)分子的結(jié)合力可直接影響酶促反應(yīng)的速度。研究表明該酶與其底物之間能形成11對(duì)氫鍵,其中8對(duì)氫46枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)工程枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)工程47

洗衣粉中對(duì)酶的穩(wěn)定性有影響因素：表面活性劑：破壞酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)漂白劑：化學(xué)氧化洗衣粉中對(duì)酶的穩(wěn)定性有影響因素：48抗氧化性結(jié)果是Ala222抗氧化性最強(qiáng)抗氧化性結(jié)果是Ala222抗氧化性最強(qiáng)49應(yīng)用蛋白質(zhì)工程已取得的研究成果實(shí)例

─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────誘變蛋白質(zhì)

氨基酸突變

原定目標(biāo)

結(jié)果─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────T4溶菌酶Ile→Cys構(gòu)建二硫鍵

成功增加熱穩(wěn)定性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────枯草桿菌Gly→Lys拓寬酶作用的成功蛋白酶底物范圍Ala→Leu提高抗氧化性能────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────α-抗凝酶Met→Val提高抗氧化性能

成功應(yīng)用蛋白質(zhì)工程已取得的研究成果實(shí)例50─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────胰蛋白酶Gly→Ala提高酶水解專(zhuān)一性

成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-內(nèi)酰胺酶Ser→Cys驗(yàn)證Ser對(duì)該酶成功的重要性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-干擾素Cys→Ser提高穩(wěn)定性

成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────白細(xì)胞介素-2Cys→Ser提高產(chǎn)物活性

不成功(產(chǎn)物穩(wěn)定性↓)

─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────二氫葉酸Asp→Asn驗(yàn)證酶的活性成功中心還原酶──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────51二.蛋白質(zhì)工程的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1.關(guān)于分子導(dǎo)向多肽藥物的設(shè)計(jì)與研制:

人們希望利用特異性結(jié)合的特點(diǎn),將單克隆抗體作為定向載體,但是有關(guān)單克隆抗體與藥物、核素、毒素的耦合物試驗(yàn)結(jié)果并不理想。對(duì)此人們應(yīng)用蛋白質(zhì)工程進(jìn)行“重新設(shè)計(jì)”,即利用DNA重組技術(shù)的手段,將不同功能的基因區(qū)段進(jìn)行重新拼接,進(jìn)行克隆并表達(dá)出雜合蛋白質(zhì),初步結(jié)果很好。二.蛋白質(zhì)工程的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用52α轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)與綠膿桿菌毒素的Ⅱ與Ⅲ區(qū)段的基因(PE40)拼接形成的雜合蛋白能夠明顯地延長(zhǎng)荷瘤裸鼠(腫瘤細(xì)胞表面有TGF的受體)的生存期,但該雜合毒素卻不殺死不帶此受體的細(xì)胞。由此可見(jiàn)通過(guò)蛋白質(zhì)工程可以制備特異性很強(qiáng)的“生物導(dǎo)彈”。α轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)與綠膿桿菌毒素的Ⅱ與Ⅲ區(qū)段的基53抗體工程的設(shè)計(jì)與研制:蛋白質(zhì)工程中進(jìn)展最快又與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的是“抗體工程”。目前單克隆抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)單抗)用于臨床疾病治療問(wèn)題之一是由于其絕大多數(shù)來(lái)源于小鼠(小鼠免疫球蛋白)?？贵w工程的設(shè)計(jì)與研制:54

對(duì)于人體而言它是一種異體蛋白,會(huì)引起人體產(chǎn)生人抗鼠抗體。若再度使用小鼠單抗,不僅會(huì)中和單抗使之失效,還產(chǎn)生有害的過(guò)敏反應(yīng)。對(duì)此人們應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行改造,出現(xiàn)了抗體工程。

它包括嵌合抗體、重構(gòu)抗體、單鏈抗原結(jié)合區(qū)、單功能域抗體及全套抗體的研究,其主要目的是使鼠源性抗體“人源化”。對(duì)于人體而言它是一種異體蛋白,會(huì)引起人體產(chǎn)生人抗鼠55嵌合抗體:是應(yīng)用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū))基因與人免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)(C區(qū))基因相連接,構(gòu)建成嵌合基因,導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),制成嵌合抗體。目前國(guó)內(nèi)外已制備了數(shù)十種嵌合抗體。其免疫原性已大為降低，半衰期可以延長(zhǎng)許多倍。

嵌合抗體:是應(yīng)用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū))基56蛋白質(zhì)工程存在的問(wèn)題

蛋白質(zhì)工程集中了當(dāng)代分子生物學(xué)一些最新成就,并將核酸研究與蛋白質(zhì)研究結(jié)合起來(lái),同時(shí)也將基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究結(jié)合起來(lái)。但它的發(fā)展受以下幾個(gè)因素制約:1.構(gòu)象的快速測(cè)定手段:以分子定向改造為目標(biāo)的蛋白質(zhì)工程須借助于精確的三維結(jié)構(gòu)信息,而目前主要靠X-射線(xiàn)單晶體結(jié)構(gòu)分析,受到單晶培養(yǎng)的限制。目前正在尋求通過(guò)電子衍射三維分析、二維核磁共振等手段來(lái)克服上述限制。蛋白質(zhì)工程存在的問(wèn)題57

2.基因高效表達(dá)以及有效的下游技術(shù)高效表達(dá)載體分泌性寄主系統(tǒng)高效批量分離技術(shù)2.基因高效表達(dá)以及有效的下游技術(shù)58

隨著基因工程技術(shù)對(duì)微生物學(xué)的滲透,近幾年來(lái)又提出了“代謝工程”的概念,這也是今后的重要發(fā)展方向之一。眾所周知,基因工程發(fā)展到目前,人類(lèi)所能操縱的實(shí)質(zhì)上僅僅是單個(gè)基因;從產(chǎn)品角度看也只能操縱蛋白質(zhì)(包括酶、活性多肽及疫苗等),對(duì)多個(gè)相關(guān)基因或非蛋白質(zhì)產(chǎn)物仍然難以控制。實(shí)際上與人類(lèi)密切相關(guān)的物質(zhì)還有非蛋白質(zhì)產(chǎn)物,這不屬于基因的一級(jí)(直接)產(chǎn)物,例如維生素、抗生素、氨基酸、糖和脂肪等等。隨著基因工程技術(shù)對(duì)微生物學(xué)的滲透,近幾年來(lái)又提出了“59親和標(biāo)記是根據(jù)酶和底物的親和性，修飾劑不僅具有對(duì)被作用基團(tuán)的專(zhuān)一性，而且具有對(duì)被作用部位的專(zhuān)一性，即試劑作用于被作用部位的某一基團(tuán),而不與被作用部位以外的同類(lèi)基團(tuán)發(fā)生作用。這類(lèi)修飾劑也稱(chēng)為位點(diǎn)專(zhuān)一性抑制劑。8.6親和標(biāo)記親和標(biāo)記是根據(jù)酶和底物的親和性，修飾劑不僅具有對(duì)被作用基團(tuán)的60親和標(biāo)記設(shè)計(jì)要滿(mǎn)足兩個(gè)條件：親和試劑必須含有能與某些氨基酸殘基起反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)親和試劑應(yīng)當(dāng)對(duì)活性部位專(zhuān)一性結(jié)合

蛋白質(zhì)的正常配位體、底物和抑制劑的結(jié)構(gòu)都可以作為設(shè)計(jì)親和試劑的參考。親和標(biāo)記設(shè)計(jì)要滿(mǎn)足兩個(gè)條件：61第9章蛋白質(zhì)工程課件62光親和試劑是一類(lèi)特殊的親和試劑它在結(jié)構(gòu)上除了有一般親和試劑的特點(diǎn)外，還具有一個(gè)光反應(yīng)基團(tuán)。先與酶活性部位在暗條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后被光照激活后，產(chǎn)生一個(gè)活潑的功能基團(tuán)，能與它們附近基團(tuán)反應(yīng)，形成一個(gè)共價(jià)的標(biāo)記物。光親和試劑6364564酶分子化學(xué)修飾的應(yīng)用

活性中心的研究化學(xué)修飾法、X-光晶體衍射法、核磁共振。酶的空間結(jié)構(gòu)研究

采用具有熒光特性的修飾劑，可借助熒光光譜研究，分析各基團(tuán)在酶分子中的空間分布情況。采用巰基修飾劑，可了解酶分子中半胱氨酸的數(shù)目及分布情況，確定肽鏈的數(shù)目和二硫鍵的數(shù)目。酶的作用機(jī)制研究

了解各種殘基及側(cè)鏈基團(tuán)在酶催化過(guò)程中的作用。

酶分子化學(xué)修飾的應(yīng)用活性中心的研究65二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用66例：大分子修飾提高超氧物歧化酶的穩(wěn)定性該酶能保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜，使它們免遭超氧負(fù)離子的破壞例：大分子修飾提高超氧物歧化酶的穩(wěn)定性該酶能保護(hù)DNA、蛋白673.應(yīng)用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血類(lèi)蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）PEG－天門(mén)冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、過(guò)氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。3.應(yīng)用：68化學(xué)修飾方法的局限性擴(kuò)散速度受限生物活性降低修飾劑呈現(xiàn)多種聚合度，選擇性不高化學(xué)修飾方法的局限性擴(kuò)散速度受限69提高酶性能的方法：1）從自然界篩選或誘導(dǎo)變異具有不同性質(zhì)的突變體

不能保證在獲得一種有利的突變時(shí)不會(huì)損害另一優(yōu)良性能。2）蛋白質(zhì)化學(xué)修飾

不夠?qū)Ｒ?，?duì)分子內(nèi)部的一些疏水氨基酸的側(cè)鏈也無(wú)法予以修飾。3）化學(xué)合成

對(duì)于分子量大于1萬(wàn)道爾頓的蛋白質(zhì)，從經(jīng)濟(jì)和技術(shù)上不能滿(mǎn)足工業(yè)用酶或蛋白質(zhì)的要求。第九章酶的蛋白質(zhì)工程提高酶性能的方法：第九章酶的蛋白質(zhì)工程70途徑方法優(yōu)點(diǎn)不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)蛋白質(zhì)水平化學(xué)修飾適應(yīng)所有酶，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)修飾過(guò)程破壞酶分子劑型固定化適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良穩(wěn)定劑簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)工作量大反應(yīng)介質(zhì)適用于特殊反應(yīng)體系和酶類(lèi)適合的酶類(lèi)還不普遍途徑方法優(yōu)點(diǎn)不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分71一、蛋白質(zhì)工程概念：根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其功能的關(guān)系，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以生產(chǎn)出性能更加優(yōu)良的新型酶分子。是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造。一、蛋白質(zhì)工程概念：72基因工程與蛋白質(zhì)工程：

基因工程指用人為的方法將所需要的某一供體生物的DNA提取出來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下用適當(dāng)?shù)拿盖懈詈螅阉c載體DNA分子連接起來(lái)形成具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子，并將它轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)?；蚬こ炭梢允乖谌祟?lèi)控制的條件下生產(chǎn)任何自然界中已存在的蛋白質(zhì)以滿(mǎn)足人類(lèi)的需要。蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)可使人類(lèi)可以生產(chǎn)自然界根本不存在的,但其性質(zhì)又是人類(lèi)所期望的新型蛋白質(zhì)。因此蛋白質(zhì)工程又稱(chēng)為第二代基因工程。

基因工程與蛋白質(zhì)工程：基因工程指用人為的方法將所需要的某73第9章蛋白質(zhì)工程課件74第9章蛋白質(zhì)工程課件75第9章蛋白質(zhì)工程課件76二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其所含的氨基酸序列,而氨基酸的序列又由其編碼基因的核苷酸序列所決定。因此按預(yù)定方案通過(guò)對(duì)編碼該蛋白質(zhì)基因的改造應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以獲得新型的蛋白質(zhì)分子。二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)77蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：直接法：直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來(lái)推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：X-射線(xiàn)晶體衍射——研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定78

X-射線(xiàn)衍射技術(shù)：用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。X-射線(xiàn)衍射技術(shù)：79三、蛋白質(zhì)工程的主要手段蛋白質(zhì)工程的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)是創(chuàng)造人類(lèi)所需要的各種性能優(yōu)越的人造蛋白質(zhì)。但目前主要是通過(guò)基因突變手段以制取天然蛋白質(zhì)的各種人工突變產(chǎn)物。

以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。位點(diǎn)特異性突變—基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)基因突變隨機(jī)突變——基于高通量篩選法基因內(nèi)部的剪接基因剪接5‘或3’端的剪接三、蛋白質(zhì)工程的主要手段80定點(diǎn)誘變(site-directedmutagenesis)在體外使DNA分子內(nèi)部的特異部位發(fā)生突變的過(guò)程。最常用的方法是合成一條序列有變異的寡核苷酸，使其與靶DNA分子雜交/退火，再合成完整的DNA。定點(diǎn)誘變(site-directedmutagenesi81定點(diǎn)突變的方法定點(diǎn)突變的方法82產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法：化學(xué)誘變，錯(cuò)摻誘變，盒式誘變。高通量篩選法：從巨大數(shù)目的突變體庫(kù)中篩選到具有期望功能的突變體。篩選方法：表型觀察篩選，當(dāng)篩選的蛋白可以產(chǎn)生可見(jiàn)信號(hào)時(shí)，用簡(jiǎn)單的表型觀察和篩選被廣泛應(yīng)用。

目前，蛋白質(zhì)突變體庫(kù)篩選一般是固態(tài)（瓊脂糖和濾膜）或者液態(tài)（微量滴定孔板）條件下通過(guò)表型選擇和篩選而完成的。高通量篩選蛋白質(zhì)突變體庫(kù)的方法：噬菌體展示技術(shù)（phagedisplay)。產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法：83適用范圍：抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物的開(kāi)發(fā)研究方面適用范圍：抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物的開(kāi)發(fā)84第9章蛋白質(zhì)工程課件85第9章蛋白質(zhì)工程課件86基因內(nèi)部剪接在編碼基因的內(nèi)部插入或剪去特定的序列、結(jié)構(gòu)原件或結(jié)構(gòu)域。5’或3’端的剪接融合基因可以用于在體外產(chǎn)生不同基因或基因片段之間的融合，產(chǎn)生融合蛋白。避免目的蛋白在表達(dá)時(shí)被降解增加分泌性（信號(hào)肽）提高溶解性（硫氧化還原蛋白）基因內(nèi)部剪接87重組酶的高效表達(dá)

一、細(xì)菌表達(dá)體系

二、酵母系統(tǒng)中的表達(dá)

三、絲狀真菌中的表達(dá)

重組酶的高效表達(dá)

881.用大腸桿菌表達(dá)體系生產(chǎn)重組酶常用宿主菌株的基因型DH5：supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1JM109:supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1

?(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZ?M151.用大腸桿菌表達(dá)常用宿主菌株的基因型89大腸桿菌表達(dá)載體必備元件：大腸桿菌表達(dá)載體必備元件：90

目前在原核系統(tǒng)中使用得最普遍的強(qiáng)啟動(dòng)子主要有5個(gè)：①大腸桿菌的lac啟動(dòng)子：②大腸桿菌的trp操縱子的啟動(dòng)子：③將lac啟動(dòng)子的一10區(qū)和trp啟動(dòng)子的一35區(qū)融合起來(lái)的tac啟動(dòng)子；④T7噬菌體中基因10的啟動(dòng)子；⑤l噬菌體中的左向啟動(dòng)子PL。這些啟動(dòng)子都是通過(guò)和阻遏蛋白的相互作用，來(lái)控制基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和停止的。

目前在原核系統(tǒng)中使用得最普遍的強(qiáng)啟動(dòng)子主要有5個(gè)：91

lac/tac/trc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控Plac+1rbsFG Terminator

mRNAIPTG阻遏蛋白

lac/tac/trc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控Plac+192二、酵母表達(dá)系統(tǒng)例1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是重要的醫(yī)用酶。大腸桿菌表達(dá)體系能將N端的甲硫氨酸除去，但不能將第二個(gè)氨基酸(Ala)乙酰化。需用真核系統(tǒng)表達(dá)！

基因源：人的Cu/Zn-SODcDNA基因 質(zhì)粒載體：釀酒酵母2mm質(zhì)粒 啟動(dòng)子：酵母甘油醛磷酸脫氫酶(GAPD)啟動(dòng)子 附加：轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、poly(A)信號(hào)。 宿主細(xì)胞：Leu缺陷型的釀酒酵母。二、酵母表達(dá)系統(tǒng)例1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Z93釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒94釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：表達(dá)水平偏低表達(dá)質(zhì)粒易丟失重組蛋白常發(fā)生超糖基化分泌效率差釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：95嗜甲醇的酵母(Pichiapastoris)優(yōu)點(diǎn)：能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)。

乙醇氧化酶基因aoxl的啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，甲醇誘導(dǎo)時(shí)，酶產(chǎn)量可達(dá)總蛋白的30％。

畢赤酵母載體包括自主復(fù)制的游離載體和整合型載體，由于沒(méi)有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型質(zhì)粒作為外源基因的表達(dá)載體。 宿主細(xì)胞為組氨酸脫氫酶缺陷型(HIS4一)嗜甲醇的酵母(Pichiapastoris)優(yōu)點(diǎn)：96第9章蛋白質(zhì)工程課件97牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表達(dá)

牛溶菌酶作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，具有抗蛋白酶的功能?？捎米鳛榇龠M(jìn)反芻動(dòng)物消化的飼料添加劑。 牛溶菌酶前體經(jīng)P．pastoris正確修飾后分泌到培養(yǎng)基中，分泌的蛋白與天然溶菌酶活性相當(dāng)，在10L發(fā)酵罐發(fā)酵200h，產(chǎn)量達(dá)2g/L。第9章蛋白質(zhì)工程課件98絲狀真菌牛溶菌酶基因表達(dá)質(zhì)粒牛溶菌酶基因表達(dá)質(zhì)粒99三、絲狀真菌表達(dá)體系得到發(fā)展主要理由是?絲狀真菌的發(fā)酵技術(shù)成熟，有利于重組蛋白生產(chǎn) 的工業(yè)化；?絲狀真菌具有很強(qiáng)的分泌能力，有望提高重組蛋 白的生產(chǎn)效率；?新表達(dá)系統(tǒng)的建立可避開(kāi)大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白 的專(zhuān)利限制；?米曲霉和黑曲霉等絲狀真菌被FDA和世衛(wèi)組織認(rèn) 定安全。三、絲狀真菌表達(dá)體系得到發(fā)展主要理由是100質(zhì)粒載體元件質(zhì)粒載體元件101在絲狀真菌中的選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)標(biāo)記：ade(腺嘌呤)、trp等很多。優(yōu)點(diǎn)：載體質(zhì)粒可進(jìn)行同源整合，易于篩選；缺點(diǎn)：大多數(shù)絲狀真菌難獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型。b.顯性標(biāo)記：包括藥物抗性標(biāo)記，如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌靈抗性等c.細(xì)菌的報(bào)告基因：在絲狀真菌啟動(dòng)子帶動(dòng)下的表達(dá)，也可作為選擇標(biāo)記，如GUS等。在絲狀真菌中的選擇標(biāo)記：102表達(dá)水平： 與多種因素有關(guān)，包括選用的啟動(dòng)子及其他調(diào)控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷貝數(shù)和受體菌株等。穩(wěn)定性： 轉(zhuǎn)化子在有絲分裂過(guò)程中，多數(shù)經(jīng)過(guò)幾十代的有絲分裂。但經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂表現(xiàn)出高度的不穩(wěn)定。表達(dá)水平：103第三節(jié)蛋白質(zhì)工程成果及應(yīng)用

一.蛋白質(zhì)工程的成果在十幾年里,蛋白質(zhì)工程已取得鼓舞人心成果。

1.基礎(chǔ)研究方面:酪氨酰tRNA合成酶是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究得比較深入的酶之一。該酶在ATP存在的條件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸轉(zhuǎn)移到tRNA的3'末端形成酪氨酰tRNA。第三節(jié)蛋白質(zhì)工程成果及應(yīng)用一.蛋白質(zhì)工程的成果104

研究表明該酶與其底物之間能形成11對(duì)氫鍵,其中8對(duì)氫鍵的形成來(lái)源于酶的氨基酸側(cè)鏈。1989年,Eersht等人應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)這8個(gè)側(cè)鏈殘基進(jìn)行系統(tǒng)突變以揭示側(cè)鏈在整個(gè)酶促反應(yīng)中的作用以及對(duì)決定酶與底物結(jié)合專(zhuān)一性方面的影響。他們還發(fā)現(xiàn)酶與過(guò)渡態(tài)分子的結(jié)合力可直接影響酶促反應(yīng)的速度。研究表明該酶與其底物之間能形成11對(duì)氫鍵,其中8對(duì)氫105枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)工程枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)工程106

洗衣粉中對(duì)酶的穩(wěn)定性有影響因素：表面活性劑：破壞酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)漂白劑：化學(xué)氧化洗衣粉中對(duì)酶的穩(wěn)定性有影響因素：107抗氧化性結(jié)果是Ala222抗氧化性最強(qiáng)抗氧化性結(jié)果是Ala222抗氧化性最強(qiáng)108應(yīng)用蛋白質(zhì)工程已取得的研究成果實(shí)例

─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────誘變蛋白質(zhì)

氨基酸突變

原定目標(biāo)

結(jié)果─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────T4溶菌酶Ile→Cys構(gòu)建二硫鍵

成功增加熱穩(wěn)定性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────枯草桿菌Gly→Lys拓寬酶作用的成功蛋白酶底物范圍Ala→Leu提高抗氧化性能────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────α-抗凝酶Met→Val提高抗氧化性能

成功應(yīng)用蛋白質(zhì)工程已取得的研究成果實(shí)例109─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────胰蛋白酶Gly→Ala提高酶水解專(zhuān)一性

成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-內(nèi)酰胺酶Ser→Cys驗(yàn)證Ser對(duì)該酶成功的重要性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-干擾素Cys→Ser提高穩(wěn)定性

成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────白細(xì)胞介素-2Cys→Ser