基因工程和基因組學(xué)課件

第九章基因工程和基因組學(xué)第九章基因工程11971年，Smith等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時(shí)代的開(kāi)始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來(lái)

得到新的DNA分子。1971年，Smith等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶，酶切21973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Cohen教授及其同事把抗四環(huán)素基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA后，組成一個(gè)重組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一個(gè)重組DNA能在大腸桿菌中復(fù)制,并具有抗四環(huán)素遺傳表型。StanleyN.Cohen1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Cohen教授及其同事把抗31974年,Cohen教授和加州大學(xué)的Boyer教授，將非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因得到表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，經(jīng)DNA重組后的外源基因可在宿主體內(nèi)成功表達(dá)。HerbertW.Boyer1974年,Cohen教授和加州大學(xué)的Boyer教授，將非洲41982年，美國(guó)食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場(chǎng)。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。1982年，美國(guó)食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基1985年，轉(zhuǎn)5以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的2550萬(wàn)畝發(fā)展到2009年的20億畝，14年間增長(zhǎng)了79倍。19961997199819992000200120022006200720082009以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由16廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程及酶工程等。狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術(shù))。

一、基因工程概述:第一節(jié)基因工程廣義遺傳工程包括:狹義遺傳工程是指:一、基因工程概述:第一7１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式,按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，借助于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去，使后者定向獲得新遺傳性狀的一門(mén)技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的建立，使所有實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的變革。基因工程是采用分子生物學(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來(lái)的綜合技術(shù)。

１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式,按照預(yù)先8切接轉(zhuǎn)增檢2．基因工程操作過(guò)程：切接轉(zhuǎn)增檢2．基因工程操作過(guò)程：93．內(nèi)容：①?gòu)募?xì)胞和組織中分離DNA；②限制性?xún)?nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③

將酶切DNA分子與載體DNA連接構(gòu)建能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的重組DNA分子；④

把重組DNA分子引入宿主受體細(xì)胞復(fù)制；⑤

重組DNA隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞建立無(wú)性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個(gè)體；⑥

從宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子；⑦

使外源基因在受體細(xì)胞中正常表達(dá)，翻譯成蛋白質(zhì)并分離、鑒定基因產(chǎn)物。目的基因載體轉(zhuǎn)化與鑒定內(nèi)切酶重組DNA表達(dá)3．內(nèi)容：①?gòu)募?xì)胞和組織中分離DNA；②限制性?xún)?nèi)切酶酶切10一般而言，一個(gè)基因是編碼一條多肽鏈的一個(gè)DNA片段，包括啟動(dòng)子、終止子及內(nèi)含子等。在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細(xì)胞中最難分析的大分子。DNA重組技術(shù)發(fā)展成功之后，DNA已成為細(xì)胞中最易操作分析的大分子。二、基因的分離與鑒定利用這一技術(shù)，可從一個(gè)含有10萬(wàn)個(gè)基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個(gè)目的基因。一般而言，一個(gè)基因是編碼一條多肽鏈的在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)11㈠從基因庫(kù)中分離基因：1.構(gòu)建基因庫(kù)（library）基因庫(kù)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。根據(jù)克隆核酸序列、來(lái)源，基因庫(kù)可分為：核基因庫(kù)、染色體庫(kù)、cDNA庫(kù)、線(xiàn)粒體庫(kù)等。㈠從基因庫(kù)中分離基因：1.構(gòu)建基因庫(kù)（library）基因12①核基因庫(kù)：核基因庫(kù)(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。理想的核基因庫(kù)應(yīng)能包括全部基因組序列。①核基因庫(kù)：核基因庫(kù)(genomiclibrary)：13構(gòu)建文庫(kù)可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，收集所有菌落。噬菌體或(柯斯質(zhì)粒)載體：重組DNA包裝進(jìn)噬菌體，感染細(xì)菌，收集噬菌斑。BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體，導(dǎo)入相應(yīng)宿主細(xì)胞，收集所有細(xì)胞，即為基因庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)可采用不同的載體：質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞14第09章基因工程和基因組學(xué)課件15第09章基因工程和基因組學(xué)課件16②染色體基因庫(kù)：將基因組的一部分如一條染色體用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)可選擇特異基因以及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織。②染色體基因庫(kù)：將基因組的一部分如一條染色體用來(lái)構(gòu)17果蠅的多線(xiàn)染色體中，對(duì)染色體進(jìn)行微切割，構(gòu)建染色體區(qū)段基因文庫(kù)。如對(duì)X染色體上多線(xiàn)染色體帶的分析。果蠅的多線(xiàn)染色體中，對(duì)染色體進(jìn)行微切割，18人類(lèi)基因組項(xiàng)目研究中，利用流動(dòng)細(xì)胞分離(flowcytometry)技術(shù)將人類(lèi)染色體分開(kāi)，用于構(gòu)建單個(gè)染色體基因庫(kù)，大大加速了人類(lèi)基因組作圖和分析。流式細(xì)胞分離原理人類(lèi)基因組項(xiàng)目研究中，流式細(xì)胞分離原理19酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldgelelectro–phoresis,PFGE)，將酵母菌16根染色體據(jù)其分子量大小分開(kāi)后，用于構(gòu)建染色體庫(kù)，在基因組分析中發(fā)揮作用。酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldg20③cDNA庫(kù)：以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因庫(kù)。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T為引物與多聚A互補(bǔ)配對(duì)，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，即可獲得cDNA第一鏈。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補(bǔ)齊后以帶有限制性酶切點(diǎn)的人工接頭連接酶切后與載體(通常是噬菌體)連接制備cDNA庫(kù)。③cDNA庫(kù)：以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA21mRNA1.cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPsmRNA1.cDNA第一鏈的合成5‘ppp’5GGAA222.cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’2.cDNA第二鏈的合成煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈23DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈24dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPsdCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的525

cDNA庫(kù)與核DNA庫(kù)不同：cDNA庫(kù)僅具有細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)基因的mRNA序列僅包括基因組的部分基因序列。

cDNA庫(kù)對(duì)于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。

通常是將cDNA庫(kù)與核基因庫(kù)配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。cDNA庫(kù)與核DNA庫(kù)不同：cDNA庫(kù)僅具有細(xì)胞或組織內(nèi)表262.篩選基因庫(kù)：根據(jù)待選基因相關(guān)信息

確定篩選方法和條件從基因庫(kù)中篩選、分離基因；常用的基因庫(kù)篩選方法有表型篩選法、雜交篩選法、混合池PCR篩選法、差減雜交法、圖位克隆法、酵母雙雜交法等；多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針篩選基因庫(kù)。2.篩選基因庫(kù)：根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條常27密集鋪板（1-10萬(wàn)）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆文庫(kù)篩選流程密集鋪板（1-10萬(wàn)）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆文庫(kù)篩選流28篩庫(kù)過(guò)程：將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后菌落印影在濾膜上用堿裂解、中和后洗滌烘干再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影凡黑點(diǎn)菌落即為陽(yáng)性克隆。影印洗滌雜交感光篩庫(kù)過(guò)程：將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后菌落印影在濾膜上用堿裂解、中和后洗29①.限制性酶圖譜：構(gòu)建陽(yáng)性克隆的限制性酶圖譜

根據(jù)同源性分析，可了解陽(yáng)性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對(duì)位置

用于進(jìn)一步亞克隆或同已知的其它序列比較。(二)陽(yáng)性克隆的分析與鑒定：從基因庫(kù)中篩選出的陽(yáng)性克隆

分析、鑒定

得到目的基因。①.限制性酶圖譜：構(gòu)建陽(yáng)性克隆的限制性酶圖譜根據(jù)同源30限制性酶圖譜構(gòu)建方法(15kb)將陽(yáng)性克隆DNA分裝3個(gè)管中酶切DNA瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色紫外燈下見(jiàn)到DNA帶。

從凝膠電泳結(jié)果分析：模式Ⅱ就是這個(gè)15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜。限制性酶圖譜構(gòu)建方法(15kb)將陽(yáng)性克隆DNA分裝3個(gè)管中31用類(lèi)似的方法，將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長(zhǎng)度的多型性來(lái)分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標(biāo)記進(jìn)行基因組圖譜分析。用類(lèi)似的方法，將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型32②.核酸分子雜交：Southern雜交分析：由英國(guó)的Southern發(fā)明(1975)，一種將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜進(jìn)行DNA分子雜交分析的方法。篩選基因庫(kù)得到陽(yáng)性克隆后將限制性酶酶切與Southern雜交結(jié)合繪制限制性酶圖譜。②.核酸分子雜交：Southern雜交分析：由英國(guó)的Sou33Northern雜交分析：用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，檢測(cè)mRNA的存在。原理和程序與Sorthern雜交相同。Western雜交分析：用于蛋白質(zhì)的分析。Northern雜交分析：用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織34③.核酸序列測(cè)定克隆后的DNA片段進(jìn)行核酸序列測(cè)定后確定該DNA片段序列的正確性。一般采用Sanger(1977)發(fā)明的雙脫氧核糖核酸終止法測(cè)定核酸序列。CGCTCAGCTGGTGATTGTGT③.核酸序列測(cè)定克隆后的DNA片段進(jìn)行核酸序列測(cè)定后確定該3555333-5磷酸二酯鍵55333-5磷酸二酯鍵36在Sanger雙脫氧法中，可用熒光標(biāo)記來(lái)代替放射性標(biāo)記：在Sanger雙脫氧法中，可用熒光標(biāo)記來(lái)代替放射性標(biāo)記：37④.核酸序列分析：測(cè)定的核酸序列為何基因、有什么功能，需用計(jì)算機(jī)軟件或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。④.核酸序列分析：測(cè)定的核酸序列為何基因、有什么功能，需38（1）同源性比較將待測(cè)序列在核酸和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上比較基因間的同源性，將序列發(fā)送到Genbank等DNAData數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。（1）同源性比較39第09章基因工程和基因組學(xué)課件40第09章基因工程和基因組學(xué)課件41第09章基因工程和基因組學(xué)課件42第09章基因工程和基因組學(xué)課件43第09章基因工程和基因組學(xué)課件44

對(duì)于那些同已知序列無(wú)任何同源性的新序列，可能還要進(jìn)行基因功能性研究。一個(gè)ORF是一條能編碼一條多肽鏈的DNA序列，具有翻譯起始信號(hào)和終止信號(hào)等。（2）分析核酸序列的閱讀框架

對(duì)于那些同已知序列無(wú)任何同源性的新序一個(gè)ORF是一條能編碼45

GmMYBZ2ORF：744bp247aaMYB-DNAbinding1:13-63aaMYB-DNAbinding2:65-114aa具有轉(zhuǎn)錄抑制作用的保守基序：pdLNLD/ELXiG/S

GmMYBZ2ORF：46

GmMYBZ2空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（CHPmodels-2.0服務(wù)器）GmMYBZ2蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)紅色：a-螺旋；藍(lán)色：b-折疊；白色：無(wú)規(guī)卷曲

GmMYBZ2空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（CHPmodels-2.0服47（三）PCR擴(kuò)增基因：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainReaction,PCR)可以體外快速擴(kuò)增DNA。美國(guó)Mullis(1986)發(fā)明，是現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的一個(gè)里程碑。PCR技術(shù)是以DNA互補(bǔ)鏈的聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)DNA變性、引物與模板DNA一側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性雜交，由DNA聚合酶催化引物延伸，最終獲得特異DNA片段的體外擴(kuò)增方法。（三）PCR擴(kuò)增基因：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase48DNA模板變性退火延伸循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2RF1324DNA模板變性退火延伸循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2RF132449變性退火延伸循環(huán)31234變性退火延伸循環(huán)3123450基本要素模板：待拷貝的DNA,可以是雙鏈,也可是單鏈DNA；引物：引導(dǎo)DNA的合成。在PCR擴(kuò)增中一般使用合成的寡核苷酸作引物；DNA聚合酶：DNA復(fù)制的動(dòng)力，在dNTP等底物存在時(shí)在引物的引導(dǎo)下沿著模板DNA合成互補(bǔ)的DNA鏈。dNTP：DNA合成的底物。使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。基本要素模板：待拷貝的DNA,可以是雙鏈,也可是單鏈DNA；51（四）人工合成基因：根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來(lái)可很快地人工合成基因。如SOE-PCR(splicingbyusingoverlappedextension)技術(shù)可擴(kuò)增出完整的基因序列。（四）人工合成基因：根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成如52化學(xué)合成的寡聚核苷酸(80-100個(gè)核苷酸)通過(guò)SOE將單鏈部分補(bǔ)齊；2.PCR擴(kuò)增DNA片段；3.DNA變性；4.兩個(gè)單鏈部分經(jīng)SOE補(bǔ)齊

雙鏈；5.PCR擴(kuò)增DNA，利用多級(jí)SOE-PCR擴(kuò)增出完整的基因。化學(xué)合成的寡聚核苷酸2.PCR擴(kuò)增DNA片段；3.DNA531.限制性?xún)?nèi)切酶(restrictionenzyme)：一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中一段特定的核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。

三、限制性?xún)?nèi)切核酸酶1.限制性?xún)?nèi)切酶(restrictionenzyme)：三542.限制性?xún)?nèi)切酶的命名：用屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母，組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名稱(chēng);如：大腸桿菌(Escherichiacoli)

用Eco表示；流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)

用Hin表示。用一個(gè)寫(xiě)在右下方的字母代表菌株或類(lèi)型；如EcoK，Hind。用羅馬數(shù)字表示不同的限制和修飾體系，如：HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等。2.限制性?xún)?nèi)切酶的命名：用屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母553.限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)別：第Ⅰ類(lèi)酶:每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒(méi)有序列特異性,酶切位點(diǎn)不定。

第Ⅱ類(lèi)酶:能識(shí)別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅲ類(lèi)酶:能識(shí)別位點(diǎn)分別是AGACC和CAGCAG,切割位點(diǎn)則在下游24-26bp處。3.限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)別：第Ⅰ類(lèi)酶:每隔一段DNA序列隨機(jī)切割564.第Ⅱ類(lèi)核酸內(nèi)切酶特性：在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂；靶序列：具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的回文序列；ABCC′B′A′ABCC′B′A′ABNB′ABN′B′A′A′回文序列(palindrome)：從兩個(gè)方向閱讀而序列相同的序列。4.第Ⅱ類(lèi)核酸內(nèi)切酶特性：在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部57對(duì)靶序列的切割：(1)

產(chǎn)生平末端(bluntend)的切割如SmaⅠ：兩條鏈上的斷裂位置處于一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的中心。對(duì)靶序列的切割：(1)產(chǎn)生平末端(bluntend)的切58(2)產(chǎn)生粘性末端(stickyend)的切割兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)的、但又是對(duì)稱(chēng)地圍繞一個(gè)對(duì)稱(chēng)軸排列。如EcoRⅠ：粘性末端:

DNA分子在限制性?xún)?nèi)切酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)。(2)產(chǎn)生粘性末端(stickyend)的切割兩條鏈上的斷59第09章基因工程和基因組學(xué)課件60同裂酶:來(lái)源不同但可識(shí)別相同核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割并形成同樣末端的限制酶。如HpaⅡ和MspⅠ均可識(shí)別CCGG。同尾酶:來(lái)源不同，識(shí)別的靶序列也各不相同，但都能產(chǎn)生同樣粘性末端的限制酶。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCA同裂酶:來(lái)源不同但可識(shí)別相同核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割并形61載體：將“目的”基因?qū)胧荏w細(xì)胞的運(yùn)載工具。

DNA片段與適合的載體DNA連接構(gòu)成重組DNA在載體DNA的運(yùn)載下，高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行復(fù)制。DNA載體：質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒DNA、細(xì)菌或酵母菌人工染色體等。四、載體（vector）：載體：將“目的”基因?qū)胧荏w細(xì)胞的運(yùn)載工具。DNA片62載體的條件：①具有復(fù)制原點(diǎn)，能自我復(fù)制；②具有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite，MCS)即有多種限制酶的切點(diǎn)；③具有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因；④易從宿主細(xì)胞中回收。載體的條件：①具有復(fù)制原點(diǎn)，能自我復(fù)制；②具有多克隆位63（一）細(xì)菌質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒具有重組表型檢測(cè)標(biāo)記，檢測(cè)是否攜帶外源DNA片段。在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制程度：嚴(yán)緊型：一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)量有1-2個(gè)；

松馳型：每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有的20-60個(gè)。（一）細(xì)菌質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存質(zhì)64pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：③多克隆位點(diǎn)中的酶切位點(diǎn)多，克隆方便；④具有a－互補(bǔ)的顯色表型，用于檢測(cè)重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記。①分子量小，可接受較大外源片段(10Kb)；②拷貝數(shù)多，每個(gè)細(xì)胞中有500個(gè)；pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：③多克隆位點(diǎn)中的酶切位點(diǎn)④具65a-互補(bǔ)：指來(lái)自細(xì)菌DNA的b-半乳糖苷酶(lacZ)N端的一段氨基酸殘基(a-肽)，在與a-肽缺失的b-半乳糖苷酶混合后，能夠回復(fù)lacZ酶活性的一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象。a-互補(bǔ)：指來(lái)自細(xì)菌DNA的b-半乳糖苷酶(lacZ)N端的66基因組全長(zhǎng)49kb。噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。中間基因簇可被外源DNA替代而不影響浸染細(xì)菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作為cDNA或核DNA克隆的載體。（二）λ噬菌體(溫和型)：基因組全長(zhǎng)49kb。噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因67

優(yōu)點(diǎn)：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基因進(jìn)入細(xì)胞并增殖；1.攜帶大片段外源DNA分子，可占用總量的25%時(shí)仍不失活。優(yōu)點(diǎn)：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基1.攜帶大片段68（三）柯斯質(zhì)粒(cosmid)：部分λ噬菌體DNA+部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建柯斯質(zhì)粒。帶有噬菌體cos序列和細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)、抗生素抗性標(biāo)記。（三）柯斯質(zhì)粒(cosmid)：部分λ噬菌體DNA+部分帶有69這種質(zhì)粒分子量較小，但可接受長(zhǎng)達(dá)50kb的外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用?！咭粋€(gè)長(zhǎng)片段DNA可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。這種質(zhì)粒分子量較小，但可接受長(zhǎng)達(dá)50kb的∵一個(gè)長(zhǎng)片段DNA70（四）細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC載體可以攜帶大于50kb的外源DNA片段。

特點(diǎn)：帶有外源DNA的BAC載體在細(xì)胞中是單拷貝的；載體本身分子量很小(7.4kb)；選擇標(biāo)記：氯霉素抗性基因；

多克隆位點(diǎn)位于lacZ基因內(nèi)。F因子經(jīng)基因工程改造成BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。（四）細(xì)菌人工染色體(bacterialartifici71（五）酵母人工染色體(YAC)：YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)和可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因；還具有酵母菌染色體一些特點(diǎn)；可接受100-1000kb的外源DNA片段。YAC已成為人類(lèi)基因組計(jì)劃和圖位克隆基因的重要工具；并促進(jìn)了人類(lèi)人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。1996年完成了酵母菌全基因組序列的測(cè)定（五）酵母人工染色體(YAC)：YAC具有自主復(fù)制序列、克72指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。如能在原核生物（如E.coli）、真核細(xì)胞（如酵母）中復(fù)制的載體。穿梭載體需同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)、真核生物自主復(fù)制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及兩者的選擇標(biāo)記。（六）穿梭載體(shuttlevectors):指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。如能在原核生物（如E.co73穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。

酵母菌的YEp(yeastepisomaplasmid)和YRp系列載體均是穿梭載體。穿梭質(zhì)粒YEp24穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分74

pCAMBIA2301載體pCAMBIA2301載體75第09章基因工程和基因組學(xué)課件76（七）Ti質(zhì)粒及其衍生載體：適合于植物的載體系統(tǒng)將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞并使目的基因表達(dá)。Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌(革蘭氏陰性菌)(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞中可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞(tumor-Inducing

Ti)

冠癭瘤(growngalltumors)。（七）Ti質(zhì)粒及其衍生載體：適合于植物的載體系統(tǒng)將重組DN77Ti質(zhì)粒一部分DNA叫轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA，T-DNA)，當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，T-DNA便轉(zhuǎn)移到植物的染色體上，誘導(dǎo)冠癭瘤，并能合成冠癭堿(opine),作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源。農(nóng)桿菌感染產(chǎn)生冠纓瘤Ti質(zhì)粒一部分DNA叫轉(zhuǎn)移DNA農(nóng)桿菌感染產(chǎn)生冠纓瘤78第09章基因工程和基因組學(xué)課件79第09章基因工程和基因組學(xué)課件80第09章基因工程和基因組學(xué)課件81目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破?；蚬こ碳夹g(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域，為人類(lèi)創(chuàng)造了巨大的財(cái)富。五、基因工程的應(yīng)用具有生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因鼠目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系五、基因工程的82㈠基因工程工業(yè)

最早應(yīng)用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細(xì)菌中表達(dá)人的胰島素(1982)。

胰島素是一種控制糖代謝的蛋白質(zhì)激素。不能產(chǎn)生胰島素的患者會(huì)有糖尿病，患者必須每天注射胰島素。

現(xiàn)已在細(xì)菌中生產(chǎn)10多種醫(yī)藥產(chǎn)品，如表皮生長(zhǎng)因子、人生長(zhǎng)激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。㈠基因工程工業(yè)最早應(yīng)用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法83胰島素的人工生產(chǎn)胰島素的人工生產(chǎn)84

有些真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)需要糖基化等修飾加工以后才具有活性，而細(xì)菌細(xì)胞缺少真核細(xì)胞的這些修飾系統(tǒng)真核生物細(xì)胞更適合于表達(dá)真核生物蛋白質(zhì)基因。

目前，酵母菌、植物懸浮細(xì)胞、植株和動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞成功地均應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白。基因工程應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)人類(lèi)生長(zhǎng)激素有些真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)需要糖基化等修飾加工以后才具有活85（二）植物基因工程

植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞被內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的過(guò)程?；蜣D(zhuǎn)化的方法和技術(shù)（二）植物基因工程植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到86

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最多。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最多。871.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是應(yīng)用的最早最廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法（雙子葉植物、單子葉植物）。過(guò)程：將目的基因與啟動(dòng)子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子；插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒；再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細(xì)胞；將重組農(nóng)桿菌去感染植物細(xì)胞（組織）；使Ti質(zhì)粒的部分DNA（攜帶目的基因），整合到植物染色體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。1.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是應(yīng)用的最早88利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合成酶）基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克89基因槍法植物轉(zhuǎn)化是通過(guò)高壓氣體為動(dòng)力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒將目的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，并整合到染色體上的方法。2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)：轉(zhuǎn)化的載體多數(shù)是以pUC系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的。它們通常具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)及抗性選擇標(biāo)記，具有可在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子終止子及調(diào)控序列，以及植物抗性選擇標(biāo)記(如除草劑、潮霉素等抗性)。基因槍法植物轉(zhuǎn)化是通過(guò)高壓氣體為動(dòng)力，高2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)90

幾種基因槍類(lèi)型的共同特點(diǎn)：是用一種動(dòng)力系統(tǒng)將包被DNA的金屬微粒導(dǎo)入受體細(xì)胞或組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化。1.位于高壓氣體桶底部的爆破片；2.載有重組DNA和金屬微粒的微彈載體；3.阻攔網(wǎng)；

4.

包裹有重組DNA的金屬微粒；5.被轟擊樣品。幾種基因槍類(lèi)型的共同特點(diǎn)：是用一種動(dòng)力系統(tǒng)1.位于高壓氣91㈢轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展要慢些。這主要涉及到一些技術(shù)難題，以及倫理學(xué)、宗教等問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動(dòng)物受體細(xì)胞基因組中，從而形成在體表達(dá)外源基因的動(dòng)物，稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。㈢轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展要慢些。這92轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是如何獲得的呢？轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是如何獲得的呢？93受體細(xì)胞的準(zhǔn)備受精卵：注射促性腺激素，使動(dòng)物超數(shù)排卵，從而收集、獲得合適的受精卵；胚胎干細(xì)胞：從早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離獲得具有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性的細(xì)胞?；虻臏?zhǔn)備線(xiàn)形DNA或環(huán)形DNA均可，但線(xiàn)形DNA整合率要高于環(huán)形DNA；環(huán)形DNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)，使用于瞬時(shí)表達(dá)和基因治療。受體細(xì)胞的準(zhǔn)備受精卵：注射促性腺激素，使動(dòng)物超數(shù)排卵，從而收94基因的轉(zhuǎn)化利用顯微注射法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中；通過(guò)篩選基因篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至囊胚期；基因的轉(zhuǎn)化利用顯微注射法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法將目的基因95第09章基因工程和基因組學(xué)課件96胚胎移植胚胎移植：將供體的受精卵或早期胚胎，移植到同種的生理狀態(tài)相同的其他受體體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體的技術(shù)，也稱(chēng)作借腹懷胎。轉(zhuǎn)基因個(gè)體的鑒定對(duì)代孕母獸產(chǎn)下的幼獸進(jìn)行相關(guān)分子鑒定，首先，檢測(cè)目的基因是否整合到了受體的基因組中；其次，檢測(cè)目的基因是否表達(dá)；最后進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的分離純化及生物活性檢測(cè)。胚胎移植胚胎移植：將供體的受精卵或早期胚胎，移植到同種的生理97第09章基因工程和基因組學(xué)課件98卵細(xì)胞的獲得費(fèi)時(shí)費(fèi)力；很多人認(rèn)為，從胚胎中收集胚胎干細(xì)胞是不道德的，因?yàn)閯?dòng)物的生命沒(méi)有得到珍重，動(dòng)物的胚胎也是生命的一種形式，無(wú)論目的如何高尚，破壞胚胎是不可想象的；動(dòng)物的體細(xì)胞是否可以作為轉(zhuǎn)基因的受體細(xì)胞呢？卵細(xì)胞的獲得費(fèi)時(shí)費(fèi)力；很多人認(rèn)為，從胚胎中收集胚胎干細(xì)胞是不99生物學(xué)家一度認(rèn)為，由一個(gè)成熟的動(dòng)物細(xì)胞“無(wú)性繁殖”成一個(gè)子體是不可能的。1997年，克隆羊“多莉”的誕生，徹底打破了這種不可能性，并立即引起世界的震驚和媒體的關(guān)注。生物學(xué)家一度認(rèn)為，由一個(gè)成熟的動(dòng)物細(xì)胞“無(wú)性繁殖”成一個(gè)子體100克隆羊“多莉”的誕生300個(gè)277個(gè)29個(gè)1只克隆羊“多莉”的誕生300個(gè)277個(gè)29個(gè)1只101乳汁中含有α抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因羊各種克隆動(dòng)物相繼誕生乳汁中含有α抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因羊各種克隆動(dòng)物相繼誕生1021997年，夏威夷科學(xué)家從成年小老鼠的細(xì)胞復(fù)制出第一只克隆小老鼠，名叫Cumulina。Cumulina兩歲零七個(gè)月死亡,這是一個(gè)比較正常的死亡年齡，比普通老鼠的平均壽命長(zhǎng)7個(gè)月。它曾經(jīng)生產(chǎn)了兩次。1997年，夏威夷科學(xué)家從成年小老鼠的細(xì)胞復(fù)制出第一只克隆小1031998年日本科學(xué)家用子宮和輸卵管細(xì)胞成功克隆牛,首兩頭克隆牛分別名為“KAGA一號(hào)”和“NOTO一號(hào)”之后，日本復(fù)制出了數(shù)千克隆牛。出生于一九九八年八月的克隆?！癒AGA二號(hào)”產(chǎn)下了小牛。1998年日本科學(xué)家用子宮和輸卵管細(xì)胞成功克隆牛,首兩頭克隆104世界上第一批三只克隆山羊已由美國(guó)一家生物公司于1998年“制造”出來(lái)?？寺∩窖騇ira和她的姐妹們都來(lái)自美國(guó)的實(shí)驗(yàn)室，它們生產(chǎn)含有人類(lèi)抗凝血酶-3的羊奶?？鼓?3是血液天然含有的蛋白質(zhì)，其功能是協(xié)助控制血凝。世界上第一批三只克隆山羊已由美國(guó)一家生物公司于1998年“1052000年，科學(xué)家從兩頭分別死亡將近18小時(shí)和24小時(shí)的雌盤(pán)羊卵巢內(nèi)取出DNA，將其注入盤(pán)羊的“近親”――普通白羊的卵細(xì)胞內(nèi)，克隆出了一只摩弗倫羊（又稱(chēng)歐洲盤(pán)羊）。這是世界上首次把克隆技術(shù)應(yīng)用于一種瀕臨滅絕的哺乳類(lèi)動(dòng)物身上。2000年，科學(xué)家從兩頭分別死亡將近18小時(shí)和24小時(shí)的雌盤(pán)1062003年5月29日，一頭名叫“愛(ài)達(dá)荷寶石”的克隆騾子在美國(guó)愛(ài)達(dá)荷大學(xué)（UniversityofIdaho）與公眾見(jiàn)面2003年5月29日，一頭名叫“愛(ài)達(dá)荷寶石”的克隆騾子1072005年韓國(guó)科學(xué)家培育出世界首只克隆狗“斯納皮(Snuppy)”2005年韓國(guó)科學(xué)家培育出世界首只克隆狗“斯納皮(Snupp1082005年10月意大利著名的克雷莫納繁殖技術(shù)研究中心成功地克隆出了14只小豬仔2005年10月意大利著名的克雷莫納繁殖技術(shù)研究中心1092006年11月美國(guó)維亞金公司宣布成功克隆出純種賽馬“克萊頓”2006年11月美國(guó)維亞金公司宣布成功克隆出純種賽馬“克萊頓110我國(guó)體細(xì)胞克隆牛"康康"，在萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物胚胎工程中心我國(guó)體細(xì)胞克隆牛"康康"，在萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物胚胎工程中心111西北農(nóng)林科技大學(xué)克隆山羊西北農(nóng)林科技大學(xué)克隆山羊112山東曹縣五里墩中大動(dòng)物胚胎工程中心山東曹縣五里墩中大動(dòng)物胚胎工程中心113人類(lèi)生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因豬同胞鼠對(duì)照轉(zhuǎn)移有人類(lèi)生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因鼠人類(lèi)生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因豬同胞鼠對(duì)照轉(zhuǎn)移有人類(lèi)生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因鼠114轉(zhuǎn)基因熒光豬轉(zhuǎn)基因熒光豬115㈣遺傳疾病診斷：利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進(jìn)行診斷準(zhǔn)確度高，速度快。進(jìn)行產(chǎn)前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。㈣遺傳疾病診斷：利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳疾病診斷，是直接116b-球蛋白基因MstⅡ酶切結(jié)果b-球蛋白基因MstⅡ酶切結(jié)果117㈤基因治療：利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者的基因組中治療遺傳疾病，通常叫做基因治療(genetherapy)。方法：利用減毒的病毒DNA作載體(retrovirusDNA)構(gòu)建重組DNA分子用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細(xì)胞將正?；蛘系饺旧w上。㈤基因治療：利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系椒椒ǎ?18例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus載體，已用于治療嚴(yán)重綜合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脫氫酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起的，患者無(wú)任何免疫功能。例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retro1192000年法國(guó)Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的兩個(gè)嬰兒（8個(gè)月和11個(gè)月）。這一工作被認(rèn)為是20世紀(jì)人類(lèi)基因治療上的重大突破。方法：將ADA基因?qū)氲組LVretrovirus

載體中取代該病毒DNA中的三個(gè)結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env)將重組后的病毒去感染T細(xì)胞，使ADA基因整合到T細(xì)胞的染色體中實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。2000年法國(guó)Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的120核酸分子雜交的原理和方法+半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合發(fā)展形成的一門(mén)新技術(shù)。這一技術(shù)可使許多分子雜交反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。

DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龍等。㈥DNA芯片(DNAchips)核酸分子雜交的原理和方法+半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合DNA芯片的基片：121在面積不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地點(diǎn)陣排列于一定位置的、可尋址的核苷酸分子；將待分析核苷酸分子標(biāo)記(如用熒光)，變性成單鏈與芯片上序列相同的核苷酸分子雜交；與芯片上序列不同的核酸分子被洗掉；利用高精度的激光掃描儀記錄分子已雜交的熒光信號(hào)；計(jì)算機(jī)軟件分析。在面積不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格122基因多態(tài)性檢測(cè)（如單核苷酸多態(tài)性篩選

singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表達(dá)分析(不同細(xì)胞和不同組織的RNA群體比較)；

克隆選擇及文庫(kù)篩選（如cDNA文庫(kù)）；基因突變檢測(cè)及遺傳病和腫瘤的診斷等。DNA芯片技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：基因多態(tài)性檢測(cè)（如單核苷酸多態(tài)性篩選基因表達(dá)分析(不同細(xì)胞和123用基因芯片預(yù)測(cè)“未病之病”

通過(guò)基因芯片靈敏快速的檢測(cè)癌基因及正?；虻谋磉_(dá)變化,從而實(shí)現(xiàn)中國(guó)古語(yǔ)中“上醫(yī)治未病”的理想,對(duì)疾病作出前瞻性的診斷,這就是“基因診斷”用基因芯片預(yù)測(cè)“未病之病”通過(guò)基因芯片靈敏快速的檢測(cè)癌基因124第二節(jié)基因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)：研究生物基因組和如何利用基因的一門(mén)學(xué)問(wèn)。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物、醫(yī)學(xué)、和工業(yè)領(lǐng)域的重大問(wèn)題。第二節(jié)基因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)：研究生物基因組125研究對(duì)象：以整個(gè)基因組為研究單位，而不以單個(gè)基因?yàn)閱挝蛔鳛檠芯繉?duì)象。研究目標(biāo)：認(rèn)識(shí)基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化；

闡明整個(gè)基因組所包含的遺傳信息和相互關(guān)系；

充分利用有效資源，預(yù)防和治療人類(lèi)疾病。研究對(duì)象：以整個(gè)基因組為研究單位，而不以單個(gè)基因?yàn)檠芯磕繕?biāo)126重要組成部分：基因組計(jì)劃(genomeproject)大體上可分為：⒈構(gòu)建基因組的遺傳圖譜；⒉構(gòu)建基因組的物理圖譜；⒊測(cè)定基因組DNA的全部序列；⒋繪制基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；⒌分析基因組的功能。重要組成部分：基因組計(jì)劃(genomeproject)大體127基因組計(jì)劃研究開(kāi)始于1990年。

美國(guó)啟動(dòng)被譽(yù)為“人體阿波羅計(jì)劃”的“人類(lèi)基因組計(jì)劃”，投資30億美元，歷時(shí)15年測(cè)定人類(lèi)基因組的30億個(gè)核苷酸對(duì)的排列次序構(gòu)建高分辨率的人類(lèi)基因組遺傳圖譜和物理圖譜發(fā)展生物信息學(xué)。人類(lèi)基因組計(jì)劃基因組計(jì)劃研究開(kāi)始于1990年。美國(guó)啟動(dòng)被譽(yù)為“人體128在美國(guó)提出人類(lèi)基因組計(jì)劃后，日本和中國(guó)分別于1991年和1992年啟動(dòng)了“水稻基因組計(jì)劃”。在美國(guó)提出人類(lèi)基因組129由于以人類(lèi)為對(duì)象的研究實(shí)際上受到諸多限制，也受倫理學(xué)的約束，所以人類(lèi)基因組計(jì)劃還將對(duì)有關(guān)的模式生物，如酵母、線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥等進(jìn)行相應(yīng)的研究，為研究人類(lèi)基因組的戰(zhàn)略提供重要的依據(jù)。由于以人類(lèi)為對(duì)象的研究實(shí)際上受到諸多限1302002年4月5日《Science》以14頁(yè)的篇幅刊登和宣布中國(guó)科學(xué)家獨(dú)立繪制完成水稻基因組草圖序列(總數(shù)：4.6億)，是繼人類(lèi)基因組工作草圖(2001年春)之后完成測(cè)定的最大基因組。(2001年12月14日美、英等國(guó)科學(xué)家宣布繪制出擬南芥基因組的完整圖譜)秈稻基因組草圖2002年4月5日《Science》以14頁(yè)的篇幅刊登和宣布131材料：秈稻。完成單位：華大基因研究中心，中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等12個(gè)單位，2001年7月啟動(dòng)。水平：水稻基因組中的總基因數(shù)約為46022~55615個(gè)（接近人類(lèi)基因數(shù)的兩倍），工作框架圖序列已覆蓋水稻整個(gè)基因組92％以上的基因。方法：“鳥(niǎo)槍射擊法”，利用國(guó)產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級(jí)計(jì)算機(jī)(1000億次/秒)對(duì)隨機(jī)DNA碎片進(jìn)行排序和組裝，確定其在基因組的正確位置。計(jì)劃：功能基因分析和蛋白質(zhì)研究。材料：秈稻。完成單位：華大基因研究中心，中科院遺傳與發(fā)育水平1322002年11月21日《Nature》宣布中國(guó)科學(xué)家獨(dú)立繪制完成粳稻基因組第四號(hào)染色體精確測(cè)序圖，使我國(guó)對(duì)國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃貢獻(xiàn)率達(dá)到10%。

粳稻基因組草圖2002年11月21日《Nature》宣布中國(guó)科學(xué)家獨(dú)立繪制133材料：粳稻“日本晴”。完成單位：中科院國(guó)家基因研究中心等4家單位。整個(gè)國(guó)際水稻基因組計(jì)劃始于1998年，日本、美國(guó)、中國(guó)、法國(guó)等國(guó)家和地區(qū)參加。水平：第四號(hào)染色體中的總堿基數(shù)目為0.35億堿基對(duì)，覆蓋了該染色體全長(zhǎng)序列98％的區(qū)域，只剩下7個(gè)小空洞，測(cè)序堿基序列的精確度達(dá)到99.99%。完整測(cè)定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。計(jì)劃：對(duì)預(yù)測(cè)鑒定的4658個(gè)基因作進(jìn)一步分析、著絲粒功能等研究。材料：粳稻“日本晴”。完成單位：中科院國(guó)家基因研究中心等4家1342007年10月初，我國(guó)科學(xué)家對(duì)外宣布，他們已經(jīng)成功繪制完成第一個(gè)完整中國(guó)人基因組圖譜，又稱(chēng)“炎黃一號(hào)”，這也是第一個(gè)亞洲人全基因序列圖譜。

首個(gè)中國(guó)人基因組圖譜繪制2007年10月初，我國(guó)科學(xué)家對(duì)外宣布，他們已經(jīng)首個(gè)中國(guó)人135如果將這個(gè)基因組序列寫(xiě)成一本書(shū)，高度將與384米的深圳地王大廈相同。人類(lèi)基因組序列圖譜揭示了某個(gè)人的遺傳密碼，他的祖?zhèn)髅\(yùn)、以及未來(lái)可能發(fā)生的病變。如果將這個(gè)基因組序列寫(xiě)成一本書(shū)，高度將與384米的深圳地王大136在不久的將來(lái)，人類(lèi)將可能人手一份“基因身份”，里面記錄了只屬于你自己的遺傳信息。特別是某些遺傳缺陷會(huì)被早發(fā)現(xiàn)早治療，祖先的命運(yùn)因此而不必在你身上重演。目前，在美國(guó)為一個(gè)人進(jìn)行所有的基因檢測(cè)費(fèi)用高達(dá)2000萬(wàn)美元，在國(guó)內(nèi)的價(jià)格也達(dá)到200萬(wàn)人民幣。到2020年，在現(xiàn)有科學(xué)發(fā)展水平上為一個(gè)人繪制出基因圖，可能只需要1萬(wàn)；在不久的將來(lái)，人類(lèi)將可能人手一份“基因身份”，里面記錄了只屬137一、基因組圖譜的構(gòu)建小基因組物種常用鳥(niǎo)槍法測(cè)序法一、基因組圖譜的構(gòu)建小基因組物種常用鳥(niǎo)槍法測(cè)序法138解決方法：大基因組測(cè)序存在兩個(gè)問(wèn)題：片段數(shù)(n)龐大，片段間連接和裝配非常復(fù)雜；基因組中相同或相似的重復(fù)序列在連接和裝配時(shí)容易出錯(cuò)。大規(guī)模序列測(cè)定前，構(gòu)建基因組圖譜可作為序列測(cè)定中制定測(cè)序方案的依據(jù)，以便錨定測(cè)知的核酸序列在染色體上的位置。解決方法：大基因組測(cè)序存在兩個(gè)問(wèn)題：片段數(shù)(n)龐大，片段間139測(cè)序方法：克隆連續(xù)序列法(clonecontig)：將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0.1Mb-1Mb的大片段克隆到Y(jié)AC或BAC載體上分別測(cè)定單個(gè)克隆的序列再裝配連接成連續(xù)的DNA分子。定向鳥(niǎo)槍射擊法(directedshotgun)：以基因組圖譜中標(biāo)記為依據(jù)測(cè)序裝配和構(gòu)建不同DNA片段的序列。測(cè)序方法：克隆連續(xù)序列法(clonecontig)：將基140基因組圖譜根據(jù)構(gòu)建的途徑，可分為兩種：遺傳圖譜：根據(jù)遺傳性狀(如已知基因位點(diǎn)、功能未知的DNA標(biāo)記、可鑒別的表型性狀)的分離比例將其定位在基因組中，構(gòu)建相應(yīng)的連鎖圖譜。物理圖譜：描繪DNA上可以識(shí)別的標(biāo)記的位置和相互之間距離(以堿基對(duì)的數(shù)目為衡量單位)的圖譜。基因組圖譜根據(jù)構(gòu)建的途徑，可分為兩種：遺傳圖譜：根據(jù)遺傳性狀141㈠遺傳圖譜的構(gòu)建：1.圖譜標(biāo)記：凡是位于染色體上易于檢測(cè)識(shí)別、在不同個(gè)體之間存在差異（多態(tài)性），而且可以穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)，都可以作為遺傳作圖的標(biāo)記。缺點(diǎn)：基因數(shù)目有限、所構(gòu)建的遺傳圖譜不詳細(xì)、標(biāo)記間的遺傳距離較大。⑴.基因標(biāo)記：基因控制性狀的表現(xiàn)，所以也就是利用可以鑒別的形態(tài)、生化等表型性狀作標(biāo)記，㈠遺傳圖譜的構(gòu)建：1.圖譜標(biāo)記：凡是位于染色體上易于檢測(cè)識(shí)142⑵.DNA標(biāo)記：每種生物DNA具有穩(wěn)定性，∴DNA本身可作為構(gòu)建遺傳圖譜的標(biāo)記；主要有以下3種類(lèi)型：①限制性?xún)?nèi)切酶多型性②簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多型性③單核苷酸多型性⑵.DNA標(biāo)記：每種生物DNA具有穩(wěn)定性，∴DNA本身可作1432、遺傳圖譜的構(gòu)建：⑴遺傳作圖的遺傳學(xué)原理：遺傳圖譜的繪制主要依據(jù)是經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳學(xué)的連鎖和交換規(guī)律。通過(guò)重組率確定遺傳標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置，從而繪制遺傳圖譜。⑵不同模式生物的連鎖分析：有性雜交實(shí)驗(yàn)的連鎖分析及系譜分析轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)及結(jié)合等2、遺傳圖譜的構(gòu)建：⑴遺傳作圖的遺傳學(xué)原理：遺傳圖譜的繪制144(二)物理圖譜的構(gòu)建：1.構(gòu)建物理圖譜的原因：⑴遺傳圖譜的分辯率有限：⑵遺傳圖譜的精確性不高：(二)物理圖譜的構(gòu)建：1.構(gòu)建物理圖譜的原因：⑴遺傳圖1452.物理圖譜的構(gòu)建：⑴

限制性酶圖譜：利用限制性?xún)?nèi)切酶繪制圖譜，對(duì)于DNA分子長(zhǎng)度<50Kb的片段，一般沒(méi)有什么困難。(46=4094bp)而對(duì)于>50Kb的DNA分子，可選用稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶酶切DNA。(48=65536bp)2.物理圖譜的構(gòu)建：⑴限制性酶圖譜：利用限制性?xún)?nèi)切酶繪制146⑵熒光原位雜交:是另一物理圖譜構(gòu)建方法通過(guò)熒光標(biāo)記的探針與DNA分子雜交，使染色體上的雜交信號(hào)（位置就是探針DNA在染色體上的圖譜位點(diǎn)）在顯微鏡下可直接觀察。⑶序列標(biāo)簽位點(diǎn)：利用某一已知序列為標(biāo)簽的位點(diǎn)(sequencetaggedsites，STS)作探針，與基因組DNA雜交，繪制物理圖譜。⑵熒光原位雜交:是另一物理圖譜構(gòu)建方法通過(guò)熒光標(biāo)記的探⑶1473人類(lèi)基因組物理圖譜:

人類(lèi)基因組序列開(kāi)始測(cè)定時(shí)，已有45萬(wàn)個(gè)EST，其中有一些重復(fù)序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析篩選后得到49625個(gè)，各代表一個(gè)基因。再?gòu)闹泻Y選出3萬(wàn)個(gè)EST、二個(gè)輻射雜交系庫(kù)（分別有83和93個(gè)細(xì)胞株）、一個(gè)有32000個(gè)克隆的YAC文庫(kù)用于構(gòu)建圖譜。結(jié)果構(gòu)建的物理圖譜的密度為每個(gè)標(biāo)記183kb，EST分布結(jié)果表明基因在染色體上的排列是不均勻的。將上述遺傳圖譜及其它物理圖譜整合構(gòu)成更加完整的人類(lèi)其因組圖譜，作為基因組序列測(cè)定的框架和分析的依據(jù)。3人類(lèi)基因組物理圖譜:人類(lèi)基因組序列開(kāi)始測(cè)定時(shí)，已148

二、基因組圖譜的應(yīng)用基因組圖譜中除了構(gòu)建遺傳圖譜和物理圖譜外，還可進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)記類(lèi)型細(xì)分為不同的稱(chēng)謂。如RFLP圖譜、RAPD圖譜、AFLP圖譜等，目前已在擬南芥、番茄、水稻等30多種植物中構(gòu)建了基因圖譜?；驁D譜的構(gòu)建除了進(jìn)行測(cè)序之外，還有許多的用途。二、基因組圖譜的應(yīng)用基因組圖譜中除了構(gòu)建遺傳圖譜和物理圖1491.基因定位：

借助基因組圖譜，可使基因定位的精度、深度、廣度等方面有極大的提高。已陸續(xù)在各種農(nóng)作物上定位了許多重要農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀的基因，在復(fù)雜數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitativetraitloci，QTL)

定位分析方面，也取得了很大進(jìn)展。1.基因定位：借助基因組圖譜，可使基因定位的精度、深1502.基因組比較分析：

已經(jīng)在禾本科玉米、水稻、高梁、大麥、小麥和黑麥，茄科的蕃茄、胡椒、馬鈴薯，十字花科擬南芥、甘藍(lán)、花椰菜、油菜等做了遺傳圖譜比較分析，從分子水平了解物種間同源性，研究基因組的進(jìn)化和染色體的演變。3.標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselectionMAS)：

飽和基因組圖譜可用來(lái)確定與任何一個(gè)目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記根據(jù)圖譜間接選擇目的基因，可降低連鎖累贅，加速目的基因的轉(zhuǎn)移與利用，提高回交育種的效率。2.基因組比較分析：已經(jīng)在禾本科玉米、水稻、高梁、大1514.基因的克隆與分離：

根據(jù)飽和的基因組圖譜，可以找到一個(gè)與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，作為染色體步行(chromosomewalking)起始點(diǎn)進(jìn)行基因的克隆和分離，此法亦稱(chēng)圖位克隆法(map-basedcloning)，為基因產(chǎn)物未知的基因克隆提供了捷徑。4.基因的克隆與分離：根據(jù)飽和的基因組圖譜，可以找到152

是在完成基因組圖譜構(gòu)建以及全部序列測(cè)定的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究全基因組的基因功能、基因之間相互關(guān)系和調(diào)控機(jī)制為主要內(nèi)容的學(xué)科。三、后基因組學(xué)(post-genomics)是在完成基因組圖譜構(gòu)建以及全部序列測(cè)定的基礎(chǔ)上進(jìn)一153自從1996年酵母菌基因組全序列測(cè)定以來(lái)，全世界已有1000多個(gè)實(shí)驗(yàn)室、5000多名科學(xué)家從事酵母菌后基因組學(xué)的研究，共發(fā)表論文7000多篇，鑒定1060個(gè)新基因的功能，但仍然還有約1600個(gè)閱讀框架的功能不清楚。后基因組學(xué)主要技術(shù)：

DNA微列陣技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)；酵母菌雙雜交系統(tǒng)；生物信息學(xué)等技術(shù)。自從1996年酵母菌基因組全序列測(cè)定以來(lái)，全世界已后基因組學(xué)1541DNA微列陣(DNAmicroarrays)：是利用DNA芯片技術(shù)同時(shí)進(jìn)行大量分子雜交，分析比較不同組織或器官的基因表達(dá)水平，篩選突變基因，從核酸水平分析基因表達(dá)模式。1DNA微列陣(DNAmicroarrays)：是利用D1552蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)：是從蛋白質(zhì)水平來(lái)研究基因組的基因表達(dá)分析基因組的蛋白質(zhì)類(lèi)型、數(shù)量、空間結(jié)構(gòu)變異以及相互作用的機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)比基因組學(xué)更為復(fù)雜.2蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)：是從蛋白質(zhì)水平來(lái)研究156真核生物的基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子控制，轉(zhuǎn)錄因子需與啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合并激活RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合及激活轉(zhuǎn)錄兩功能，分別由不同區(qū)域完成，而且將這兩部分分割成兩個(gè)片段后仍由互作能裝配成一個(gè)完全有功能的轉(zhuǎn)錄因子?；谶@一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出酵母雙雜交系統(tǒng)。是利用酵母菌同一個(gè)細(xì)胞中共同表達(dá)不同蛋白質(zhì)，以鑒定蛋白質(zhì)之間互作的一種分析方法。3酵母菌雙雜交系統(tǒng)(twohybrid-systems)：真核生物的基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子控制，轉(zhuǎn)錄因子需與啟動(dòng)子區(qū)域的D1574生物信息學(xué)(bioinformatics)：是一種用計(jì)算機(jī)貯存原始資料，分析生物信息，將DNA芯片以及蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果轉(zhuǎn)變成為可讀的遺傳學(xué)信息的學(xué)科。生物信息學(xué)是現(xiàn)代生物技術(shù)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的結(jié)合，收集、加工和分析生物資料和信息。4生物信息學(xué)(bioinformatics)：是一種用計(jì)算158生物信息學(xué)是在未來(lái)生命科學(xué)中起關(guān)鍵作用的學(xué)科之一。應(yīng)用生物信息學(xué)可以將來(lái)不同的基因組理論和應(yīng)用綜合并標(biāo)準(zhǔn)化，利用大量的生物信息資料來(lái)了解遺傳網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、信號(hào)傳遞及相互關(guān)系，計(jì)算機(jī)還可進(jìn)行一些生物模擬研究。利用生物信息學(xué)能夠分析從微生物、植物以及人類(lèi)基因組序列測(cè)定產(chǎn)生的大量資料闡明遺傳信息。生物信息學(xué)是在未來(lái)生命科學(xué)中起關(guān)鍵作用的應(yīng)用生物信息學(xué)可以將159第09章基因工程和基因組學(xué)課件160199619971998199920002001200220062007199619971998199920002001200220161第九章基因工程和基因組學(xué)第九章基因工程1621971年，Smith等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時(shí)代的開(kāi)始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來(lái)

得到新的DNA分子。1971年，Smith等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶，酶切1631973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Cohen教授及其同事把抗四環(huán)素基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA后，組成一個(gè)重組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一個(gè)重組DNA能在大腸桿菌中復(fù)制,并具有抗四環(huán)素遺傳表型。StanleyN.Cohen1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Cohen教授及其同事把抗1641974年,Cohen教授和加州大學(xué)的Boyer教授，將非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因得到表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，經(jīng)DNA重組后的外源基因可在宿主體內(nèi)成功表達(dá)。HerbertW.Boyer1974年,Cohen教授和加州大學(xué)的Boyer教授，將非洲1651982年，美國(guó)食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場(chǎng)。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。1982年，美國(guó)食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基1985年，轉(zhuǎn)166以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的2550萬(wàn)畝發(fā)展到2009年的20億畝，14年間增長(zhǎng)了79倍。19961997199819992000200120022006200720082009以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1167廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程及酶工程等。狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術(shù))。

一、基因工程概述:第一節(jié)基因工程廣義遺傳工程包括:狹義遺傳工程是指:一、基因工程概述:第一168１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式,按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，借助于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去，使后者定向獲得新遺傳性狀的一門(mén)技術(shù)。基因工程技術(shù)的建立，使所有實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的變革。基因工程是采用分子生物學(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來(lái)的綜合技術(shù)。

１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式,按照預(yù)先169切接轉(zhuǎn)增檢2．基因工程操作過(guò)程：切接轉(zhuǎn)增檢2．基因工程操作過(guò)程：1703．內(nèi)容：①?gòu)募?xì)胞和組織中分離DNA；②限制性?xún)?nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③

將酶切DNA分子與載體DNA連接構(gòu)建能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的重組DNA分子；④

把重組DNA分子引入宿主受體細(xì)胞復(fù)制；⑤

重組DNA隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞建立無(wú)性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個(gè)體；⑥

從宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子；⑦

使外源基因在受體細(xì)胞中正常表達(dá)，翻譯成蛋白質(zhì)并分離、鑒定基因產(chǎn)物。目的基因載體轉(zhuǎn)化與鑒定內(nèi)切酶重組DNA表達(dá)3．內(nèi)容：①?gòu)募?xì)胞和組織中分離DNA；②限制性?xún)?nèi)切酶酶切171一般而言，一個(gè)基因是編碼一條多肽鏈的一個(gè)DNA片段，包括啟動(dòng)子、終止子及內(nèi)含子等。在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細(xì)胞中最難分析的大分子。DNA重組技術(shù)發(fā)展成功之后，DNA已成為細(xì)胞中最易操作分析的大分子。二、基因的分離與鑒定利用這一技術(shù)，可從一個(gè)含有10萬(wàn)個(gè)基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個(gè)目的基因。一般而言，一個(gè)基因是編碼一條多肽鏈的在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)172㈠從基因庫(kù)中分離基因：1.構(gòu)建基因庫(kù)（library）基因庫(kù)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。根據(jù)克隆核酸序列、來(lái)源，基因庫(kù)可分為：核基因庫(kù)、染色體庫(kù)、cDNA庫(kù)、線(xiàn)粒體庫(kù)等。㈠從基因庫(kù)中分離基因：1.構(gòu)建基因庫(kù)（library）基因173①核基因庫(kù)：核基因庫(kù)(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。理想的核基因庫(kù)應(yīng)能包括全部基因組序列。①核基因庫(kù)：核基因庫(kù)(genomiclibrary)：174構(gòu)建文庫(kù)可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，收集所有菌落。噬菌體或(柯斯質(zhì)粒)載體：重組DNA包裝進(jìn)噬菌體，感染細(xì)菌，收集噬菌斑。BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體，導(dǎo)入相應(yīng)宿主細(xì)胞，收集所有細(xì)胞，即為基因庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)可采用不同的載體：質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞175第09章基因工程和基因組學(xué)課件176第09章基因工程和基因組學(xué)課件177②染色體基因庫(kù)：將基因組的一部分如一條染色體用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)可選擇特異基因以及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織。②染色體基因庫(kù)：將基因組的一部分如一條染色體用來(lái)構(gòu)178果蠅的多線(xiàn)染色體中，對(duì)染色體進(jìn)行微切割，構(gòu)建染色體區(qū)段基因文庫(kù)。如對(duì)X染色體上多線(xiàn)染色體帶的分析。果蠅的多線(xiàn)染色體中，對(duì)染色體進(jìn)行微切割，179人類(lèi)基因組項(xiàng)目研究中，利用流動(dòng)細(xì)胞分離(flowcytometry)技術(shù)將人類(lèi)染色體分開(kāi)，用于構(gòu)建單個(gè)染色體基因庫(kù)，大大加速了人類(lèi)基因組作圖和分析。流式細(xì)胞分離原理人類(lèi)基因組項(xiàng)目研究中，流式細(xì)胞分離原理180酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldgelelectro–phoresis,PFGE)，將酵母菌16根染色體據(jù)其分子量大小分開(kāi)后，用于構(gòu)建染色體庫(kù)，在基因組分析中發(fā)揮作用。酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldg181③cDNA庫(kù)：以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因庫(kù)。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T為引物與多聚A互補(bǔ)配對(duì)，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，即可獲得cDNA第一鏈。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補(bǔ)齊后以帶有限制性酶切點(diǎn)的人工接頭連接酶切后與載體(通常是噬菌體)連接制備cDNA庫(kù)。③cDNA庫(kù)：以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA182mRNA1.cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPsmRNA1.cDNA第一鏈的合成5‘ppp’5GGAA1832.cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’2.cDNA第二鏈的合成煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈184DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈185dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

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AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

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AAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp